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1、固定化固定化固定化固定化酶载酶载体体体体- -壳聚糖壳聚糖壳聚糖壳聚糖学 号 : 81050636 报 告 人 : 胡 探 宇研讨背景 1.酶是一种蛋白质，对环境变化的耐受力极低,稳定性差，大大限制了它的大规模运用. 2.在催化终了后难以回收。 3.经过固定化技术对酶加以改造固定。但至今，还没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶，特定的酶要根据详细的运用目的选择特定的固定化方法。 研讨目的o固定化酶具有游离酶无法比较的优势,它对温度、pH值、溶剂极性等具有极高的耐受性,并能反复回收运用。顺应工业化消费.o壳聚糖作为酶固定化载体时能针对不同酶制成不同形状,酶固定化后耐酸碱性强,耐热性好, 活
2、性不受金属离子干扰;加上它们的环保性,还可减轻环境污染.回想历史1953年,初次提出酶固定化方法. 20世纪60年代,酶的固定化技术兴起.1969年,日本首先研制胜利固定化酶技术。固定化酶的概念与性质酶固定化(Immobilization of enzymes)是指用固体资料将酶束缚或限制于一定区域内,使其仍能进展本身所特有的催化反响、并可回收及反复运用的一类技术。固定化酶普通是呈膜状、颗粒状或粉状的酶制剂，它在一定的空间范围内运用，产品的纯度高，可反复运用.固定化酶同自在酶相比，具有以下优点：其一是稳定性高,对环境的变化抵抗力强；其二是酶的回收简单,可反复运用；其三是产物纯度高；其四是消费可
3、延续化和自动化；其五是设备小型化以及可节约能源等。使酶的综合利用,酶反响的快速终结,酶消费线的延续运转,以及多种生物反响器的设计等成为现实。固定化的主要方式 酶能以多种方法固定于载体上,大致可分为: (1)共价结合法; (2) 吸附法; (3)交联法; (4)包埋法。壳 聚 糖 壳聚糖壳聚糖(chitosan)(chitosan)又名氨基葡萄又名氨基葡萄糖糖, ,是由是由2-2-氨基氨基-2-2-脱氧脱氧-D-D-葡萄葡萄糖以糖以(14)(14)糖苷糖苷键衔键衔接而成的接而成的直直链链多糖多糖, ,它是目前它是目前发现发现的独一的独一的一种天然的碱性多糖。用碱的一种天然的碱性多糖。用碱脱去甲壳
4、素脱去甲壳素2 2位碳上的乙位碳上的乙酰酰基可基可得到壳聚糖。得到壳聚糖。 壳聚糖分子壳聚糖分子链链上的游离氨基能上的游离氨基能从酸性溶液中从酸性溶液中结结合合氢氢离子离子, ,成成为为带带正正电电荷的聚荷的聚电电解解质质, ,破坏了分破坏了分子子间间和分子内的和分子内的氢键氢键, ,从而可溶从而可溶于一些低于一些低浓浓度无机酸和有机酸。度无机酸和有机酸。另外壳聚糖分子构造中含另外壳聚糖分子构造中含羟羟基基和氨基和氨基, ,使其易于使其易于进进展展酰酰化、化、酯酯化、化、醚醚化、化、烷烷基化、氧化、螯基化、氧化、螯合等化学修合等化学修饰饰和改性。和改性。 壳聚糖及其衍生物壳聚糖及其衍生物对对人
5、体无毒人体无毒, ,具有良好的生物相容性和生物具有良好的生物相容性和生物可降解性可降解性. .壳聚糖作为酶固定化载体优良性能甲壳素甲壳素/ /壳聚糖壳聚糖, ,能以低廉的本钱从甲壳类动物的硬壳中获能以低廉的本钱从甲壳类动物的硬壳中获得得, ,也可从海产品加工业的废物中获得。也可从海产品加工业的废物中获得。壳聚糖分子中含丰富羟基和氨基使其易于进展化学反响而壳聚糖分子中含丰富羟基和氨基使其易于进展化学反响而赋与其许多独特的性能赋与其许多独特的性能, ,特别是其丰富的氨基与各种蛋白特别是其丰富的氨基与各种蛋白质的亲和力非常高质的亲和力非常高; ;大多聚合物载体中含残存单体易使酶大多聚合物载体中含残存
6、单体易使酶失活失活, ,而壳聚糖没有残存的单体。而壳聚糖没有残存的单体。酶固定化的胜利决议于酶与固定化载体的良好结合而不破酶固定化的胜利决议于酶与固定化载体的良好结合而不破坏酶的生物催化特性。固定化载体普通应具有良好的化学坏酶的生物催化特性。固定化载体普通应具有良好的化学稳定性和机械刚性、容易再生等根本性质稳定性和机械刚性、容易再生等根本性质, ,而且必需能吸而且必需能吸附蛋白质附蛋白质, ,有能与酶外表基团相作用的功能团有能与酶外表基团相作用的功能团, ,具亲水性和具亲水性和良好的生物相容性良好的生物相容性, ,且可根据酶的特性做定向化学修饰。且可根据酶的特性做定向化学修饰。壳聚糖具备上述全
7、部性质壳聚糖具备上述全部性质. .壳聚糖与其它载体的酶和细胞固定化性能比较壳聚糖与其它载体的酶和细胞固定化性能比较多孔壳聚糖微球制多孔壳聚糖微球制备及形状察看及形状察看 1 1 实验实验方法方法方法方法 1) 1)壳聚糖根本性壳聚糖根本性壳聚糖根本性壳聚糖根本性质测质测定定定定 2) 2) 壳聚糖微球的制壳聚糖微球的制壳聚糖微球的制壳聚糖微球的制备备 3) 3)壳聚糖微球形状及构造察看壳聚糖微球形状及构造察看壳聚糖微球形状及构造察看壳聚糖微球形状及构造察看 2 2结结果与果与果与果与讨论讨论 1) 1)壳聚糖根本性壳聚糖根本性壳聚糖根本性壳聚糖根本性质测质测定定定定结结果果果果 2) 2)壳聚
8、糖分子量壳聚糖分子量壳聚糖分子量壳聚糖分子量对对壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响 3) 3)成球条件成球条件成球条件成球条件对对壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响 1 1NaOHNaOH浓浓度度度度对对壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响 2 2壳聚糖壳聚糖壳聚糖壳聚糖浓浓度度度度对对壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响 3 3凝凝凝凝结结液中液中液中液中处处置置置置时间对时间对壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响 4 4壳聚糖微球内部构造壳聚糖微球
9、内部构造壳聚糖微球内部构造壳聚糖微球内部构造 3 3 结结论论 前前 言言 甲壳素和壳聚糖是天然的聚氨基葡萄糖甲壳素和壳聚糖是天然的聚氨基葡萄糖, ,呈现出疏松的呈现出疏松的网状构造网状构造, ,在大多数溶剂中是不能溶解的在大多数溶剂中是不能溶解的. .壳聚糖凝胶壳聚糖凝胶构成的微球具网状构造构成的微球具网状构造, ,机械性能良好机械性能良好, ,化学性质稳定化学性质稳定, ,耐热性好耐热性好, ,特别是其分子中存在的大量氨基使它能在特别是其分子中存在的大量氨基使它能在pH6. 5pH6. 5以下的酸性溶液中溶解以下的酸性溶液中溶解, ,既易与酶共价结合既易与酶共价结合, ,又又可络合金属离子
10、可络合金属离子, ,使酶少受金属离子的抑制使酶少受金属离子的抑制, ,同时它又同时它又易于经过接枝而改性。易于经过接枝而改性。制制备外表疏松多孔的壳聚糖微球外表疏松多孔的壳聚糖微球 讨论讨论影响壳聚糖成球的要素影响壳聚糖成球的要素, ,制制备备多孔的壳聚糖微球以多孔的壳聚糖微球以添加微球的外表添加微球的外表积积, ,添加添加酶酶分子与壳聚糖分子的接触分子与壳聚糖分子的接触时时机机, ,有利于壳聚糖吸附有利于壳聚糖吸附酶酶分子及与分子及与酶酶分子交分子交联联。 1 1 壳聚糖根本性壳聚糖根本性质测质测定定 2 2 壳聚糖微球的制壳聚糖微球的制备备 1) 1)不同分子量壳聚糖微球的制不同分子量壳聚
11、糖微球的制备备 2) 2)不同不同NaOHNaOH浓浓度下壳聚糖微球的制度下壳聚糖微球的制备备 3) 3)不同壳聚糖不同壳聚糖浓浓度的微球的制度的微球的制备备 4) 4)不同凝不同凝结时间结时间的壳聚糖微球的制的壳聚糖微球的制备备 3 3 壳聚糖微球形状及构造察看壳聚糖微球形状及构造察看 壳聚糖根本性质测定结果壳聚糖分子量对壳聚糖成球的影响 分子量较小的C3制备的微球外表具有明显的疏松多孔构造,而分子量较大的C1和C2制备的微球外表构造致密,孔少且小。这能够是由于随着分子量的添加,壳聚糖分子变长,微球中壳聚糖分子之间相互结合更加严密,导致其外表构造致密,多孔性降低。 壳聚糖微球的多孔构造及强度
12、是影响其作为固定化酶载体的主要要素,分子量较小的C3所成的微球虽然强度不高,但其外表疏松多孔,而且可以经过增大其浓度或用戊二醛交联等方法来添加其强度。所以分子量较小的C3作为制备多孔壳聚糖微球的资料较好。1NaOH浓度对壳聚糖成球的影响NaOH浓度对壳聚糖微球的形状和外表构造具有较大影响: 2. 0%的NaOH溶液所成微球外表形状不规那么,球之间容易相互粘结;外表疏松多孔构造不明显 3. 0%的NaOH溶液中所成微球整体形状规那么,强度较好;外表出现明显的多孔构造。这主要是由于壳聚糖在酸性条件下溶解、碱性条件下沉淀.在较低浓度的NaOH溶液中,壳聚糖微球在还未完全沉淀成球以前就曾经塌陷,壳聚糖
13、分子堆砌在一同,导致所成微球形状不好、强度较差,外表厚度不均一,凸凹不平,不能构成良好的疏松多孔构造;当NaOH浓度添加时,壳聚糖微球迅速成形,容易构成厚度均一、形状较好、强度高的微球,此时微球外表被撑起,呈现出壳聚糖本身的疏松多孔构造,因此采用3. 0%的NaOH浓度较适宜。 2壳聚糖浓度对壳聚糖成球的影响v实验发现:壳聚糖浓度为2. 0%时,虽然微球外表疏松多孔,但是所成微球形状不好,有细微拖尾,v当壳聚糖浓度增大到3. 0%时,球的强度逐渐增大,但拖尾较严重,球外表比较致密,而且孔也不大,不利于酶的固定化。这是由于随着壳聚糖浓度的添加,壳聚糖分子堆积更加严密,壳聚糖厚度添加,从而导致壳聚
14、糖微球外表孔隙减少。壳聚糖微球外表疏松多孔性与其外表强度是负相关的,v综合思索其多孔性及强度,采用2. 5%的壳聚糖浓度较适宜。3凝凝结液中液中处置置时间对壳聚糖成球的影响壳聚糖成球的影响 实验结果阐明:将壳聚糖微球在3. 0%的NaOH溶液中分别放置3h、5h、7h所成壳聚糖微球的外表构造、形状均无明显差别,因此将壳聚糖滴加到凝结液中处置3h是较适宜的。这能够是由于超越3h以后,壳聚糖胶体微滴曾经在凝结液中凝结并稳定成形,壳聚糖微球变的不透明,再延伸其在凝结液中的处置时间对成球效果意义不大。实验发现:以上要素对壳聚糖内部构造影响不大,均如y右图所示,右图是在本实验最正确条件下所成壳聚糖微球的
15、外表构造的SEM照片,最正确条件为:2. 5%的C3、乙酸乙酯参与比例为120、3. 0%NaOH、凝结时间为3h。这能够是外部环境要素很难作用于壳聚糖微球内部,使得壳聚糖微球内部坚持了壳聚糖本身所具有的疏松多孔构造的缘故。由此可见本实验中所制备壳聚糖微球内部构造疏松多孔,较适宜作为固定化酶的载体。 4壳聚糖微球内部构造结论:l当采用分子量较小(如44. 84万)的壳聚糖、2. 5%的壳聚糖浓度、3. 0%的NaOH凝结液中处置3h时,能制备疏松多孔构造和较好形状的壳聚糖微球,为制备壳聚糖微球作为固定化酶的载体提供了实际根据。l目前关于影响壳聚糖微球多孔性的研讨较少,关于采用不同分子量的壳聚糖
16、混合物及其它制备疏松多孔壳聚糖微球方法均还有待尝试。壳聚糖固定化酶的制备壳聚糖在进展酶固定以前,普通需进展预处置:先用戊二醛作为交联剂,Span-80作为乳化剂,控制壳聚糖与戊二醛的比例以及交联时间等条件,用微乳法制备壳聚糖微球再以壳聚糖微球作为载体固定所需酶类壳聚固定化酶的制备方法主要有物理吸附法和化学交联法两种:物理吸附法就是控制溶液pH等条件,让壳聚糖和酶在一定温度下充分振荡一段时间,使酶经过物理吸附作用固定在壳聚糖上。化学交联法即是先借助于一些方法,在载体上引进一活泼基团,然后,此活泼基团再与酶分子上的某一基团反响,构成共价键交。 应 用 1医药领域 (1)固定化脲酶 (2)固定化胰蛋
17、白酶 (3)固定化磷酸酯酶 (4)固定化葡聚糖酶 (5)固定化凝血酶 (6)固定化脂肪酶 2环保领域 3生物传感器 壳聚糖作为酶固定化载体已得到广泛运用,但人们对壳聚糖及其衍生物作为酶固定化载体的研讨并没有停顿,以期能寻觅到更好的固定化方法、更好的交联试剂,使固定化反响条件更加温暖,所制得的固定化酶的活性坚持更高。在不久的未来,以壳聚糖及其衍生物为载体的酶固定化方法必将得到更大开展。我国自主开发胜利固定化酶技术 v “十五国家科技攻关方案“纳米资料技术及运用开发延续工程纳米构造固定化酶组装技术的开发，日前在京经过了中国石油和化工协会、中国钢协粉末冶金协会共同组织的专家验收。该成果可望使我国摆脱
18、依赖进口载体消费固定化青霉素酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化酶技术提升和抗生素产业可继续开展。 v华东理工大学郭杨龙教授、卢冠忠教授与北京化工大学何静教授等开发出具有自主知识产权的低本钱的纳米构造高分子聚合物载体合成新技术，并建成每年6吨的固定化青霉素酰化酶催化剂消费安装。所消费的纳米构造固定化青霉素酰化酶催化剂运用于年产500吨6-氨基青霉烷酸(6-APA)消费安装上，固定化青霉素酰化酶的表观活性达775单位/克，本钱比进口载体降低30%以上。研讨人员还运用仿生固定化酶概念将猪胰脂肪酶分子固定于纳米构造内孔外表，针对不同尺寸以孔口接枝或接枝物种原位聚合等方式进展孔口尺寸改造，建成年产10吨纳米构造仿生固定化脂肪酶催化剂消费安装。产品用于500吨/年生物柴油消费安装上，植物油脂交换固定假丝酵母酶的活性提高了5倍，转化率达92%。据引见，该工程共恳求了包括1项国际发明专利在内的9项发明专利，构成了较完好的自主知识产权体系v
