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1、细菌鉴定之生化反应南医大三附院检验科 江培涛1常用试验n碳水化合物的代谢试验n蛋白质和氨基酸的代谢试验n碳源和氮源利用试验n各种酶类试验n抑菌试验2一 碳水化合物的代谢试验n1 糖(醇、苷)类发酵试验原理:细菌含有发酵糖(醇、苷)的酶分解糖类产酸、产气、或仅产酸 培养基:含有0.5%1%的糖(醇、苷)的液体、半固体、固体、或 微量生化管方法: 纯菌种接种培养基,要求的温度,数小时至两周,微量管注意保持湿润,以免干燥结果:能分解糖(醇、苷)类产酸时,培养基中的指示剂呈酸性反应 若能产气时,培养基可出现开裂气泡等现象意义:肠杆菌科尤为重要32 氧化-发酵试验(O/F)n原理:细菌分解葡萄糖的过程中
2、,必须有分子氧参加的,称为氧化型;可以进行无氧降解的,称为发酵型;不分解葡萄糖的称为产碱型n培养基:HL二氏培养基n方法;待测菌同时接种两只HL培养基,其中一只滴加无菌的液体石蜡,高度不少于1cm,35培养48h或更长n结果:两只均无变化为产碱型;两只均产酸为发酵型;仅不加石蜡的产酸为氧化型n意义:肠杆菌科与非发酵菌的鉴别;葡萄球菌与微球菌的鉴别,前者为发酵型,后者为氧化型43 ONPG(半乳糖苷酶试验)n原理:有的细菌可以产生半乳糖苷酶,分解邻-硝基酚- 半乳糖苷生成黄色的邻-硝基酚n方法:从KIA上取菌,于0.25ML无菌生理盐水中制菌悬液,加甲苯一滴,使酶释放。37 水浴5min,加0.
3、25mlONPG试剂,水浴20min-3h观察结果n结果:呈现黄色为阳性,一般20-30min内显色n意义:迅速及迟缓发酵乳糖的细菌为阳性,不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定n注意:该试验不一定与分解乳糖相一致,决定于细菌产生的酶及其活性54七叶苷水解试验n原理:有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素,后者与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应生成黑色化合物,使培养基呈黑色n方法:将待测菌接种于七叶苷培养基,培养后观察结果n结果:培养基变黑为阳性,不变为阴性n意义:D群链球菌与其他链球菌的区别,前者为阳性;肺炎克雷伯、阴沟肠杆菌多阳性65V-P试验n原理:细菌分解
4、葡萄糖产生丙酮酸,后者脱羧产生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性环境中被氧化为二乙酰,进而与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍基作用,生成红色化合物,即为V-P试验阳性。奈酚可加速此反应n培养基:葡萄糖蛋白胨水n方法:待测菌接种于培养基,35 48h,加入甲液(6%奈酚酒精溶液)和乙液(40 %KOH溶液)n结果:20min内出现红色为阳性,如无红色,且于35 4h 后仍如故即为阴性n意义:本试验常与甲基红一起试验,前者阳性则后者多阴性76甲基红试验n原理:细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,后者进一步生成甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基的PH降至4.5以下,加入甲基红试剂后显红色即阳性。若产酸量少,或进一步转化为
5、其他物质,则培养基的PH仍在6.2以上,加入甲基红试剂后显黄色,为阴性n培养基:葡萄糖蛋白胨水n方法:待测菌接种于培养基,2-4天后,加入甲基红试剂,观察结果n结果:呈现红色为阳性,橘红色为弱阳性,黄色为阴性n意义:大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌、等为阳性;肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性87 葡萄糖酸盐试验n原理:某些细菌能氧化葡萄糖酸盐作为唯一碳源,生成2-酮基葡萄糖酸盐。加入班氏试剂,于沸水煮沸10分钟,出现砖红色沉淀,表明有葡萄糖酸盐的存在n培养基:2-酮基葡萄糖酸盐肉汤n方法:待测菌接种于培养基,35 培养18-24h,于其中加入0.3ml浓缩班氏试剂,然后沸水中煮沸10分钟,出现砖
6、红色沉淀表明有葡萄糖酸盐的存在n意义:用于肠杆菌科分类9二 蛋白质和氨基酸的代谢试验1 明胶液化试验原理:细菌产生明胶酶,能使明胶分解为氨基酸,从而失去凝固力,半固体变为液体方法:待测菌接种于明胶培养基,22 培养7天。若用35 孵育,因明胶在此温度下自行液化,故在观察前先置4 冰箱30min再观察结果:培养基呈液化状态为阳性意义:多数假单胞菌能液化明胶,肠杆菌科细菌如:沙雷菌、变形杆菌、 阴沟杆菌等可液化明胶102 吲哚(叮基质)试验 n原理:某些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚,当加入吲哚试剂-柯氏试剂(对二氨基苯甲醛)后则形成红色的玫瑰吲哚n培养基:蛋白胨水n方法:待测
7、菌接种于培养基,35 培养24-48小时,沿试管壁缓慢加入吲哚试剂n结果:于两者接触面出现红色为阳性,无色为阴性n意义:肠杆菌科细菌的鉴定;大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性n试剂:柯氏试剂(对二氨基苯甲醛)与欧氏试剂的区别:前者含戊醇,后者含酒精,都含浓盐酸,前者主要成分为后者10倍,后者灵敏度更高113硫化氢试验n原理:某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸,产生硫化氢,后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。n培养基:醋酸铅培养基n方法:待测菌接种于醋酸铅培养基,35 培养24-48小时观察结果n结果:培养基变黑为阳性,不变为阴性n意义:沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、腐
8、败假单胞菌为阳性124 尿素分解试验n原理:某些细菌具有尿素分解酶,能分解尿素产生大量的氨,使培养基呈碱性n培养基:尿素培养基n方法:待测菌接种于培养基,35 培养18-24小时观察结果n结果:培养基呈碱性,使酚红指示剂变红为阳性,不变为阴性n意义:变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维登氏、克雷伯氏为阳性135 苯丙氨酸脱氨酶(TDA)试验n原理:某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶,使苯丙氨酸脱去氨基形成苯丙酮酸,加入三氯化铁试剂后产生绿色反应n培养基:苯丙氨酸琼脂培养基n方法:待测菌接种于培养基,35 培养18-24小时,加10%三氯化铁试剂3-4滴,观察结果n结果:肠杆菌科变形杆菌、普罗维登氏菌、摩根氏
9、菌阳性146 氨基酸脱羧酶试验n原理:具有氨基酸脱羧酶的细菌,能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳,使培养基变碱,使指示剂显色n培养基:氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基n方法:待测菌接种于培养基,并加入无菌液体石蜡,35 培养18-24小时观察结果n结果:对照管应呈黄色,测定管呈紫色,(指示剂为溴甲酚紫)测定管呈黄色为阴性;若对照管呈紫色则试验无意义n意义:肠杆菌科细菌的鉴定15三 碳源和氮源利用试验1枸橼酸盐利用试验2原理:某些细菌能以枸橼酸盐为唯一碳源,可在枸橼酸盐培养基上生长,分解枸橼酸盐,使培养基变碱3培养基:枸橼酸盐培养基4方法:待测菌接种于培养基35 培养18-24小时,观察结
10、果5结果:培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性,不变色为阴性6意义:克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性162丙二酸盐利用试验n原理:有的细菌可利用丙二酸盐为唯一碳源,将其分解生成碳酸钠,使培养基变碱n培养基:丙二酸盐培养基n方法:待测菌接种于培养基35 培养18-24小时,观察结果n结果:培养基由淡绿变为深蓝为阳性,无变化则为阴性n意义:肠杆菌科属间鉴别17四 各种酶类试验n1 氧化酶试验原理:细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶,。具有氧化酶的细菌,首先使细胞色素C氧化,再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化,生成有色的醌类化合物试剂:1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对
11、苯二胺方法:菌落法、滤纸法、试剂纸片法。前二者浪费试剂,后者节省结果:10秒内呈深紫红色为阳性应用:肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别,前者阴性,后者多阳性奈瑟菌属、莫拉菌属也为阳性182 触酶试验n原理:具有过氧化氢酶的细菌,能催化过氧化氢生成水和氧,出现气泡n试剂:3%过氧化氢溶液n方法:取菌置于洁净的试管或玻片上,然后滴加3%过氧化氢数滴,观察结果n结果:出现大量气泡的为阳性,不产生气泡的为阴性n意义:用于革兰氏阳性球菌的鉴别,葡萄球菌和微球菌为阳性,链球菌和肠球菌为阴性,肠球菌多假阳性193硝酸盐还原试验n原理:硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨,氨再转化为氨基酸和其他含氮化合物;硝酸盐或亚硝酸盐代替
12、氧作为呼吸系统中的终末受氢体。有的细菌能使硝酸盐还原成亚硝酸盐,有的能使其还原为亚硝酸盐和离子铵,有的能使其还原为氮n培养基:硝酸盐培养基n试剂:甲(对氨基苯磺酸),乙(奈胺)n方法:待测菌接种于培养基,35 培养18-24小时,将甲乙液分别加入培养基,立即观察结果n结果:出现红色为阳性n注意:若加入试剂后无反应,可能是硝酸盐没有被还原,试验阴性硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性,此时要加入少许锌粉,若出现红色则为阴性,不产生红色则为假阴性,实际为阳性n意义:肠杆菌科为阳性;铜绿、嗜麦芽能产生氮气;链球菌肠球菌阴性,葡萄球菌阳性204 DNA酶试验原理:某些细菌产生DNA酶,可使长链DN
13、A水解,后者可被酸沉淀,长链DNA水解后形成的寡核苷酸链则溶于酸,所以在平板上加入酸后会在菌落周围形成透明环培养基:0.2%DNA琼脂平板方法:点种被测菌于上述平板, 35 培养18-24小时;用1mol/L盐酸覆盖平板,观察结果结果:菌落周围出现透明环为阳性意义:金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、变形杆菌阳性215凝固酶试验n原理:致病性葡萄球菌;结合凝固酶、游离凝固酶;纤维蛋白原变为纤维蛋白使血浆凝固n方法:1 玻片法检测结合凝固酶 兔血浆 2试管法检测游离凝固酶 0.5ml兔血浆37 水浴3-4结果:玻片法中有明显颗粒样凝集而盐水对照无凝集为阳性 试管法以血浆凝固为阳性意义:致病性葡萄球菌;金黄
14、色葡萄球菌多阳性226 CAMP试验n原理:B群链球菌能产生CAMP因子,可促进葡萄球菌的溶血毒素的活性,在两菌的交界处溶血力加强,出现矢形溶血区n培养基;BAPn方法:先以产溶血毒素的金葡菌划一横线接种于BAP,再将被测菌与前一划线作垂直划线接种,两线不能相交,0.5-1cm,37 培养18-24小时观察结果,设阴阳性对照n结果:在两划线交界处出现箭头样溶血区为阳性n意义:B群链球菌阳性,马红球菌出现反CAMP现象237胆汁溶菌酶试验n原理:胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌,使细菌发生自溶n试剂:10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁n方法: 平板法:滴加10%去氧胆酸钠一环于被测菌落上35 30min观察结
15、果 试管法:0.9ml被测菌培养物加入10%去氧胆酸钠0.1ml后置35 水浴10-30min观察结果结果:菌落消失,或培养物变透明为阳性意义:肺炎链球菌阳性248 脂酶、卵磷脂酶、硷性磷酸酶n主要用于厌氧菌的鉴定n产气夹膜梭菌卵磷脂酶阳性n中间类杆菌脂酶阳性n致病性葡萄球菌硷性磷酸酶阳性,如金葡等2526五 抑菌试验n1 O/129试验n原理: O/129(二氨基喋啶)对弧菌属有抑制作用,而对气单胞菌属无抑制作用n培养基;碱性琼脂培养基n方法:纸片法药敏 40ug/片n结果:有抑菌环为敏感,无抑菌环为耐药n意义:弧菌、邻单胞菌敏感;气单胞菌属耐药272杆菌肽试验n原理:A群链球菌对杆菌肽几乎
16、全敏感,而其他链球菌则耐药n培养基:BAPn方法:同纸片法药敏0.04U/片n结果:10mm敏感;10mm耐药n意义:A群链球菌敏感283 奥普托欣Optochin试验n原理:肺炎链球菌对Optochin敏感,其他链球菌无抑制作用n培养基:BAPn方法:同纸片法药敏 5ug/片n结果:抑菌环直径14mm敏感;14mm耐药此时加做胆汁溶菌试验证实n意义:肺炎链球菌对Optochin敏感294 新生霉素敏感试验n原理:表皮葡萄球菌对新生霉素敏感;腐生葡萄球菌对新生霉素耐药n培养基:MH琼脂n方法:同纸片法药敏 5ug/片n结果:抑菌环直径16mm敏感;16mm耐药n意义:区别表皮葡萄球菌与腐生葡萄
17、球菌30氢氧化钾拉丝试验 n(1)原理:革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂,释放出未断裂的DNA螺旋,使氢氧化钾菌悬液呈现粘性,可用接种环搅拌后拉出粘丝来,而革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。n(2)方法:取1滴40g/L氢氧化钾水溶液(应新鲜配制)于洁净玻片上,取新鲜菌落少许,与氢氧化钾水溶液搅拌混匀,并每隔几秒钟上提接种环,观察能否拉出粘丝。n(3)结果:用接种环拉出粘丝者为阳性,仍为混悬液者为阴性。n(4)应用:主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。大多数革兰阴性菌于510s内出现阳性反应,有的则需3045s,假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等大多数在10s内呈阳性,不动杆菌、莫拉菌反应较慢,大多数菌株在60s内出现阳性,而革兰阳性菌在60s以后仍为阴性。 31THANK YOU BYE BYE!32