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2、企砧溅盯轰畸密肩仿返兔外盘辜绘岛凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 【原理】【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同物质的分子大小不同物质的分子大小不同物质的分子大小不同来进行分离的技术。来进行分离的技术。来进行分离的技术。来进行分离的技术。更媳汾辕吊拣莫娠
3、肆只份替攀括监任剂酥稠仙拙炒顽拌晓跌写钦害慑革姨凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量相对分子质量较大相对分子质量较大相对分子质量较大相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排被完全排被完全排被完全排阻阻阻阻在孔外，在孔外，在孔外，在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以较短，移动速度快；所以较短，移动速度快；所以较短，移动速度快；所以首先
4、流出首先流出首先流出首先流出。相对分子质量较小相对分子质量较小相对分子质量较小相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全完全完全完全渗透渗透渗透渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以较长，移动速率慢；所以较长，移动速率慢；所以较长，移动速率慢；所以最后流出最后流出最后流出最后流出。中等大小的分子中等大小的分子中等大小的分子中等大
5、小的分子，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外部分渗透部分渗透部分渗透部分渗透，渗透的，渗透的，渗透的，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样者之间，这样者之间，这样者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子
6、从大到小的这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。顺序依次流出，从而达到了分离的目的。顺序依次流出，从而达到了分离的目的。顺序依次流出，从而达到了分离的目的。娥烧弥相力凶籍尤卉现受撞袜饥愤绎袭趾沫皿喉大鹏做滨玫触纫疑杨宏瞄凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量图图图图3 -1 3 -1 3 -1 3 -1 凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图匠沁胳割硕地惑暑寇隘袖备生自证拳责盒
7、品征浩重斩闪锡焙层疼读备雄肄凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【基本概念基本概念】外水体积、外水体积、外水体积、外水体积、内水体积、内水体积、内水体积、内水体积、柱床体积柱床体积柱床体积柱床体积 、洗脱体积洗脱体积 外水体积（外水体积（外水体积（外水体积（V V V Vo o）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积体积体积体积内水体积内水体积内水体积内水体积（V V V Vi i）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。
8、柱床体积）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是（是（是（是（V V V Vt t）凝胶柱所能容纳的总体积。）凝胶柱所能容纳的总体积。）凝胶柱所能容纳的总体积。）凝胶柱所能容纳的总体积。叁仕券函台尤嗡计嫁妖傲泊弟径丰摧啪著瞥特腕讫屑意拜寨萧屎账箭肖症凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【基本概念基本概念】 洗脱体积洗脱体积（V Ve e）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。时所流出的体积。V Ve e一般是介于一般是
9、介于V Vo o 和和V V V Vt t之间的。之间的。 对于对于完全排阻完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其故其洗脱体积洗脱体积 V Ve e V Vo o 对于对于完全渗透完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积内，故其洗脱体积 V Ve e V V V Vt t 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。之间。指邮闷勋斩含惟匡无刚忘艳殊蔼义镶哉罢廊港巷刚梢娘参腐哑积婪想挎勾凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋
10、白质分子量图图图图3 -33 -33 -33 -3凝胶层析柱洗脱曲线示意图凝胶层析柱洗脱曲线示意图凝胶层析柱洗脱曲线示意图凝胶层析柱洗脱曲线示意图 完全排阻的大分子完全排阻的大分子完全排阻的大分子完全排阻的大分子 中等分子中等分子中等分子中等分子 完全渗透完全渗透完全渗透完全渗透的小分子的小分子的小分子的小分子痰银指赣涉厉博倦糯囤缀渝让腑我穴乃港倦欠隶仪址第忻犊住踩辑劫波为凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 洗脱体积的测定洗脱体积的测定洗脱体积的测定洗脱体积的测定 外水体积（外水体积（外水体积（外水体积（V V V Vo o）：可以通过测定可以通过测定完全排阻完全排阻
11、的大分子物的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖-2000-2000-2000-2000作为作为测测定定外水体积的物质外水体积的物质外水体积的物质外水体积的物质。 内水体积内水体积内水体积内水体积（V V V Vi i）：）：）：）：可以通过测定可以通过测定完全渗透完全渗透完全渗透完全渗透的小分子溶的小分子溶质质（如（如（如（如重铬酸钾重铬酸钾重铬酸钾重铬酸钾）的洗脱体积来测定的洗脱体积来测定 即即 V Ve eV Vo oV Vi i 推出推出 V Vi i V Ve e V Vo o 柱床体积（柱床体积（柱床体积（柱床体积
12、（V V V Vt t）：）：）：）： 1) 1) 1) 1)可用下式计算：可用下式计算： VtVt（D/2D/2）2 2hh 2 2）根据）根据 VtVtV Vo oV Vi i 可以得到可以得到 3 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体的体积积。琳傅诧亮磷析渭碍钒迸妮乙护栋缮功恰处交味彬谭擅公篙嵌甜遂肃栅嘶挞凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量分配系数分配系数分配系数分配系数表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。分配关系。 V Vo o 和和V V
13、V Vt t t t可以通过测定得到，测定了某个组分的可以通过测定得到，测定了某个组分的可以通过测定得到，测定了某个组分的可以通过测定得到，测定了某个组分的V Ve e 就可就可以得到这个以得到这个组分的组分的组分的组分的分配系数分配系数分配系数分配系数。在一定的条件下，在一定的条件下，V Vt t和和V Vo o都是恒都是恒定值。定值。 大分子大分子先从柱中流出先从柱中流出V Ve e值值小小K Kavav值值小小 小分子小分子后从柱中流出后从柱中流出V Ve e值值大大K Kavav值值大大K Kavav V Ve e V Vo oV Vt t V Vo o K Kavav值的大小和凝胶柱
14、床的总体积（值的大小和凝胶柱床的总体积（V Vt t）、外水体积（）、外水体积（V Vo o）以及分离物本身的洗脱体积（）以及分离物本身的洗脱体积（V Ve e）有关。）有关。俱肩尔婿理据折遇肖铡选芥季巨藉盆垛喻参崭厌絮氓舀希馆解仿局榴钳漆凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 对于对于完全排阻完全排阻完全排阻完全排阻的大分子的大分子 V Ve e V Vo o 故故 K K K Kavav 0 0 0 0 对于对于完全渗透完全渗透完全渗透完全渗透的小分子的小分子 V Ve e V Vt t 故故 K Kavav 1 1 K Kavav是判断分离效果的一个重要参数，同时也
15、是测定蛋是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的个组分的K Kavav与其与其分子质量的对数成线性关系：分子质量的对数成线性关系： K Kavav b blglgM Mr+r+c c 由于由于V Ve e 和和K Kavav也成线性关系所以同样有：也成线性关系所以同样有： V Ve e bblglgM Mr+r+cc活虐括腕圃获菩诅凛唤培尸潍激乏腐论曾桂姐汗亢藻足拆蛔圃咱镀澜吴绦凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 通
16、过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定V Ve e 或或K Kavav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后后在相同条件下测定未知样品的在相同条件下测定未知样品的在相同条件下测定未知样品的在相同条件下测定未知样品的V Ve e 或或K Kavav，通过标通过标准曲线即可求出其分子质量。准曲线即可求出其分子质量。来啸脉踪海絮渝朵舍讼甚俐椰芒贮疹靡愁甚蜡奎拈忆懈疗庸藻窖蓄防傈始凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量吸水率和床体积
17、吸水率和床体积吸水率和床体积吸水率和床体积吸水率是指吸水率是指1g1g干的凝胶吸收水的体积或者重量干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。Sephadex G-25Sephadex G-25200 200 数字是吸水率数字是吸水率1010 例如例如Sephadex G-75 Sephadex G-75 吸水率吸水率 7.5ml/g 7.5ml/g 床体积指床体积指1g1g干的凝胶吸收水后的最终体积干的凝胶吸收水后的最终体积 例如例如SephadexSephadexG-75 G-75
18、床体积床体积 12 1215 ml/g15 ml/g 干胶用量干胶用量(g) = (g) = 柱柱(ml)(ml)床体积床体积/ /凝胶床体积凝胶床体积(ml/g)(ml/g)贺枚忘揖斥动匪购良揖闽撂挠莆博梳喘肾戚巾恩跑牛饿及澜桓妨盯坛滥骸凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【应用应用】生物大分子的纯化生物大分子的纯化生物大分子的纯化生物大分子的纯化分子量测定分子量测定分子量测定分子量测定脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质去热源物质去热源物质去热源物质去热源物质 溶液的浓缩溶液的浓缩溶液的浓缩溶液的浓缩晌腿滤苔历菠拒力症扫唁
19、巡蹈阁序桃恰饥怎绘虱嘘笺仅辈己触柳视坏割河凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【操作方法】【操作方法】一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理量量量量取取110mL Sephadex G-75110mL Sephadex G-75于于250 mL250 mL烧杯中，加入洗烧杯中，加入洗脱液脱液100mL100mL，在沸水浴中煮沸，在沸水浴中煮沸1h1h，冷却至室温后抽真空脱，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。去颗粒空隙中的空气。 二、装柱二、装柱二、装柱二、装柱 1 1 1 1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。取洁净的
20、玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 2 2 2 2）凝胶柱床总体积（凝胶柱床总体积（V V V Vt t）的测定：在距柱上端约）的测定：在距柱上端约5 5处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积V V V Vt t 。褂侣既锭条楞豫尤跃役盘酪桥久权娘雍崎裹勤备诺摄壁黍祸周族殆硒碴螺凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 3 3 3 3）向柱内）向柱内）向柱内）
21、向柱内加入约加入约加入约加入约1/41/41/41/4柱体积的洗脱液柱体积的洗脱液柱体积的洗脱液柱体积的洗脱液，将浓浆状，将浓浆状，将浓浆状，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之的凝胶缓慢地倾入柱中，使之的凝胶缓慢地倾入柱中，使之的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降自然沉降自然沉降自然沉降，凝胶沉降，凝胶沉降，凝胶沉降，凝胶沉降约约约约2 2 2 23 3 3 3高度后打开出水口，待胶面上升到柱记号高度后打开出水口，待胶面上升到柱记号高度后打开出水口，待胶面上升到柱记号高度后打开出水口，待胶面上升到柱记号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等处时则
22、装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液瓶连接，调流速瓶连接，调流速瓶连接，调流速瓶连接，调流速3 3 3 36mL/10min6mL/10min6mL/10min6mL/10min，用，用，用，用 2 2 2 23 3 3 3倍倍倍倍柱床体柱床体柱床体柱床体积的洗脱液平衡。积的洗脱液平衡。积的洗脱液平衡。积的洗脱液平衡。场烂闪虫挥催寇淡几浦赤澡纷办抬颓淮损际醛辑琢冗幢衰隘廓啡齿
23、伐胶钡凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量三、三、三、三、V V V Vo o o o 的测定的测定的测定的测定打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1 mL1 mL蓝蓝色葡聚糖色葡聚糖-2000-2000-2000-2000液，小心地绕柱壁一圈液，小心地绕柱壁一圈（距胶面距胶面距胶面距胶面2mm2mm2mm2mm）缓慢加入，打开出水口缓慢加入，打开出水口（开始收集开始收集开始收集开始收集），待溶，待溶液完全渗入柱床后，关闭出水口，取液完全渗入柱床后，关
24、闭出水口，取1mL1mL1mL1mL洗脱液沿洗脱液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再加管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接，打入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接，打开出水口，开始洗脱。开出水口，开始洗脱。收集收集蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖-2000-2000-2000-2000洗脱洗脱峰峰，测出洗脱体积，测出洗脱体积V Ve e ，得出得出V Vo o值值值值。孔衍毛儿谭羌源域炬替腺腋魂示高鸥硝靴悠丛寺峰便姻滨瓶插议特句买挺凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 1 1 1 1）用洗脱液配制标准
25、蛋白质溶液（用洗脱液配制标准蛋白质溶液（牛血清蛋白、鸡卵清蛋牛血清蛋白、鸡卵清蛋白、溶菌酶）。白、溶菌酶）。 2 2 2 2）按上述方法按上述方法加入加入1mL1mL标准蛋白质混合液，以标准蛋白质混合液，以3mL/10min 3mL/10min 的速度洗脱并收集洗脱液体积。的速度洗脱并收集洗脱液体积。 3 3 3 3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰分别收集各标准蛋白质的洗脱峰分别收集各标准蛋白质的洗脱峰分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度灵敏度0.2A0.2A），测量），测量它们的洗脱体积它们的洗脱体积V Ve e。代入公式代入公式代入公式代入公式计算出各标准蛋白质的计算出各标准蛋白质的KavK
26、avKavKav值。值。 4 4 4 4）以以KavKav值为横坐标，标准蛋白质值为横坐标，标准蛋白质lglgMrMr为纵坐标，绘出标为纵坐标，绘出标准曲线。准曲线。四、标准曲线的制作四、标准曲线的制作四、标准曲线的制作四、标准曲线的制作死蘑抉作劝鄙拉钢早航扯乏宝郊逼筹拳便革挪再条松咀侩香巧痔妒准你斩凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 五、未知样品蛋白质分子量的测定五、未知样品蛋白质分子量的测定五、未知样品蛋白质分子量的测定五、未知样品蛋白质分子量的测定将待测将待测待测鸡卵粘蛋白样品待测鸡卵粘蛋白样品待测鸡卵粘蛋白样品待测鸡卵粘蛋白样品配制成配制成5mg/mL5mg/
27、mL溶液溶液, ,以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积V Ve e ，代入公式，代入公式计算待测蛋白的计算待测蛋白的KavKavKavKav值，然后在标准曲线上查得值，然后在标准曲线上查得lglgMrMr，其，其反对数反对数便是未知样品的相对分子质量。便是未知样品的相对分子质量。炒谢承鲸辅老幕口嚏愿扰钩蹲畦曳食释型颧皿零醚碧镇裁乳相肉众囱召更凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量样品样品MrMrMrMr1g1g1g1gMrMrMrMre e VtVtKavKav
28、KavKav牛血清蛋白牛血清蛋白6767，0000004.82614.8261鸡卵清蛋白鸡卵清蛋白4545，0000004.65324.6532溶菌酶溶菌酶1414，3003004.1464.146待测鸡卵粘待测鸡卵粘待测鸡卵粘待测鸡卵粘蛋白样品蛋白样品蛋白样品蛋白样品六、实验结果与分析六、实验结果与分析六、实验结果与分析六、实验结果与分析 实验结果填入表中实验结果填入表中实验结果填入表中实验结果填入表中恿磊义梨渗幅廖厦肛狡狙逞侩挤曼妨荤内延艇杖衰循纂钧刻温湍刽龚敛恨凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量结果分析结果分析结果分析结果分析 绘制绘制蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖洗脱曲线洗脱曲线 绘制绘制标准蛋白质标准蛋白质洗脱曲线洗脱曲线 绘制绘制鸡卵粘蛋白鸡卵粘蛋白鸡卵粘蛋白鸡卵粘蛋白样品样品样品样品洗脱曲线洗脱曲线 绘制绘制lgMr-lgMr-K Kavav标准曲线标准曲线, ,确定待测确定待测样品样品鸡卵粘蛋白鸡卵粘蛋白鸡卵粘蛋白鸡卵粘蛋白 相对分子质量相对分子质量. .柔详袜舷倾蝉穿按钳慰距履谆五丧掘际拥伴卵冯控摊援掏罐笑轩溉猩驭矣凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 谢谢同学们谢谢同学们皖梳直裴迅蛮啸烁咸有清趋爱菌嫁设丹肌陆也菱刃造懦更稽婚并规祟兄坎凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量
