《生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十四章第十四章 电泳分离技术电泳分离技术前前 言言 1937193719371937年，瑞典科学家年，瑞典科学家年，瑞典科学家年，瑞典科学家TiseliusTiseliusTiseliusTiselius设计了世界上第一台设计了世界上第一台设计了世界上第一台设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于电泳仪，建立了移界电泳法，并于电泳仪，建立了移界电泳法，并于电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948194819481948年荣获诺贝年荣获诺贝年荣获诺贝年荣获诺贝尔奖。尔奖。尔奖。尔奖。70707070年以来，电泳技术围绕年以来，电泳技术围绕年以来，电泳技术围绕年以来，电泳技术围绕制胶、电泳
2、、染色制胶、电泳、染色制胶、电泳、染色制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1 1 1 1、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。 2 2 2 2、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。 3 3 3 3、扩大应用范围。、扩大应用范围。、扩大应用范围。、扩大应用范围。 各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域
3、各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。电泳电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电性相反的电极移动的现象。电泳技术电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。析的技术。1.电泳技术的基本原理电泳技术的基本原理u u u u: : : :泳动度泳动度泳动度泳动度orororor泳动率泳动率泳动率泳动率(cm/(cm/(cm/(cm/伏伏伏伏秒秒秒秒orororor分分分分) ) ) )V V V V: : : :泳动速度泳动速度泳动速度泳动速度:cm/
4、:cm/:cm/:cm/秒秒秒秒orororor分分分分E E E E: : : :电场强度电场强度电场强度电场强度: : : :伏特伏特伏特伏特/cm/cm/cm/cmd d d d: : : :泳动距离泳动距离泳动距离泳动距离:cm:cm:cm:cmt t t t: : : :电泳时间电泳时间电泳时间电泳时间: : : :秒秒秒秒/ / / /分分分分U U U U: : : :电压电压电压电压: : : :常压常压常压常压(100(100(100(100500v)500v)500v)500v) 高压高压高压高压(50010000v)(50010000v)(50010000v)(50010
5、000v)仅需几分钟仅需几分钟仅需几分钟仅需几分钟l l l l: : : :支持场的长度支持场的长度支持场的长度支持场的长度 ( ( ( (有效长度有效长度有效长度有效长度) ) ) )(1)(1)泳动度泳动度u u u u ( (迁移率迁移率):): 带电质点在带电质点在单位强度电场单位强度电场下的泳动速度下的泳动速度不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度(2)(2)影响泳动率影响泳动率u u的因素的因素 内因内因内因内因：1 1 1 1. . . .净电荷净电荷净电荷净电荷 2 2 2 2. . . .质点大小质点大小质点大小质点大小 3 3 3
6、 3. . . .质点形状质点形状质点形状质点形状 外因外因外因外因：1 1 1 1. . . .V ( U/L)V ( U/L)V ( U/L)V ( U/L) 2 2 2 2. . . .缓冲液的缓冲液的缓冲液的缓冲液的pH (pHpH (pHpH (pHpH (pH恒定恒定恒定恒定) ) ) ) 3 3 3 3. . . .离子强度离子强度离子强度离子强度I I I I 最适最适最适最适:0.02:0.02:0.02:0.02- - - -0.20.20.20.2 4 4 4 4. . . .电渗：液体对固体支持物的相对移动电渗：液体对固体支持物的相对移动电渗：液体对固体支持物的相对移动
7、电渗：液体对固体支持物的相对移动 (3) (3)电泳类型电泳类型 a.a.a.a.载体载体载体载体电泳电泳电泳电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、 凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳。 凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝
8、胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳 b.b.b.b.自由界面电泳自由界面电泳自由界面电泳自由界面电泳 支持物为溶液，很少用。支持物为溶液，很少用。支持物为溶液，很少用。支持物为溶液，很少用。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n n聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由是由是由是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺( ( ( (AcrAcrAcrAcr) ) ) )和和和和交联剂交联剂N,N-N,N-N,N
9、-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺( ( ( (BisBisBisBis) ) ) )在在在在加速剂加速剂 N N N N, , , ,N N N N, , , ,N N N N, , , ,N N N N- - - -四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺( ( ( (TEMEDTEMEDTEMEDTEMED) ) ) )和和和和催化剂催化剂过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵( ( ( (APAPAPAP) ) ) )或核黄素或核黄素或核黄素或核黄素( ( ( (C C C C17171717H H H H2O62O62O62O6N N N N4 4
10、4 4) ) ) )的作用下的作用下的作用下的作用下聚合交联成三维聚合交联成三维网状结构的凝胶网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为，以此凝胶为支持物的电泳称为，以此凝胶为支持物的电泳称为，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳( ( ( (PAGEPAGEPAGEPAGE) ) ) )。 凝胶的聚合反应：Ammonium persulfate (free radical initiator)过硫酸铵过硫酸铵 Acrylamide (monomer)Bis(acrylamide) (bridge)TEMED (catalyst):四甲基乙二胺四甲基乙二胺自由基的生成
11、者自由基的生成者凝胶凝胶的基本單位的基本單位: :丙烯酰胺丙烯酰胺交联交联使聚合使聚合产产生分枝生分枝: :甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺帮帮助助传递传递自由基的自由基的加速剂加速剂Acrylamide Acrylamide 有毒性！有毒性！-(O S-SO )442-2 SO4CH2=CH-CO-NH21211 2核黄素核黄素-TEMED-TEMED系统与系统与过硫酸铵过硫酸铵-TEMED-TEMED系统系统 丙烯酰胺单体聚合过程：聚聚合合反反应应交联剂交联剂造成分造成分枝枝端端点点自自由基可由基可再延再延续续freeradicalBisBis聚合反聚合反应应交錯交錯连连結結自由基形成自由基形成n
12、 n光聚合光聚合：核黄素为催化剂核黄素为催化剂核黄素为催化剂核黄素为催化剂( ( ( (阳光阳光阳光阳光, , , ,日光日光日光日光) ) ) )，制大孔胶制大孔胶制大孔胶制大孔胶。n n化学聚合：化学聚合：制小孔胶制小孔胶制小孔胶制小孔胶。 过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵(NH(NH(NH(NH4 4 4 4) ) ) )2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3 3 3 APSAPSAPSAPS ( ( ( (引发剂引发剂引发剂引发剂) ) ) ) N,N,N,NN,N,N,NN,N,N,NN,N,N,N- - - -四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺
13、，TEMED(TEMED(TEMED(TEMED(加速剂加速剂加速剂加速剂) ) ) )2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理n n三种物理效应三种物理效应 样品浓缩效应样品浓缩效应 分子筛效应分子筛效应 电荷效应电荷效应三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高（1 1）样品浓缩效应：）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。由凝胶系统的不连续性产生。由凝胶系统的不连续性产生。由凝胶系统的不连续性产生。 凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性
14、缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性 p p p pH H H H的不连续性的不连续性的不连续性的不连续性n n凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性 单体浓度单体浓度单体浓度单体浓度 交联度交联度交联度交联度 大孔胶大孔胶大孔胶大孔胶:T=3% C=2.0%:T=3% C=2.0%:T=3% C=2.0%:T=3% C=2.0% 小孔胶小孔胶小孔胶小孔胶:T=7% C=2.5%:T=7% C=2.5%:T=7% C=2.5%:T=7% C=2.5%n n凝胶网孔大小凝胶网孔大小凝胶网孔大小凝胶网孔大小: :
15、 : : 聚合链长度聚合链长度聚合链长度聚合链长度: : : :由由由由AcrAcrAcrAcr浓度浓度浓度浓度 交交交交 联联联联 程度程度程度程度: : : :由由由由AcrAcrAcrAcr与与与与BisBisBisBis相对比例相对比例相对比例相对比例 BisBisBisBis的浓度低的浓度低的浓度低的浓度低, , , ,孔径大孔径大孔径大孔径大, , , ,可在聚合前调节单体与可在聚合前调节单体与可在聚合前调节单体与可在聚合前调节单体与BisBisBisBis的浓度比的浓度比的浓度比的浓度比 如如如如: Acr Bis T(%): Acr Bis T(%): Acr Bis T(%)
16、: Acr Bis T(%) 小孔小孔小孔小孔 28.0g 0.735g 7%28.0g 0.735g 7%28.0g 0.735g 7%28.0g 0.735g 7% 大孔大孔大孔大孔 10.0g 2.5g 2.5%10.0g 2.5g 2.5%10.0g 2.5g 2.5%10.0g 2.5g 2.5%n n凝胶浓度凝胶浓度凝胶浓度凝胶浓度(T)(T)(T)(T)的选择与被分离物质分子量密切相关的选择与被分离物质分子量密切相关的选择与被分离物质分子量密切相关的选择与被分离物质分子量密切相关。 分子量范围分子量范围分子量范围分子量范围 适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度
17、/(%)/(%)/(%)/(%) 蛋蛋蛋蛋 白白白白 质质质质 5105105105105 5 5 5 2-5 2-5 2-5 2-5 核酸核酸核酸核酸(RNA)(RNA)(RNA)(RNA) 101010104 4 4 4 1520 1520 1520 1520 10 10 10 104 4 4 4101010105 5 5 5 5-105-105-105-10 10 10 10 105 5 5 5-210-210-210-2106 6 6 6 2-2.6 2-2.6 2-2.6 2-2.6n n缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性
18、 大孔胶大孔胶大孔胶大孔胶 pH=6.7pH=6.7pH=6.7pH=6.7 先行离子：先行离子：先行离子：先行离子：Cl-Cl-Cl-Cl-存在于凝胶层中任何存在于凝胶层中任何存在于凝胶层中任何存在于凝胶层中任何pHpHpHpH值下值下值下值下 随后离子：随后离子：随后离子：随后离子：Gly-Gly-Gly-Gly-存在于电极缓冲液中存在于电极缓冲液中存在于电极缓冲液中存在于电极缓冲液中 pI=6.0 pKpI=6.0 pKpI=6.0 pKpI=6.0 pK1 1 1 1=2.34 pK=2.34 pK=2.34 pK=2.34 pK2 2 2 2=9.70=9.70=9.70=9.70
19、在在在在pH=6.7pH=6.7pH=6.7pH=6.7时，只有少数解离为时，只有少数解离为时，只有少数解离为时，只有少数解离为Gly-Gly-Gly-Gly-，多数为，多数为，多数为，多数为Gly+-Gly+-Gly+-Gly+-。 PrPrPrPr分子在分子在分子在分子在pH6.7pH6.7pH6.7pH6.7时以时以时以时以Pr-Pr-Pr-Pr-形式存在形式存在形式存在形式存在n npHpHpHpH的不连续性的不连续性的不连续性的不连续性 pHpHpHpH 大孔大孔大孔大孔( ( ( (浓缩浓缩浓缩浓缩) ) ) )胶胶胶胶 6.7 6.7 6.7 6.7 小孔小孔小孔小孔( ( (
20、(分离分离分离分离) ) ) )胶胶胶胶 8.9 8.9 8.9 8.9 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 8.3 8.3 8.3 8.3 A A A A为电泳前为电泳前为电泳前为电泳前3 3 3 3层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，3 3 3 3层胶中均有快离子、慢离子层胶中均有快离子、慢离子层胶中均有快离子、慢离子层胶中均有快离子、慢离子 B B B B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。显示电泳开始后，蛋白质样品
21、夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C C C C显示蛋白质样品分离成数个区带。显示蛋白质样品分离成数个区带。显示蛋白质样品分离成数个区带。显示蛋白质样品分离成数个区带。电泳过程示意图电泳过程示意图电泳过程示意图电泳过程示意图不连续系统浓缩效应示意图不连续系统浓缩效应示意图连续胶与不连续胶连续胶与不连续胶: :连续胶：连续胶：胶条胶条( (胶板胶板) )的浓度、的浓度、pHpH值、组成成份不变值、组成成份不变不连续胶不连续胶: :胶条胶条( (胶板胶板) )的浓度、的浓度、pHpH值、组成成份变化值、组成成份变化连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板玻璃板 ( (前前, ,后后) )样样本梳本梳
22、间间隔隔条条间间隔隔条条 浓缩胶浓缩胶 分离胶分离胶不连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板玻璃板 ( (前前, ,后后) )样样本梳本梳间间隔隔条条间间隔隔条条 电泳凝胶电泳凝胶系系统统的的组组成：成：1电电泳系統泳系統pH胶体浓胶体浓度度缓冲缓冲液液上上层层( (负极负极) )缓冲缓冲液液 2样品溶液 3浓缩胶 6.9 4分离胶 胶体 5下下层层( (正正极极) )缓冲缓冲液液 Tris-HClTris-HClTris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5% 7.520% - - - 不连续胶有聚焦样品不连续胶有聚焦样品的作用的作
23、用变性胶与非变性胶：变性胶与非变性胶：变性胶：变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，胶电脉在蛋白质变性的状态下进行， 主要指主要指SDSSDS变性条件下进行。变性条件下进行。非变性胶：非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂。行，不加变性剂。 SDS SDS 在蛋白在蛋白质质表面表面 均均匀匀敷上敷上 一一层负电层负电：SDSboiling变变性蛋白性蛋白质质成一成一线状线状分子分子原原态态蛋白蛋白质质並且均並且均匀带匀带上一上一层负电荷层负电荷非非极极性尾部性尾部极性头极性头部部 三种不同性质蛋白质的电泳比较：Molecular WeightpINa
24、tive PAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternary StructureX YZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastX YZ-+n n电泳装置电泳装置图图图图1 1 1 1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A(A(A(A为正面为正面为正面为正面,B,B,B,B为剖面为剖面为剖面为剖面) ) ) )(1)(1)(1)(1)样品胶样品胶样品胶样品胶pH6.7 (
25、2)pH6.7 (2)pH6.7 (2)pH6.7 (2)浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶pH6.7 pH6.7 pH6.7 pH6.7 (3)(3)(3)(3)分离胶分离胶分离胶分离胶pH8.9 (4)pH8.9 (4)pH8.9 (4)pH8.9 (4)电极缓冲液电极缓冲液电极缓冲液电极缓冲液pH8.3pH8.3pH8.3pH8.3架膜架膜架膜架膜加盖加盖加盖加盖接导线，开机接导线，开机接导线，开机接导线，开机3.醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白n n电泳仪器电泳仪器电泳仪器电泳仪器n n实验操作实验操作： 浸泡浸泡浸泡浸泡 将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡将醋酸纤
26、维素薄膜在缓冲溶液中浸泡将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min20min20min20min，取出识别取出识别取出识别取出识别光面和麻面光面和麻面光面和麻面光面和麻面。 点样点样点样点样 用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端用铅笔在薄膜麻面一端用铅笔在薄膜麻面一端用铅笔在薄膜麻面一端2cm2cm2cm2cm处画一细线，利用载玻片处画一细线，利用载玻片处画一细线，利用载玻片处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点
27、样。一侧蘸取样品，于细线处点样。一侧蘸取样品，于细线处点样。一侧蘸取样品，于细线处点样。 电泳电泳电泳电泳 将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使桥上，点样一端靠近负极；通电后先使桥上，点样一端靠近负极；通电后先使桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80VU=80VU=80VU=80V，待，待，待，待10min10min10min10min后，使后，使后，使后，使U=120VU=120VU=120VU=120V电泳电泳电泳电泳40min40min
28、40min40min。 染色染色染色染色 将薄膜取出后，置于氨基黑将薄膜取出后，置于氨基黑将薄膜取出后，置于氨基黑将薄膜取出后，置于氨基黑10B10B10B10B染色剂重染色染色剂重染色染色剂重染色染色剂重染色10min10min10min10min。 漂洗漂洗漂洗漂洗 将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。至无蛋白区无蓝黑色。至无蛋白区无蓝黑色。至无蛋白区无蓝黑色。4.等电聚焦等电聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF)(Is
29、oelectro focusing IEF or EF)n n原理原理 PrPrPrPr为两性电解质，不同为两性电解质，不同为两性电解质，不同为两性电解质，不同PrPrPrPr其其其其aaaaaaaa的数量、的数量、的数量、的数量、种类及占比例不同，因此种类及占比例不同，因此种类及占比例不同，因此种类及占比例不同，因此pIpIpIpI不同，不同，不同，不同，pIpIpIpI范围范围范围范围窄且净电荷为零，因此依窄且净电荷为零，因此依窄且净电荷为零，因此依窄且净电荷为零，因此依pIpIpIpI分离分离分离分离PrPrPrPr。 EFEFEFEF是在凝胶中加两性载体电解质，通是在凝胶中加两性载体电
30、解质，通是在凝胶中加两性载体电解质，通是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成直流电后，可形成直流电后，可形成直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加从阳极到阴极逐步增加从阳极到阴极逐步增加从阳极到阴极逐步增加的的的的pHpHpHpH梯度梯度梯度梯度( ( ( (连续的、稳定的、线性的连续的、稳定的、线性的连续的、稳定的、线性的连续的、稳定的、线性的pH)pH)pH)pH)。n n原理原理（续）（续） 当当当当PrPrPrPr在电场中迁移到它的在电场中迁移到它的在电场中迁移到它的在电场中迁移到它的PIPIPIPI时，由于净时，由于净时，由于净时，由于净电荷为零，不再移动。电荷为零，不再移动。
31、电荷为零，不再移动。电荷为零，不再移动。 如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、阴极会重新吸引它回到阴极会重新吸引它回到阴极会重新吸引它回到阴极会重新吸引它回到pIpIpIpI位置。因此位置。因此位置。因此位置。因此PrPrPrPr只只只只能在能在能在能在pIpIpIpI位置被浓缩成窄、稳定的带位置被浓缩成窄、稳定的带位置被浓缩成窄、稳定的带位置被浓缩成窄、稳定的带。称这。称这。称这。称这种浓缩效应为聚焦。种浓缩效应为聚焦。种浓缩效应为聚焦。种浓缩效应为聚焦。 只要凝胶中的只要凝胶中的只要凝胶中的
32、只要凝胶中的pHpHpHpH梯度范围足够窄。便梯度范围足够窄。便梯度范围足够窄。便梯度范围足够窄。便可将可将可将可将pIpIpIpI相近的相近的相近的相近的PrPrPrPr分开，分开，分开，分开，EFEFEFEF是电泳技术中分是电泳技术中分是电泳技术中分是电泳技术中分辨率最高的技术。辨率最高的技术。辨率最高的技术。辨率最高的技术。n n方法（方法（EFEF的关键）的关键） 载体两性电解质载体两性电解质载体两性电解质载体两性电解质CA CA CA CA 分辨率分辨率分辨率分辨率0.01pH0.01pH0.01pH0.01pH 固相固相固相固相pHpHpHpH梯度梯度梯度梯度 以具弱酸或弱碱性质的
33、丙以具弱酸或弱碱性质的丙以具弱酸或弱碱性质的丙以具弱酸或弱碱性质的丙烯烯烯烯酰胺衍生物酰胺衍生物酰胺衍生物酰胺衍生物 CH CH CH CH2 2 2 2CHCONHRCHCONHRCHCONHRCHCONHR R=COOH R=COOH R=COOH R=COOH R=4 R=4 R=4 R=4级氨基级氨基级氨基级氨基 R R R R为弱酸为弱酸为弱酸为弱酸orororor弱碱弱碱弱碱弱碱, , , ,形成缓冲体系形成缓冲体系形成缓冲体系形成缓冲体系n n体系体系体系体系分辨率达分辨率达分辨率达分辨率达0.001pH0.001pH0.001pH0.001pH p p p pH H H H梯度
34、范围最窄可为梯度范围最窄可为梯度范围最窄可为梯度范围最窄可为0.01pH/cm0.01pH/cm0.01pH/cm0.01pH/cm CAIEFCAIEFCAIEFCAIEF是两性分子是两性分子是两性分子是两性分子, , , ,在凝胶聚合时形成两性在凝胶聚合时形成两性在凝胶聚合时形成两性在凝胶聚合时形成两性分子分子分子分子；在电场中在电场中在电场中在电场中,CA,CA,CA,CA迁移到自己的迁移到自己的迁移到自己的迁移到自己的pIpIpIpI而形成而形成而形成而形成pHpHpHpH梯度梯度梯度梯度. . . .5.5.电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策1).1).低离子溶液中低离子溶液中,
35、,不同电荷的蛋白质分子间不同电荷的蛋白质分子间会发生会发生相互静电作用相互静电作用, ,增加溶液离子强度可减少这种作增加溶液离子强度可减少这种作用用, ,但会提高电泳时的电流但会提高电泳时的电流, ,使产热更多使产热更多, ,温度升温度升高又促进蛋白质的扩散高又促进蛋白质的扩散, ,使区带变宽使区带变宽, ,分辨率下分辨率下降降. .因此电泳缓冲液的因此电泳缓冲液的离子强度离子强度必须控制适当。必须控制适当。0.02-0.2M 0.02-0.2M 的离子强度的离子强度离子强度低离子强度低, ,速度快速度快, ,发热低发热低, ,有电渗有电渗离子强度高离子强度高, ,速度慢速度慢, ,发热大发热
36、大电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策2).2).蛋白质分子蛋白质分子所带净电荷所带净电荷主要取决于主要取决于电泳电泳缓冲液的缓冲液的pHpH值值, ,应仔细调整和控制电泳缓应仔细调整和控制电泳缓冲液的冲液的pHpH值值, ,使各组分分子的净电荷数差使各组分分子的净电荷数差异加大异加大. .但极端但极端pHpH下蛋白质会变性失活下蛋白质会变性失活, ,因此一般控制在因此一般控制在pH4.5pH4.59.59.5之间之间; ;电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策3). 缓冲液的种类缓冲液的种类, ,浓度和其他电解质浓度浓度和其他电解质浓度影响影响蛋白质所带蛋白质所带电荷的极性和数量电荷的极性和数
37、量, ,同时还影同时还影响蛋白质响蛋白质分子间的相互作用分子间的相互作用, ,因此因此必须根必须根据分离溶质的不同选择合适的缓冲系统据分离溶质的不同选择合适的缓冲系统; ;电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策4).表面活性剂表面活性剂(SDS(SDS等等) )强烈破坏蛋白质强烈破坏蛋白质分子间的分子间的非共价作用非共价作用, ,使蛋白质分使蛋白质分子为表面溶剂分子所包围子为表面溶剂分子所包围, ,阻止了阻止了蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用, ,同时同时也消也消除了不同蛋白质固有的电荷差异除了不同蛋白质固有的电荷差异; ;电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策5).5).控制电泳介质的有
38、效黏度控制电泳介质的有效黏度, ,包包括选择适当的凝胶孔径和添加括选择适当的凝胶孔径和添加能增加介质黏度的物质能增加介质黏度的物质; ;电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策6).6).电泳过程发热量的控制电泳过程发热量的控制: : 发热的难题：蛋白质变性发热的难题：蛋白质变性; ;蛋白质区带扩蛋白质区带扩散散, ,分辨率下降分辨率下降; ;对策对策: :减少发热减少发热: :降低电流降低电流, ,提高电压提高电压; ;提高传热提高传热表面积表面积; ;提高材质的传热系数提高材质的传热系数; ;提高冷却提高冷却系统的温差系统的温差. .减少扩散减少扩散: :增加缓冲系统或介质的黏度可增加缓冲系统或介质的黏度可以减少扩散以减少扩散; ;在微重力作用下进行电泳在微重力作用下进行电泳; ;思考思考什么是等电点电泳什么是等电点电泳? ?什么是等电聚焦电泳什么是等电聚焦电泳? ?二者的主要差别在什么地方二者的主要差别在什么地方? ?
