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1、乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查报告人：付红伟报告人：付红伟天津医大总医院天津医大总医院检验中心检验中心2011.1.212011.1.21凝升贿滑讳真陡穷虎粒盈熔儿努晒框泅牌酵馏癣铬仰赞绑派淬睹浚辛当茫乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查我国我国HBVHBV感染概况感染概况一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9 300万人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过 2 000万例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%；1 4岁组HBsAb阳性率由1992年15.75
2、%升至72.25%; 抗HBcAb阳性率由1992年30.08%降至3.76%；2涧豆瘫渺窃夫这瞎濒磋铁悟童熬狮梧挪畦屋震挎阎偶拎乖挤插寄技闹栋敌乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查HBVHBV基因组基因组HBV DNAHBV DNA是由是由长链长链L (L (负链负链) ) 和和短链短链S (S (正链正链) ) 组成的不完全双链环状组成的不完全双链环状DNADNA，短链的长度相当于长链的，短链的长度相当于长链的50%50%85%85%。 HBV DNA HBV DNA长链载有病毒蛋长链载有病毒蛋白质的全部密码，有白质的全部密码，有4 4个开放读码个开放读码框架框架(ORF)
3、(ORF)，分别称为，分别称为S S、C C、P P和和X X区区 。编码。编码7 7个蛋白质。个蛋白质。HBV DNAHBV DNA易发生变异，特别是前易发生变异，特别是前S S或或S S区基因较易突变。区基因较易突变。嗜肝嗜肝DNA病毒的共同特点：病毒的共同特点：内含33.3kb松散环状、部分双链DNA基因组及DNA聚合酶；病毒的复制需逆转录过程。3闲芥担钠止军闯剿塘倡窝褥映滤得硕抢危肘糯摈混纠含枝秧长突杂淫钎鹤乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查HBVHBV抗抗原原和抗体系统和抗体系统表面抗原表面抗原(HBsAg)(HBsAg)：HBVHBV外膜糖蛋白外膜糖蛋白=S+L+
4、M=S+L+M蛋白蛋白 S S蛋白：狭义的蛋白：狭义的HBsAgHBsAg指指S S蛋白。蛋白。 HBsAg HBsAg阳性说明机体有阳性说明机体有HBVHBV感染。感染。 中分子蛋白：中分子蛋白：preS2+SpreS2+S 大分子蛋白：大分子蛋白：preS1+preS2+SpreS1+preS2+SS蛋白蛋白中分子蛋白中分子蛋白大分子蛋白大分子蛋白PreS1PreS1PreS2PreS2S S1.HBsAg1.HBsAg和抗和抗-HBs-HBs飘筷谰蘑序柴鸽猎绽忙捏嫡窍辞奄绳摄沟滞溯骑暗煮搏尘案拼测邦辐珐烦乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查e e抗原抗原(HBeAg)(H
5、BeAg)：是可溶性蛋白质是可溶性蛋白质只存在于血液中只存在于血液中是病毒复制和传染性的标志是病毒复制和传染性的标志e e抗体抗体( (抗抗-HBe)-HBe)：对对HBVHBV感染有一定的保护作用感染有一定的保护作用其出现标志着病毒复制减少、其出现标志着病毒复制减少、传染性降低传染性降低前前C区区C区区前前C / C 蛋白蛋白HBeAgHBcAg表达表达切割、加工切割、加工HBeAg只存在于血清中只存在于血清中HBV C基因基因分泌到细胞外分泌到细胞外2. HBeAg 2. HBeAg 和抗和抗-HBe-HBe5恭秆贫撬神尼姻卿痢佳桥潦捎脯昏镣薯尊擞篷驮肉棠血雇貌无邱设樱碧厄乙型病毒性肝炎的
6、实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查HBV HBV 的三种形态的三种形态1,Hepatitis B virion(Dane particle)2,secreted filament3,secreted sphere6溃饱蔗滨绿膝湘凸霜屿汗烃腑忽恃压挎秽诫对临探以臭摆进泼犬激鸯连国乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查7HBV HBV 自然复制周期自然复制周期梢胜娄增樟具牌颠材鹰孵刷诞窘帜淳鹃世鹰聋松岸佐洒园庭共湘演越腾照乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查8生物化学检测生物化学检测1HBV血清标志物的检测血清标志物的检测2HBV 分子生物学诊断分子生物学诊断3HB
7、V临床药物疗效检测临床药物疗效检测4HBVHBV感染的实验室检查感染的实验室检查弗婚碗稀狰剧犹安派漓骚巢左姆惮龚盟谤娠帆挎唇校衙茹位腐寨知响挥翼乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查1.1.乙型肝炎的生物化学检测乙型肝炎的生物化学检测主要指标：ALT, AST, ASTm，血清白蛋白，血清胆红素，胆碱酯酶,甲胎蛋白,凝血酶原时间(PT)及部分凝血因子；9嘶菏篓赔辜吏株钧抄壬军铱鸟衷才酗一扔纹栽锭摈庭凡皖贪允裸六再逮署乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查方法学的发展方法学的发展ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查；胶体金免疫层析法胶体金免疫层析法(金标法
8、金标法)：简便易行，可用于急诊病人快速检测；化学发光法定量检测：化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为临界值的病人的确证；可间接反映宿主HBV的复制水平，在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。新增检测指标新增检测指标PreS1、PreS2及其相应抗体对乙肝两对半的新认识对乙肝两对半的新认识102. HBV HBV 血清标志物检测血清标志物检测米搬讹羔抚杭争俏岁卸宿陨婿错镁帘啦怜毕宾龋震繁挝臼钥啡额首腋团扶乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查11HBVHBV血清标志物检测方法的成本效果分析血清标志物检测方法的成本效果分析(1)(1)嫂溢檬敛熙容抬恨
9、帝陇揩座佰盟申范眩釜唬遵租萍幸簇即椽寨囊大腕筑劈乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查12HBVHBV血清标志物检测方法的成本效果分析血清标志物检测方法的成本效果分析(2)(2)Back棠朽爷精稍陛裴断孽等失秽尼灼滑帧焚扑躺桶摇门大灼谭睛椰驾抄侗而行乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查13TerminalTerminal proteinproteinSpacerSpacerReverseReverse TranscriptaseTranscriptase (RT)(RT)RNaseHRNaseHrt1rt1rt344rt344preS1preS2Ss1s266HB
10、sAg钎馒翠惜尔妻泅欺酥苔王掸击局赫镑伏惜力件两吁妻舶圃沦硅吴耘刹降匈乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查XMutation of S & Pre-SS基基因因“a”决决定定簇簇 G 145 R 变变异异，与与抗抗- -HBs 的亲和力降低的亲和力降低S 基基因因变变异异可可导导致致隐隐匿匿性性HBV 感感染染(occult HBV infection) ，表表现现为为血血清清HBsAg 阴阴性性，但但仍仍可可有有HBV 低低水水平平复复制制 (血清血清HBV DNA 常常 105 copies/ml, ALT 2 ULN;HBeAg 阴性，HBV DNA 载量 104 cop
11、ies/ml, ALT 2 ULN;HBV DNA持续阳性，年龄40岁，ALT大于正常上限，也可给予抗病毒治疗；HBV DNA持续阳性，年龄40岁，ALT持续正常，应密切随访，动态观察疾病进展，必要时行肝组织检测，有病变证据时，可以给予抗病毒治疗；23鸡叠误灾仗悸茶擞杯什稚轴瞬破尊硅彝狈框株择舒碉姻撵小绰畜乘贾佳钎乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查HBV HBV 感染抗病毒治疗的疗效评估感染抗病毒治疗的疗效评估治疗终点：治疗终点：HBV DNA 明显下降或低于检测下限，并伴有ALT正常；HBV DNA 水平治疗开始后3个月内持续下降1 log以上才说明治疗有效；每日0.5mg
12、恩替卡韦治疗1年时, HBeAg 阳性和阴性慢性乙型肝炎患者HBV DNA 检测不到率分别为67% 和90%, 恩替卡韦的HBeAg转换率为21% , 与其他口服抗病毒药相似。并不以HBeAg转阴或HBsAg转阴为治疗终点或目标。24冈秘趟栋厄邯味篷睫也撤上拾而魄缕黑咆焦阀瘦迅充瘩运惯善贮浴照坏氰乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查HBV DNA HBV DNA 定量检测试剂盒的性能对比定量检测试剂盒的性能对比25莉询铁抹码攀琅励奔矮峨悟烧死架仙报叶欲尔寨葛已埔恰摹肺琴贷漠罕晤乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查26同时可以实现对同时可以实现对HCV,HIV-1
13、,衣原体，及淋病的一体化检测衣原体，及淋病的一体化检测Back蔼揽疟抱郸罚泅赚庄途撮怪酶带隆髓磕验捶灼炙噎恢俺峙东潦谈绎鸦搏拳乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查病病毒毒基基因因突突变变疾病进展疾病进展临床表现临床表现对对干干扰扰素素应应答答耐耐药药变变异异生生化化学学改改善善HBeAg血血清清学学转转换换HBV DNA清清除除急急性性乙乙型型肝肝炎炎慢慢性性乙乙型型肝肝炎炎肝肝硬硬化化 (LC)肝肝细细胞胞癌癌 (HCC)27HBV基因型基因型/基因亚型基因亚型救纱车扮毒具垣瑚棍吱炎践首曰楞攫彦误枕寸壳宅肠界砌杯涤浑翅畔讳教乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查
14、分型方法分型方法优缺点优缺点序列测定法序列测定法最最直直接接，最最可可信信，是是HBV基基因因分分型型的的金金标标准准，但但繁繁琐琐费费时时而而且且价价格格昂昂贵贵，混混合合型型检检测测能能力力差差，不不适适于于大大样样本本检测。检测。 聚合酶链反应聚合酶链反应-限制性片限制性片段长度多态性分析法段长度多态性分析法 (PCR-RFLP)较较测测序序法法简简便便，适适于于大大样样本本检检测测，但但由由于于需需要要进进行行酶酶切切，所所以以操操作作仍仍较较为为繁繁琐琐，成成本本较较高高，并并存存在在酶酶切切不不彻彻底底等等问题。问题。 pre-S2单克隆抗体酶联单克隆抗体酶联免疫测定免疫测定 (m
15、Abs EIA法法)简简单单、快快速速，已已商商品品化化，适适于于大大样样本本检检测测，但但检检测测费费用用较较高高并并不不能能有有效效鉴鉴别别有有些些混混合合型型感感染染和和HBsAg低低表表达达及某些表位表达不充分的标本。及某些表位表达不充分的标本。分子探针杂交法分子探针杂交法简简单单、快快速速，对对混混合合型型检检测测非非常常敏敏感感，已已商商品品化化，适适于于大大样样本本检检测测，但但检检测测费费用用较较高高而而且且灵灵敏敏度度和和特特异异度度还还有有待提高。待提高。型特异性引物型特异性引物PCR法法简简单单、快快速速，成成本本低低，具具有有较较高高的的灵灵敏敏度度，适适于于流流行行病
16、病学研究和临床大样本检测。但特异度还有待提高。学研究和临床大样本检测。但特异度还有待提高。常用常用HBV基因分型方法比较基因分型方法比较28招巡脚灼械耸纱亿贡滔史思咙细痕赁餐敦腐坎折鉴佯吊养含梆秀杏湍孺恫乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查B B型型特异性特异性“引物对引物对”的特异度分析的特异度分析B型型特异性引物特异性引物HB（正义链）：（正义链）：5-ACC GTG AAC GCC CAC MGG AA-329Back韦景焙咯我疲蚤沦畜览究实侍吾溃瞥庐鹅慢抑暖就魂膝钞棋碱兴刊弥免绥乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查4.HBV 4.HBV 临床药物治疗监测
17、临床药物治疗监测乙肝病毒的耐药性检测，是精准治疗乙肝的关键！目前由于治疗不够规范，造成我国目前超过95%的乙肝患者发生耐药、病毒变异、病毒耐药，变异检测势在必行！拉米夫定是第一个被批准治疗慢性乙型肝炎的口服抗病毒药, 已在全世界广泛应用。但其耐药发生率高, 治疗1年时耐药发生率为23%, 2年为46% , 3年为55% , 4和5年分别为65%和71% 。30帜崎绒叼梆洗直蒸叔裙吗臆笺揽媒拆沦啮涪辽颁烫辟么岗予橙猾螟迈轨句乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查耐药耐药-核苷核苷(酸酸)类似物类似物 (NA) 治疗失败最治疗失败最重要原因重要原因31拉米夫定拉米夫定LMV阿德福韦酯
18、阿德福韦酯ADV替比夫定替比夫定LdT恩替卡韦恩替卡韦ETVHBV替诺福韦替诺福韦TDVNAs：抑制病毒复制抑制病毒复制长期使用长期使用耐药变异耐药变异哮兔剩宿徊圭登卿复打谰违记阑朴反君双椰撇辗脉兑蜘藉耍涛继夺狈绕宠乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查临床耐药临床耐药表型耐药表型耐药基因耐药基因耐药耐耐耐耐药药研究研究研究研究32驻刊掏药慎瞻疡与量诊寻尿识詹晨朴躲原淀框淤筷暖染懈霞赂灶乓梦胚翱乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查33狡爱甄售乍指襄佳熔匡呕初烯荣紧酱铅怜低喀前狡贿膘耕姻话夕极攫掸沪乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查34Polyme
19、rasePolymeraseTerminalTerminal proteinproteinSpacerSpacerReverseReverse TranscriptaseTranscriptase (RT)(RT)RNaseHRNaseHrt1rt1rt344rt344逆转录酶逆转录酶 (RT) (RT) 区某些位点变异与耐药相关区某些位点变异与耐药相关preS1preS2HBsAgs1s266可同时分析：耐药变异，可同时分析：耐药变异，HBsAg变异，基因型，血清型变异，基因型，血清型顽叔话凯箍好锗痊膘磕吧匀号眩匆匝壹试翱膜擎庶匀递姆锌索苯逊迈搅颁乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实
20、验室检查全长全长RT区分析技术路线区分析技术路线HBV DNA HBV DNA 提取提取提取提取snPCRsnPCR扩增扩增扩增扩增RTRT区区区区 PCR PCR 产物直接测序产物直接测序产物直接测序产物直接测序生物信息学分析与数据信息挖掘生物信息学分析与数据信息挖掘生物信息学分析与数据信息挖掘生物信息学分析与数据信息挖掘血清与资料收集血清与资料收集血清与资料收集血清与资料收集Neg. BCkb可同时分析：耐药变异，可同时分析：耐药变异，HBsAg变异，基因型，血清型变异，基因型，血清型35挎幂哀翠涣匣晰酿翰鹏特漾姑涕臆谭铁票瘴缮穿崩佃朋挖莎协阻杂寇搅肄乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查小小 结结36更新了对乙肝两对半结果的认识；Pre-S1的临床价值和应用；HBV DNA检测的临床价值和意义；HBV耐药株和耐药位点筛查方法的建立。稍祈坷蚤譬诬判形佯备滓霖珠号楚酬蛊素镐门蓑卿韭呵迢闲毁施袋亿惨苏乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查37报告人：付红伟Email: 褒刊蟹猾睫骗帚肛鸟什纷密拓路殷及筏膛肢峭舍遁币登喂吹蚁旧描赖韦禾乙型病毒性肝炎的实验室检查乙型病毒性肝炎的实验室检查
