《05第七章mRNA及SSH》由会员分享，可在线阅读，更多相关《05第七章mRNA及SSH（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第七章第七章 目的基因的分离技术目的基因的分离技术第一节第一节nmRNA差异显示技术差异显示技术 （ mRNA differential display reverse transcripion PCR，DDRTPCR）第二节第二节n抑制消减杂交技术抑制消减杂交技术 (Suppression subtractive Hybridization)第一节第一节mRNAmRNA差异显示技术及其应用差异显示技术及其应用一、一、mRNA差别显示技术概述差别显示技术概述nmRNA差异显示技术差异显示技术(mRNA差异显示差异显示PCR、差别显示反转录、差别显示反转录PCR) （ mRNA differen
2、tial display reverse transcripion PCR，DDRTPCR）n1992年，美国波斯顿年，美国波斯顿 Dena Farber癌症研究所癌症研究所nP.Liang 、A.D.Pardee（乳腺癌细胞与正常乳腺细胞）乳腺癌细胞与正常乳腺细胞）n从一对细胞群体或一对基因型各自产生的约从一对细胞群体或一对基因型各自产生的约15000种种mRNA中，有效地鉴中，有效地鉴定并分离出差别表达的基因。定并分离出差别表达的基因。n水稻的抗盐基因、草莓的成熟基因、水稻蔗糖调节基因、拟南芥臭氧诱导基水稻的抗盐基因、草莓的成熟基因、水稻蔗糖调节基因、拟南芥臭氧诱导基因。因。一、一、mRN
3、A差别显示技术概述差别显示技术概述n高等真核生物的基因：高等真核生物的基因： 看家基因看家基因/ /持家基因（持家基因（house-keeping genehouse-keeping gene） 以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动 发育调控基因发育调控基因/ /奢侈基因奢侈基因（developmental regulated gene/luxury genedevelopmental regulated gene/luxury gene） 以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化n在任
4、一细胞表达的基因约占总数的在任一细胞表达的基因约占总数的15%15%，1500015000种不同的种不同的mRNAmRNA一、一、mRNA差别显示技术概述差别显示技术概述n基因的差别表达（基因的差别表达（differential expression)differential expression)n生物的发育与分化、细胞的周期变化、生物体对外界生物的发育与分化、细胞的周期变化、生物体对外界环境压力的反应、个体的衰老与死亡环境压力的反应、个体的衰老与死亡n哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状态下表哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状态下表达，决定了整个生命过程。达，决定了整个生命过程。
5、n比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表达的差比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表达的差异，是克隆特异表达基因的方法。异，是克隆特异表达基因的方法。二、二、DDRT技术的原理技术的原理（一（一）锚定锚定PCRn锚锚定定PCR（anchored PCR）是是PCR技技术术的的一一种种改改进进，一一般般的的PCR实实验验中中需需要要知知道道目目的的基基因因两两端端的的序序列列，而而锚定锚定PCR技术不需要。技术不需要。n所所谓谓的的“锚锚定定”就就是是指指一一端端已已经经定定死死了了，另另一一端端通通过过人人工工合合成成引引物物来来定定，这这就就为为许许多多我我们们对对不不清清楚楚其其5端端
6、区区域域或或是是3端端区区域域的的RNA的的分分析析找找到到了了一一条条良良好好的的途途径。径。二、二、DDRT技术的原理技术的原理 （二（二）基本原理基本原理n 3 端锚定引物：端锚定引物： n5 T12MN 3 （ M为除了为除了T以外的任何一种核苷酸（即以外的任何一种核苷酸（即 AGC)、 N为任何一种核苷酸）为任何一种核苷酸）n5 T11MN 3 可以将整个可以将整个mRNA群体在群体在cDNA水平分成大致相等水平分成大致相等的但序列结构不同的的但序列结构不同的12份亚群体。份亚群体。nPCR扩增扩增n 5- GUCACAGGU N M AAA AA - 33 端锚定引物：端锚定引物：
7、GUCACGU5- AGAAA AA - 35- CGAAA AA - 35- GGAAA AA - 35- UGAAA AA - 35- AUAAA AA - 35- CUAAA AA - 35- GUAAA AA - 35- UUAAA AA - 35- ACAAA AA - 35- CCAAA AA - 35- GCAAA AA - 35- UCAAA AA - 33- TC TTT TT - 53 - GC TTT TT - 53 - CC TTT TT - 53 - AC TTT TT - 5 3 - TA TTT TT - 53 - GA TTT TT - 5 3- CA TTT
8、TT - 53 - AA TTT TT - 5 3- TG TTT TT 53- GG TTT TT - 5 3 - CG TTT TT - 53 - AG TTT TT - 5二、二、DDRT技术的原理技术的原理 （二（二）基本原理基本原理n5 端随机引物端随机引物n5 端随机引物的长度是端随机引物的长度是10个核苷酸，可以同特定细胞类型的个核苷酸，可以同特定细胞类型的总总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，杂交的部位是随群体中的一部分分子发生杂交作用，杂交的部位是随机地分布在距每条新合成的机地分布在距每条新合成的cDNA链链3 端的不同位置上。端的不同位置上。n引物对，引物对，50-1
9、00条条100-500bp之间的之间的DNA条带条带n12种种3 端锚定引物和端锚定引物和 20种种5 端随机引物端随机引物240组引物对就能产组引物对就能产生出生出20 000条条DNA条带。条带。 去除痕量DNADNA逆转录成第一链cDNA差异显示PCR研究样研究样对照样对照样PAGE电泳回收差异条带二次PCR反Northern克 隆测 序Blast分析筛选cDNA文库RACE基因全长基因功能验证提取总RNARNA差异条带标记探针实验程序阳性片段（三）三）DDRTDDRT技术路线技术路线 提取提取B B组织组织RNARNA提取提取A A组织组织RNARNA锚定引物（锚定引物（GTGT151
10、5A,GTA,GT1515G,GTG,GT1515C C）反转录反转录锚定引物（锚定引物（GTGT1515A,GTA,GT1515G,GTG,GT1515C C）反转录反转录总总RNA完整性鉴定完整性鉴定总总RNA完整性鉴定完整性鉴定获得获得cDNA第一链第一链获得获得cDNA第一链第一链随机引物扩增获得随机引物扩增获得cDNA第二链第二链随机引物扩增获得随机引物扩增获得cDNA第二链第二链采用随即引物和锚定引物采用随即引物和锚定引物进行进行PCR扩增扩增采用随即引物和锚定引物采用随即引物和锚定引物进行进行PCR扩增扩增扩增产物进行凝胶电泳分析扩增产物进行凝胶电泳分析处理 对照将差异条带切出并
11、进行回收将差异条带切出并进行回收重新用相同的锚定引物和随即引物进行重新用相同的锚定引物和随即引物进行PCR扩增扩增Northern杂交，杂交，Southern杂交确定差异条带的真实性杂交确定差异条带的真实性克隆进入质粒载体克隆进入质粒载体测序、进入测序、进入GeneBank序列分析序列分析三、三、mRNAmRNA差别显示技术的优缺点差别显示技术的优缺点n1 1、优点、优点n几乎可检测到细胞表达的所有基因几乎可检测到细胞表达的所有基因n可以同时比较多个样品间基因表达的差异可以同时比较多个样品间基因表达的差异 具有简便、灵敏、具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高经过用量少、效率高经过PCR扩扩增一
12、些低丰度的增一些低丰度的 mRNA也可以被检测出来也可以被检测出来 可同时比较多种给定生理状态或不同发育阶段的细可同时比较多种给定生理状态或不同发育阶段的细胞内胞内mRNA三、三、mRNAmRNA差别显示技术的优缺点差别显示技术的优缺点n2 2、缺点、缺点 1）所得特异性）所得特异性cDNA片段假阳性的比例高，片段假阳性的比例高，75% 原因：总原因：总RNA有有DNA污染污染 凝胶中有重叠带凝胶中有重叠带 2）特异）特异cDNA片段太短（片段太短（110bp-450bp)，得不到杂交信号，得不到杂交信号 3）cDNA产物的质量往往较低，在凝胶上产物的质量往往较低，在凝胶上 呈现呈现smear
13、状态状态 4）得到的特异性的）得到的特异性的cDNA 片段非翻译序列片段非翻译序列（3 端端-UTR，保守，保守，Northern 杂杂交易出现假阳性）交易出现假阳性），利用，利用 GeneBank进行数据分析不利进行数据分析不利 5）检测全部）检测全部 mRNA的工作量很大（的工作量很大（T12MN 与与20种随机引物组合种随机引物组合240次次 PCR)三、三、mRNAmRNA差别显示技术的优缺点差别显示技术的优缺点n3 3、技术的改进、技术的改进n1)1)连接酶介导连接酶介导PCRPCR法（法（ligationligation linked PCR ) linked PCR ) T T1
14、212MNMN与与 T T7 7启动子引物启动子引物n2)cDNA2)cDNA亲合捕获法亲合捕获法n 3232P- P- dCTPdCTP取代取代dCTPdCTPn3 3）点杂交筛选法）点杂交筛选法 TATA克隆法克隆法n TATA克隆载体克隆载体nTaqTaq DNADNA聚聚合合酶酶具具有有一一种种非非模模板板依依赖赖性性活活性性，这这种种活活性性可可以以在在PCRPCR产产物物的的3 3端端加加上上一一个个非非配配对对的的脱脱氧氧腺腺嘌嘌呤呤核核苷苷（A A）。根根据据这这一一特特点点研研制制出出了了一一种种线线性性质质粒粒，其其5 5端端各各带带一一个个不不配配对对的的脱脱氧氧胸胸腺腺
15、嘧嘧啶啶核核苷苷（T T），采采用用该该质质粒粒可可将将PCRPCR产产物物以以TATA连连接接的的方方式直接式直接进进行克隆，即行克隆，即TATA克隆。克隆。 三、三、mRNAmRNA差别显示技术的优缺点差别显示技术的优缺点n3 3、技术的改进、技术的改进n4 4）随机引物法随机引物法n5 5）简化锚定引物法简化锚定引物法 GT GT1212A A、GTGT1212G G、GTGT1212C C 四、四、mRNAmRNA差别显示技术的应用差别显示技术的应用n1 1、研究植物不同分化发育阶段的基因表达差异、研究植物不同分化发育阶段的基因表达差异n VielleVielle、 CalzadaCa
16、lzada 、NuccioNuccion狼尾草的有性生殖与无融合生殖的子房狼尾草的有性生殖与无融合生殖的子房n2 2个锚定引物，个锚定引物，2020个随机引物个随机引物n22682268个个cDNAcDNA，3 3个基因在有性生殖的子房中特异性的表达个基因在有性生殖的子房中特异性的表达 四、四、mRNAmRNA差别显示技术的应用差别显示技术的应用2 2、基因的鉴定与克隆、基因的鉴定与克隆水稻的赤霉素调节基因水稻的赤霉素调节基因 赤霉素处理的水稻：诱导赤霉素处理的水稻：诱导 不诱导不诱导 mRNA mRNA的表达量相差的表达量相差1010倍倍 四、四、mRNAmRNA差别显示技术的应用差别显示技
17、术的应用n3 3、研究激素对植物发育的影响、研究激素对植物发育的影响n娄沂春水稻叶绿体娄沂春水稻叶绿体ATPATP合成酶受赤霉素诱导的合成酶受赤霉素诱导的差别表达基因，证明了赤霉素诱导水稻产生生差别表达基因，证明了赤霉素诱导水稻产生生理发应过程涉及了叶绿体基因表达理发应过程涉及了叶绿体基因表达 四、四、mRNAmRNA差别显示技术的应用差别显示技术的应用n4 4、植物抗逆性机理的研究、植物抗逆性机理的研究n抗病虫基因抗病虫基因n盐胁迫盐胁迫n高低温胁迫高低温胁迫 四、四、mRNAmRNA差别显示技术的应用差别显示技术的应用n5 5、在营养学中的应用、在营养学中的应用 营养物质的作用与基因调空有
18、关，当某种营养缺乏营养物质的作用与基因调空有关，当某种营养缺乏或过多时，在分子水平上就表现为某个或某些基因或过多时，在分子水平上就表现为某个或某些基因的开启、关闭或表达量的变化。的开启、关闭或表达量的变化。铜在营养学中的作用铜在营养学中的作用缺铜缺铜6周的大鼠肝脏周的大鼠肝脏mRNA正常大鼠肝脏正常大鼠肝脏mRNA10个个cDNA片段的差异片段的差异表达量是对照的表达量是对照的1.2倍倍新的未知基因新的未知基因五、五、mRNAmRNA差别显示在甜菜无融合生殖差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用基因克隆研究中的应用n被子植物无融合生殖使其子代继承了母本所有的遗传特性，并形成遗传上稳定的，
19、可由种子繁殖的无性系。由此可以保存优异的基因型，固定杂种优势，并可能使一些重要的作物实现“一系法”育种；如果无融合生殖被很好地利用，它将是二十世纪六十年代“绿色革命”之后的又一次农业革命无性生殖革命。 五、五、mRNAmRNA差别显示在甜菜无融合生殖差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用基因克隆研究中的应用 植物界中，无融合生殖广泛存在。我们通过栽培甜菜（Beta vulgaris L.）与白花甜菜（B.corollifora Zoss）远缘杂交获得了真实杂种，经遗传回交获得了带有白花甜菜染色体的完整单体附加系系列，并且通过单体附加系传递研究，筛选出近100%高频率传递的单体附加系M14
20、品系。经过标记基因杂交、传递遗传形态观察、胚胎学及分子生物学鉴定它们是兼性无融合生殖的,1999年3月经专家鉴定为无融合生殖品系；同时无融合生殖基因已经定位在这条附加的白花甜菜染色体上，因此M14品系是克隆无融合生殖基因的极为难得的材料。 甜菜单体附加系甜菜单体附加系M14M14品系品系 ( ( VV+1C, 2n = 19 = 18+1, VV+1C, 2n = 19 = 18+1, 箭头所指为附加的白花甜菜染色体箭头所指为附加的白花甜菜染色体 ) )五、五、mRNAmRNA差别显示在甜菜无融合生殖差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用基因克隆研究中的应用n采用mRNA差异显示技术比较
21、甜菜无融合生殖系及正常进行有性生殖的二倍体栽培植株在无融合生殖基因表达的三个关键时期，即大孢子母细胞减数分裂期、助细胞提前退化期、次生核自行分裂期mRNA的差异，是进行克隆无融合生殖相关基因的比较有效的方法 五、五、mRNAmRNA差别显示在甜菜无融合生殖差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用基因克隆研究中的应用n1、对总对总RNA进行逆转进行逆转录录反应，合成反应，合成cDNA第一链第一链。 （1）共采用三种锚定引物：T15A、T15G、T15C （2）制备锚定引物-RNA混合物，变性RNA样品 DEPC-treated H2O 14.3 l 锚定引物 2.2 l Total RNA（
22、g/ l） 2.5 l 混合物 7.5 l混匀，将离心管置于7010分钟，结束后立即放于冰上。 （3）制备2X反应混合液，放置冰上，体系如下： DEPC treated H2O 4.2 l 10XSynthesis buffer 4.2 l 25mM MgCL2 4.2 l 0.1mM DDT 4.2 l 10mM dNTPs 2.1 l Super script II 2.1 l 混匀后，取10 l该混合液加入到“”中混匀。（4）将混匀后的试管置于PCR热循环仪内，按下列程序合成cDNA第一链。 25 10min,42 50min ,90 5min ,4 贮存。（5）cDNA第一链合成结束后
23、，于试管内加入76 l TE，4 l 50 M的相同锚定引物，-20 贮存。2、PCR反应合成双链反应合成双链cDNA片段片段 （1） 配制Master Mix I ddH2O 12.6 l X2N 10xPCR Buffer 2.0 l X2N 25mM MgCL2 1.2 l X2N 10mM dNTPs 0.25 l X2N Taq DNA Polymerase (5U/ l ) 0.2 l X2N 混匀，离心。（2）配制 Master Mix II Master Mix I 17.0 x N l cDNA第一链 2.0 x N l （3）取1.0 l 10碱基任意引物（10 M），分别
24、加到0.5 ml离心管内。（4）取19.0 l Mix II，分别加入到每一个相应的含 1.0 l任意引物离心管内，彻底混匀。PCR反应程序：反应程序：94,5min;94,30sec;42,lmin;72,30sec , 40cycle。 五、五、mRNAmRNA差别显示在甜菜无融合生殖差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用基因克隆研究中的应用3 3、PCRPCR产物利用产物利用4%4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，分离出的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，分离出M M1414与与A A2Y2Y相比较而对应的差异片段。相比较而对应的差异片段。4 4、将差异片进行回收、转化。克隆载体为、将
25、差异片进行回收、转化。克隆载体为 PMD18-T VectorPMD18-T Vector， 按照按照-互补筛选原则，挑取部分白色菌落为模板，按原程序互补筛选原则，挑取部分白色菌落为模板，按原程序进行进行PCRPCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析，有插入片段的菌落应扩扩增，琼脂糖凝胶电泳分析，有插入片段的菌落应扩增出一条与插入片段大小一致的片段，挑取阳性克隆菌落，增出一条与插入片段大小一致的片段，挑取阳性克隆菌落，穿刺培养后由上海博亚生物技术有限公司测序穿刺培养后由上海博亚生物技术有限公司测序 ，测序后进入，测序后进入GenBankGenBank进行序列同源性比较。进行序列同源性比较。 5、经与Ge
26、nBank数据库比较，发现AP-3片段与B.Vulgaris mRNA for small GTP-binding protein 具有同源性。种蛋白基因被称为分子开关，但是否与无融合基因的表达有关，需要进一步研究而AP-4为未知基因而。第二节第二节抑制消减杂交技术抑制消减杂交技术( (Suppression subtractive Hybridization)Suppression subtractive Hybridization)一、一、差别杂交差别杂交（Differential Hybridization)n差别筛选（差别筛选（ differential Screening) 适用于分
27、离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因、适用于分离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、诱导表达的基因受生长因子调节的基因、诱导表达的基因n技术原理技术原理 拥有两种不同的细胞群体：目的基因正常表达拥有两种不同的细胞群体：目的基因正常表达 目的基因不表达目的基因不表达差别杂交的局限性差别杂交的局限性n灵敏度比较低n筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的克隆片段n重复性差二、扣除杂交二、扣除杂交(subtractive hybridization)n扣除cDNA克隆n减法杂交n基因组DNA杂交 三、抑制消减杂交技术三、抑制消减杂交技术( (Suppression Suppres
28、sion subtractiveHybridizationsubtractiveHybridization) )n抑制消减杂交是1996年Diatchenko提出的一种建立在RDA基础上的差异表达基因分离方法。n代表性差别分析(representation difference analysis,RDA)n通过突变型与野生型基因组之间的差异比较来分离和鉴定突变基因的方法。ncDNA RDA以RDA为基础，以mRNA表达水平的差异作为差减目标。抑制消减杂交技术的基本原理抑制消减杂交技术的基本原理n该方法运用了杂交二级动力学原理，及高丰度的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA
29、，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。而抑制PCR则利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性的抑制了非目的基因片段的扩增。这样既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制PCR技术进行高效的动力学富集 。抑制消减杂交技术主要优点抑制消减杂交技术主要优点 该方法的最大优点是降低了假阳性率 SSH方法具有高度敏感性 降低了起始样品的使用量 在一次SSH反应中,可以同时分离出成百个差异表达基因23，极大地提高了检测效率 提高了基因克隆的效率，由于使用4碱基内切酶使得基因（组）的复杂程度降低。
30、 该技术还具有背景低、重复性强等优点 程序相对简单，操作简便易行 SSH技术的主要缺陷技术的主要缺陷 SSH技术需要较多的起始材料且更多地依赖于PCR技术，若是mRNA量不够，低丰度的差异表达基因cDNA可能检测不到 消减库中的cDNA经过Rsal等限制酶消化后，不再是全长cDNA 不能同时对数个材料之间进行比较,材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能有效被检测 完全无酶切位点的片段或酶切位点较少的基因组无法用SSH技术筛选 利用抑制消减杂交所获得的片段，须经过Nothern杂交或反Nothern杂交来进一步鉴定，去除假阳性 SSH技术的主要应用技术的主要应用 在肿瘤基因克隆中的应用 在生殖与发育基因调控中的应用 在免疫调控基因研究中的应用 在代谢调控机理研究中的应用 在原核生物分子遗传分析中的应用 在植物基因克隆上的应用
