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1、第一章第一章PCR技技术原理原理整理课件定定义：PCR技技术又称聚合又称聚合酶链式反式反应（polymerasechainreaction)，是通，是通过模模拟体内体内DNA复制复制的的方式，在体外方式，在体外选择性地将性地将DNA某个特殊区域某个特殊区域扩增出来的技增出来的技术。nPCR技技术:整理课件PCR概念的提出概念的提出n1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。n1983，Kary Mullisn1993年获得诺贝尔奖整理课件引物引物引物引物M
2、ullis的构思DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合聚合酶酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段整理课件技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。整理课件thermusaquaticusTaq DNA聚合酶的发现1988年年Saiki等从温泉等从温泉（Hotspring）中分离）中分离的一株水生嗜的一株水生嗜热杆菌杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐中提取到一种耐热DNA聚合聚合酶。整理课件耐高温，耐高温，在在热变性性时不会被不会被钝化，不必在每次化，不必在每次扩增反增反应后再加后再加新新酶。大大提高了
3、大大提高了扩增片段特异性和增片段特异性和扩增效率，增加了增效率，增加了扩增增长度度(2.0Kb)。酶命名命名为TaqDNA多聚多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此。此酶的的发现使被使被PCR广泛广泛应用。用。在在1989年，年，Science将将PCR中的中的TaqDNA多聚多聚酶命命名名为当年的当年的风云分子云分子(Moleculeoftheyear) Taq DNA聚合酶优点整理课件1 1 1 1、PCRPCRPCRPCR技技技技术术的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理在微量离心管中在微量离心管中在微量离心管中在微量离心管中, , , ,加入适量的加入适量的加入适量的加入适量
4、的缓缓冲液冲液冲液冲液, , , , 微量的微量的微量的微量的模板模板模板模板DNADNADNADNA, , , ,四种脱氧四种脱氧四种脱氧四种脱氧单单核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸, , , ,耐耐耐耐热热性性性性多聚多聚多聚多聚酶酶, , , , 一一一一对对合成合成合成合成DNADNADNADNA的的的的引物引物引物引物, , , ,通通通通过过高温高温高温高温变变性、性、性、性、低温退火低温退火低温退火低温退火和和和和中温延伸中温延伸中温延伸中温延伸三个三个三个三个阶阶段段段段为为一个循一个循一个循一个循环环的反的反的反的反应过应过程程程程, , , ,每一次循每一次循每一次循每一次循环环使
5、特异区段的基因拷使特异区段的基因拷使特异区段的基因拷使特异区段的基因拷贝贝数放大一倍数放大一倍数放大一倍数放大一倍, , , ,一般一般一般一般样样品是品是品是品是经过经过30303030次循次循次循次循环环, , , ,最最最最终终使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍; ; ; ; 扩扩增了特异区段的增了特异区段的增了特异区段的增了特异区段的DNADNADNADNA带带。 PCR技术的基本原理和工作方式整理课件模板DNA95工作方式整理课件PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点9550引物1引物2DNA引物整理课件PCR的基本原
6、理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶整理课件PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始整理课件PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaq整理课件PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束整理课件PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增整理课件基本材料模板：模板：单链或双或双链DNA引物：引物：16-30bp合成的寡核苷酸合成的寡核
7、苷酸DNA聚合聚合酶：耐：耐热的的DNA聚合聚合酶底物：四种脱氧三磷酸核苷底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)Mg2+Mg2+： DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶的激活的激活的激活的激活剂剂整理课件反应程序949630-3预变性（使模板性（使模板DNA充分充分变性）性）9430变性性50-6030-1复性（使引物与模板充分退火）复性（使引物与模板充分退火）72n(按按1扩增增1kb计算）延伸算）延伸723-7总的延伸（使的延伸（使产物延伸完整）物延伸完整）4-10保存保存 25-35个循个循环整理课件要素解析1）复性和延伸复性和延伸温度温度 复性的温度是
8、复性的温度是PCR扩增是否增是否顺利的关利的关键因素，通常因素，通常在在50-60之之间。具体的温度主要由引物的。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于决定（低于Tm值2-3）。）。延伸温度延伸温度绝大多数大多数设定定为72。如果复性的温度很。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，置成同一温度，变成二步法成二步法PCR。2）反）反应时间 变性一般使用性一般使用30秒秒钟，如果模板的，如果模板的G+C含量含量较高，高，或直接用或直接用细胞做模板，胞做模板，变性性时间可适当延可适当延长。复性复性时间有有30秒种一般是足秒种一般是足够的。的。延伸延伸
9、时间由由扩增增产物的大小决定，一般采用物的大小决定，一般采用1kb用用1分分钟来保来保证充足的充足的时间。 整理课件要素解析3）循）循环次数次数循循环次数主要与模板的起始数量有关，循次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常数通常为2535次。次。平台效平台效应（plateaueffect）：）：PCR扩增增过程后期出程后期出现的的产物的物的积累按减弱的指数速率增累按减弱的指数速率增长的的现象。象。原因：底物和引物的原因：底物和引物的浓度已度已经降低，降低，dNTP和和DNA聚合聚合酶的的稳定性或活性降低定性或活性降低，产生的焦磷酸会出生的焦磷酸会出现末末端端产物抑制作用，非特异性物抑制作用，非
10、特异性产物或引物的二聚体出物或引物的二聚体出现非特异性非特异性竞争作用，争作用，扩增增产物自身复性，高物自身复性，高浓度度扩增增产物物变性不性不彻底。底。 整理课件要素解析4）PCR反反应液的配制液的配制顺序序最后加入最后加入DNA聚合聚合酶。早期的早期的PCR仪没有没有带加加热的盖子，要求在反的盖子，要求在反应液上液上覆盖一覆盖一层矿物油，防止水分蒸物油，防止水分蒸发。热启启动（hotstart）PCR操作方式可操作方式可较好解决非特异好解决非特异性性扩增的增的问题。 整理课件 要素解析5）各种成分各种成分各种成分各种成分浓浓度作用：度作用：度作用：度作用：缓缓冲液：提供合适的冲液：提供合适
11、的冲液：提供合适的冲液：提供合适的PHPH值值和和和和DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶的激活的激活的激活的激活剂剂10mMTrisHCl10mMTrisHCl（ ），），），），MgCl2，50mMK+ dNTPdNTP（底物）：等摩（底物）：等摩（底物）：等摩（底物）：等摩尔浓尔浓度的度的度的度的 44种种种种 dNTPdNTP（即即即即 dATPdATP、dTTPdTTP、dCTPdCTP和和和和dGTPdGTP），），），），终浓终浓度一般度一般度一般度一般为为 200mM200mM（即（即（即（即饱饱和和和和浓浓度），度），度），度），dNTPdNTP的的的的浓浓度会影响度会影响度会影
12、响度会影响扩扩增的增的增的增的产产量、特异性和忠量、特异性和忠量、特异性和忠量、特异性和忠实实性。性。性。性。 引物：引物：引物：引物： 1 1M/LM/Ln n 整理课件要素解析模板：模板：模板：模板：单单、双、双、双、双链链DNADNA均可。均可。均可。均可。 模板的数量会直接影响模板的数量会直接影响模板的数量会直接影响模板的数量会直接影响扩扩增的效果。增的效果。增的效果。增的效果。模板模板模板模板浓浓度度度度过过高会高会高会高会导导致反致反致反致反应应的非特异性增加。的非特异性增加。的非特异性增加。的非特异性增加。DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶：最常用的是最常用的是最常用的是最常用的是
13、TaqDNATaqDNA聚合聚合聚合聚合酶酶，最适反，最适反，最适反，最适反应应温度温度温度温度7272。PfuDNAPfuDNA聚合聚合聚合聚合酶酶：是目前使用最广泛的具有：是目前使用最广泛的具有：是目前使用最广泛的具有：是目前使用最广泛的具有 3-53-5外切活性的外切活性的外切活性的外切活性的 PCRPCR酶酶，目前目前目前目前为为止止止止错错配率最低的高温配率最低的高温配率最低的高温配率最低的高温DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶。酶酶量增加使反量增加使反量增加使反量增加使反应应特异性下降特异性下降特异性下降特异性下降; ;酶酶量量量量过过少影响反少影响反少影响反少影响反应产应产量。量。
14、量。量。整理课件长度：至少度：至少16bp，通常，通常为18-25bp。更短的引物一般会降低。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高增的特异性，但会提高扩增的有效性增的有效性引物的解引物的解链温度：两个引物之温度：两个引物之间的的Tm值差异最好在差异最好在2-5。对于小于于小于20个碱基的引物其个碱基的引物其Tm值可用可用简易公式易公式计算，即算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。）。避免引物内部或引物之避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特形成引物二聚体（特别是引物的是引物的3端）。端）。G+C含量：尽量控制在含量：尽量控制在40%至至60%之之间，4种碱基的分布种碱基的分布应尽可能
15、均匀。尽量避免尽可能均匀。尽量避免嘌呤或呤或嘧啶的的连续排列，以及排列，以及T在在3末末端的重复排列。端的重复排列。引物的引物的3末端最好是末端最好是G或或C，但不要，但不要GC连排。排。要素解析：引物设计整理课件6. PCR技术特点n n1）高度的灵敏性3030轮轮循循环环扩扩增量达增量达2 23030个拷个拷贝贝（10109 9拷拷贝贝）PCRPCR产产物每物每轮轮循循环环增加一倍增加一倍整理课件 引物的序列及其与模板引物的序列及其与模板结结合的特异性是决定合的特异性是决定PCRPCR反反应应结结果的关果的关键键。 引物引物设计设计的最大原的最大原则则是最大限度地提高是最大限度地提高扩扩增
16、效率和特增效率和特异性；同异性；同时时尽可能减少非特异性尽可能减少非特异性扩扩增。增。引物引物6. PCR技术特点n n1）特异性整理课件3 3 3 3）操作）操作）操作）操作简简便易行便易行便易行便易行PCRPCRPCRPCR扩扩增法增法增法增法, , , ,只需要只需要只需要只需要数小数小数小数小时时, , , ,就可以用就可以用就可以用就可以用电电泳法泳法泳法泳法检检出出出出1g1g1g1g基基基基因因因因组组DNADNADNADNA中中中中仅仅含数个拷含数个拷含数个拷含数个拷贝贝的模板序列。的模板序列。的模板序列。的模板序列。 6. PCR技术特点整理课件4 4 4 4 ）用途广泛）用
17、途广泛）用途广泛）用途广泛生命学科生命学科生命学科生命学科医学工程医学工程医学工程医学工程遗传遗传工程工程工程工程疾病疾病疾病疾病诊诊断断断断法医学法医学法医学法医学考古学考古学考古学考古学6. PCR技术特点整理课件1、2Taq PCR MasterMix2、DNA模板3、引物：本次实验所用材料材料整理课件PCR反应体系试剂体体积（l）2TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板模板100ng1ddH2Oto25整理课件PCR反应程序955min1个循个循环9530sec35个循个循环6030sec7230sec7210min1个循个循环4hold整理课件琼
18、脂糖凝胶电泳n琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。整理课件琼脂糖n琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中整理课件电荷效应n琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还
19、取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中整理课件分子筛效应nDNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。整理课件线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的百分脂糖凝胶的百分浓度（度（%）线状状DNA分子的有效分子的有效范范围（Kb）0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.54
20、0.22.030.1整理课件实验材料n【材料材料】n1. 琼脂糖n2. 10mg/ml EBn3. markern4. TAETris242gCH3COOH57.1ml0.5MEDTA（pH8.0）100mlddH2Oto1000ml整理课件实验步骤n【步步骤】n1、称1.5g琼脂糖，加100ml电泳缓冲液（1TAE）加热熔化。n2、胶液冷却至60时，加入4l EB，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。n3、待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于水平电泳槽中，加入1TAE，让液面高于胶面至少1mm。n4、上样。n5、接通电泳仪电源，1-5V/cm电压（一般80100V），开始电泳。n6、
21、根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取出凝胶，使用凝胶成像仪进行观察或拍照。整理课件琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳DNA回收回收整理课件实验原理离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低低PH值、高浓度盐（盐酸胍，NaI, NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程，提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已经
22、有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。整理课件试剂盒组成及储存方法名称 用途溶胶/结合液 DA 溶胶（红色）结合液DD无色 与DA混合后变为黄色洗涤液W1洗涤液去盐液W2洗脱盐离子（75% EtOH）洗脱液EB洗脱DNA 吸附柱 AC 结合DNA收集管 （2ml） 收集废液整理课件实验步骤整理课件整理课件注意事项n切胶回收DNA时，应尽量使用能量较低的长波长紫外线，并缩短操作时间，以减少紫外线对DNA的损伤。n第一次使用前先在漂洗液W2中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记，以免多次加入。n各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。n所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。n适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30l将降低洗脱效率。整理课件凝胶电泳检测整理课件
