《Waters高效液相色谱维护与保养》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Waters高效液相色谱维护与保养（42页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、WatersWaters液相色谱维护保养液相色谱维护保养以下课件是我在使用、操作、高效液以下课件是我在使用、操作、高效液相色谱仪十年中积累的经验，以及集相色谱仪十年中积累的经验，以及集合外部学习的经验所写，如有讲的不合外部学习的经验所写，如有讲的不好、错误之处，请大家及时指出，我好、错误之处，请大家及时指出，我们共同学习！们共同学习！质检：质检：WatersWaters高效液相色谱常见故障与解高效液相色谱常见故障与解析析第一部分常用术语第一部分常用术语第二部简述第二部简述HPLCHPLC的组成的组成第三部分主要讲液相常见第三部分主要讲液相常见故障与解析故障与解析| |第四部分第四部分简简谈示差
2、检测的原理谈示差检测的原理第五部分：色谱柱的维护与保养第五部分：色谱柱的维护与保养第一部分术语1、液相色谱法：就是用液体作为流动相的色谱法。2、固定相：在色谱法中，静止不动的一相（固体或液体）称为固定相为固定相3、流动相：能运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相4、色谱图：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图。纵坐标为信号强度（通常我们所说的样品浓度），横坐标为保留时间。 5、基线：在无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化而产生的曲线术语6、基线噪声:没有溶质通过检测器时，检测器输出信号的随机扰动变化。（就是没有打进样品而直接查看基线时所产生的杂峰）7、基线漂移：基线随
3、时间的增加朝单一方向的偏离称为漂移。反映的是信号连续的递增和递减。产生原因：电源电压不稳、色谱系统未达到平衡、固定相流失、流动相的变化、温度和流量的波动术语8、色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线。9、峰底：峰的起点与终点间的直线10、峰高：在峰的两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离。11、半峰宽（W1/2）：通过峰高的中点做平行与峰底的直线，与其峰两侧相交两点间的距离。12、峰面积（A）：峰与峰底间的面积，又称作响应值。13、拖尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰。14、前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰术语15、死时间（t0）:不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所
4、需的时间16、保留时间（tR）：组分从进样到出峰最大之所需的时间。17、死体积（V0）：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的流动相的体积18、柱外体积：从进样系统到检测器之间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的体积。19、淋洗体积：从进样开始计算的通过色谱柱的实际淋洗体积术语20、反相色谱柱反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）术语21、排
5、阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。它类似于分子筛的作用，按分子大小进行分离。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。例如：我们常用的 ks-802色谱柱第一部分术语22、面积归一法：将所有峰的面积总和定为1，测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。是包含水分在内的一个计算结果。第一大部分
6、术语23 .面积外标法：外表法就是用标准品的峰面积面积或峰高与其对应的浓度做一条标准曲线,测出样品的峰面积面积或峰高,在标准曲线上查出其对应的浓度,这是最常用的一种定量方法 通过进标样建立一个校正曲线（一般是6针标样）。校正曲线的横坐标是标样的浓度（含量），纵坐标是峰面积面积；校正曲线就相当于：Y=aX+b的公式。校正曲线建立好后样品的峰面积面积带入方程就可以得到相应的浓度（含量）。 数据分析系统输液系统输液系统泵以及流泵以及流动相动相进样系统进样系统进样阀进样阀分离系统分离系统-色谱柱色谱柱检测系统检测系统11第二部分第二部分HPLC的组成的组成数据处理系统数据处理系统Waters515泵输
7、液系统输液系统输输13输出流量恒定输出流量恒定输出流量恒定输出流量恒定压力平稳压力平稳压力平稳压力平稳足够的动力足够的动力足够的动力足够的动力高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵Waters2414示差检测器15检测系统检测系统进样系统进样系统16手动进样手动进样数据处理系统N2000色谱工作站18第三部分液相常见故第三部分液相常见故障及解决方案障及解决方案19从泵的压力从泵的压力变化推测变化推测原原原原 因因因因 解决方法解决方法解决方法解决方法 1 1 1 1、电电电电源源源源问题问题问题问题 1 1 1 1、接通、接通、接通、接通电电电电源，开机源，开机源，开机源，开机 2 2 2
8、2、保、保、保、保险丝险丝险丝险丝被被被被烧烧烧烧坏坏坏坏 2 2 2 2、更、更、更、更换换换换保保保保险丝险丝险丝险丝 3 3 3 3、柱塞杆折断、柱塞杆折断、柱塞杆折断、柱塞杆折断 4 4 4 4、更、更、更、更换换换换柱塞杆柱塞杆柱塞杆柱塞杆 4 4 4 4、泵头泵头泵头泵头内有空气内有空气内有空气内有空气 5 5 5 5、启、启、启、启动泵动泵动泵动泵抽出空气抽出空气抽出空气抽出空气5 5 5 5、流、流、流、流动动动动相不足相不足相不足相不足 6 6、吸吸吸吸滤头滤头滤头滤头堵堵堵堵5 5 5 5、补补补补充流充流充流充流动动动动相相相相 6 6 6 6、更更更更换换换换或超声入口
9、或超声入口或超声入口或超声入口滤头滤头滤头滤头 7 7 7 7、单单单单向向向向阀损阀损阀损阀损坏坏坏坏 7 7 7 7、更、更、更、更换单换单换单换单向向向向阀阀阀阀 8 8 8 8、漏液、漏液、漏液、漏液 8 8 8 8、拧紧拧紧拧紧拧紧或更或更或更或更换换换换手手手手紧紧紧紧接接接接头头头头 A A、 泵内没有压力显示，没有流动相流动泵内没有压力显示，没有流动相流动泵内没有压力显示，没有流动相流动泵内没有压力显示，没有流动相流动20从压力变化推测从压力变化推测原原原原 因因因因 解决方法解决方法解决方法解决方法 1 1 1 1、电电电电源源源源问题问题问题问题 1 1 1 1、接通、接通
10、、接通、接通电电电电源，开机源，开机源，开机源，开机 2 2 2 2、保、保、保、保险丝险丝险丝险丝被被被被烧烧烧烧坏坏坏坏 2 2 2 2、更、更、更、更换换换换保保保保险丝险丝险丝险丝 3 3 3 3、柱塞杆折断、柱塞杆折断、柱塞杆折断、柱塞杆折断 4 4 4 4、更、更、更、更换换换换柱塞杆柱塞杆柱塞杆柱塞杆 4 4 4 4、泵头泵头泵头泵头内有空气内有空气内有空气内有空气 5 5 5 5、启、启、启、启动泵动泵动泵动泵抽出空气抽出空气抽出空气抽出空气5 5 5 5、流、流、流、流动动动动相不足相不足相不足相不足 6 6、吸吸吸吸滤头滤头滤头滤头堵堵堵堵5 5 5 5、补补补补充流充流充
11、流充流动动动动相相相相 6 6 6 6、更更更更换换换换或超声入口或超声入口或超声入口或超声入口滤头滤头滤头滤头 7 7 7 7、单单单单向向向向阀损阀损阀损阀损坏坏坏坏 7 7 7 7、更、更、更、更换单换单换单换单向向向向阀阀阀阀 8 8 8 8、漏液、漏液、漏液、漏液 8 8 8 8、拧紧拧紧拧紧拧紧或更或更或更或更换换换换手手手手紧紧紧紧接接接接头头头头 A A、 没有压力显示，没有流动相流动没有压力显示，没有流动相流动没有压力显示，没有流动相流动没有压力显示，没有流动相流动21原 因 解决方法 1、柱塞杆折断1、更换柱塞杆 2、压力传感器损坏 2、更换压力传感器 B B、 流流动相流
12、相流动正常，但没有正常，但没有压力力显示示 B B、 泵内有液流出，但使没有压力显示泵内有液流出，但使没有压力显示泵内有液流出，但使没有压力显示泵内有液流出，但使没有压力显示22原 因 解决方法 1、流速设定过高 1、调整流速设定 2、柱前筛板堵塞 2、a、反冲色谱柱 b、更换色谱柱 3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀 3、a、使用恰当的流动相 b、冲洗色谱柱 4、色谱柱选择不当 4、选择恰当的色谱柱 5、柱温过低 5、提高温度 6、保护柱阻塞 6、清洗或更换保护柱 7、在线过滤器阻塞 7、清洗或更换在线过滤器 C C、压力高、压力高、压力高、压力高“ “堵堵堵堵” ”23原 因 解决方法
13、1、流速设定过低 1、调整流速 2、系统漏液 2、确定漏液位置并维修 3、色谱柱选择不当 3、选择恰当的色谱柱 4、柱温过高 4、降低温度 5、压力传感器或工作站 失常5、更换压力传感器，重装工作站或系统。 D、压力低、压力低“漏漏”24H H、 压力波力波动 原 因 解决方法 1、泵中有气体 1、a、溶剂脱气 b、从泵中除去气体 2、单向阀损坏 2、超声或更换单向阀 3、泵密封损坏 3、更换泵密封 圈4、系统漏液 4、确定漏液位置并维修 5、使用梯度洗脱 5、由于流动相粘度的变化引起， 充分平衡系统 E E、压力波动、压力波动、压力波动、压力波动25从色谱图的异常情况推测从色谱图的异常情况推
14、测A A、基线漂移、基线漂移、基线漂移、基线漂移原 因 解决方法 1、温度变化1、室内恒温，或使用柱温箱2、系统未平衡2、充分用流动相平衡3、流动相组成变化3、溶剂瓶密封，现用现配4、梯度洗脱4、空白梯度充分平衡系统5、色谱柱键合相流失 5、更换色谱柱26B B、基线噪声、基线噪声、基线噪声、基线噪声“ “气泡，污染气泡，污染气泡，污染气泡，污染” ”原 因 解决方法 1、系统内存在气泡（流动相，检测器，管路，泵）1、流动相脱气，冲洗系统2、系统污染2、逐一排查，冲洗系统3、流动相不互溶3、选择互溶的流动相4、混合器混合效果不好4、维修或更换混合器，或者不走梯度时用单一泵5、氘灯能量不足5、更
15、换氘灯27C.C.保留时间变化保留时间变化保留时间变化保留时间变化“ “柱压，流速柱压，流速柱压，流速柱压，流速” ”原 因 解决方法 1、温度变化1、室内恒温，或使用柱温箱2、系统未平衡2、充分用流动相平衡3、流动相组成变化3、溶剂瓶密封，现用现配4、色谱柱污染4、强溶剂洗脱5、色谱柱寿命6、流速变化7、柱压变化5、更换色谱柱6、排查引起流速改变的因素7、排查引起柱压改变的因素如何判断入口单向阀是否正常的简易方法如何判断入口单向阀是否正常的简易方法如何判断入口单向阀是否正常的简易方法如何判断入口单向阀是否正常的简易方法？ 在泵运行过程中将溶剂吸滤头从流动相中拿出，在泵运行过程中将溶剂吸滤头从
16、流动相中拿出，放进一小段气泡进入溶剂管路，进行观察。放进一小段气泡进入溶剂管路，进行观察。 气泡运行状态气泡运行状态判断判断措施措施一走一停一走一停正常正常一走一停一退一走一停一退入口单向阀受到污染，入口单向阀受到污染，单向效果不好，有部单向效果不好，有部分回流分回流超声清洗超声清洗一走一退一走一退入口单向阀失效，无入口单向阀失效，无单向作用单向作用清洗或更换清洗或更换样品处理：样品处理：使用流动相溶解样品，保证样品的溶解度，减少使用流动相溶解样品，保证样品的溶解度，减少 溶剂峰；溶剂峰； 进样前使用进样前使用0.45um 或更小的膜进行过或更小的膜进行过滤。滤。手动进样：手动进样：应使用液相
17、色谱专用平头进样针应使用液相色谱专用平头进样针 吸液至少大于吸液至少大于5-10倍定量环体积倍定量环体积 转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置间位置29进样的注意事项进样的注意事项2414示差检测器原理示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比 示差折光检测器原理示差折光检测器原理检测器的光路是由光源、凸镜、检测池、反射镜、平板玻璃、双光敏
18、电阻等主要部件组成，检测池有参比，测量两个池室，它们对光路来说是串联的。示差检测器原理第四部分色谱柱的维护与保养1、钙柱：此色谱柱由钙基树脂填装而成，氢离子或其它离子会取代钙离子，或是引起与柱中糖的转换，尤其是像蔗糖这样易于转换的糖，因此推荐在流动相中加入一定量的钙离子不保持平衡和防止与样品的转换。要保持装流动相的瓶子干净，有盖子，且新鲜，流动相需要每24小时重新配制。 新的钙柱使用注意事项2新色谱柱的使用：为了保证新柱子能在分析使用之前得到足够的钙离子的平衡 1）将柱子按照通常使用的反方向安装（标签上的箭头指向柱子的入端口）；2）用至少100ml的0.001M EDTA钙盐溶液在90 用0.
19、5ml/min流速反冲柱子，500mg/L的钙盐的浓度大约为0.001M；3）将柱子反过来（回到通常的流动方向）用分析所用流动相冲柱子，（用与上一上步骤同样的条件）直到基线平稳方可使用。钙柱再生的时间3、柱子再生的时间：根据相关的样品含有较多重金属和过渡金属元素或是有机酸的样品越是需要经常地对柱子进行再生，因为它们会与柱子发生转换。检测是否需要再生可以通过注射蔗糖来测试柱子的置换，如果蔗糖的峰有明显拖尾，那么柱子需要做以下处理： 第四部分色谱柱的维护与保养4柱子的再生步骤： 1）配制500ml的再生溶液（500mg EDTA_Ca/L2）把柱子流路方向反过来，在90下以0.5ml/min的流速
20、冲洗一整夜；3）再生之后回到正常方向使用。当柱子反冲时，很重要的一点是需要保持溶剂的温度从而确保正确的冲洗，用冷的溶剂将会延缓冲洗的过程。使用钙柱注意的事项5、通常推荐压力不超过2000psi，最大流速不超过0.6ml/min(70)。不要在流动相中使用氯化钙，硝酸钙以及其它强酸的钙盐，这样会腐蚀柱子，破坏填料。 柱子的温度不要超过95。通常高温会带来高的分辨率，但在9095之间几乎没有变化，70以下对许多糖的异构体的分离不能提供足够的分离度，对于乙醇的定量，柱温应在75 KS-802钠型柱新色谱柱钠型柱以ks802柱子为代表：1、新色谱柱的使用：为了保证新柱子能在分析使用之前要得到足够的钠离
21、子的平衡 1）将柱子按照通常使用的反方向安装（标签上的箭头指向柱子的入端口）；2）用至少100ml的0.002M NAOH溶液在50 用0.2ml/min流速反冲柱子，4h以上。 3）将柱子反过来（回到通常的流动方向）用分析所用流动相冲即无二氧化碳的纯水冲洗柱子，（用与上一上步骤同样的条件）直到基线平稳方可使用。KS-802色谱柱再生的时间柱子再生的时间：根据相关的样品含有较多重金属和过渡金属元素或是有机酸的样品越是需要经常地对柱子进行再生，因为它们会与柱子发生转换。检测是否需要再生可以根据注入木糖标样或进行测试柱效时用到的2.5%乙二醇来检测，如有明显拖尾或者柱子理论踏板明显降低那么柱子需要
22、做以下处理： KS-802色谱柱的再生柱子的再生步骤： 1）配制500ml的再生溶液（0.2mol/LNAOH溶液2）把柱子流路方向反过来，在35、0.2ml/min的流速冲洗一整夜；3）特别注意用水冲洗系统的时候，一定先把砂芯过滤头先放入纯水超声，冲洗至ph中性为止，然后再生之后回到正常方向，用无二氧化碳的纯水同样的条件冲洗至ph中性为止。使用钠型柱时注意事项：通常推荐压力不超过600psi，最大流速不超过1.0ml/min(80)。进样前一定要把样品过滤，然后再进样，禁止进样强酸 的样品，这样会腐蚀柱子，破坏填料。 晚上不测样品时一定要把柱子的温度降至 40 以下，流速0.2ml/min如果只降流速不降温，那么很不幸的告诉你，你的色谱柱填料会在很短的时间内被烤至塌陷、分离度降级、报废！经验：如果色谱柱再生后。把它放入冰箱冷藏冷藏一段时间，然后再使用会起到意想不到的效果！ 谢谢！
