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1、实验二实验二 蛋白酶抑制剂的明胶蛋白酶抑制剂的明胶- -聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳一一. . 目的：目的：1.学习和掌握蛋白酶抑制剂电泳基本原理及电泳技术。2.熟练掌握蛋白酶抑制剂电泳有关试剂配制的技术和制胶技术。 二、原理：二、原理：( (一一).).聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）:是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide，简称Acr）甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N-methylenebisac
2、rylamide,简称Bis）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合:加入催化剂过硫酸铵（NH4 ）2S2O3（即AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基，这样由于乙烯基“CH2=CH”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用，所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。光聚合:催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照23小时即可完成聚合反应。 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺
3、单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链间纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性能。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。长链上富含酰胺基团，使聚丙烯酰胺成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度（T）和交联度（C）决定。 每100mL凝胶溶液中含有的单体(Acr,a)和交联剂(Bis,b)总克数称为凝胶浓度，用T表示。 凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数称为交联度，用C %表示。改变凝胶浓度（T）
4、和交联度（C），可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以适应各种样品的分离。一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸相对分子质量的不同，适用的浓度也不同。 富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。选择T和C的经验公式是：C = 6.50.3T 此式可用于计算T为520时的凝胶组成。C值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为 1，当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4时，有效孔径最小，C大于或小于4时，有效孔径均变大，C大于5时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6和3。
5、聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在330之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDSPAGE电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如1020的凝胶常用于SDSPAGE电泳的分离胶。 配称30的丙烯酰胺水溶液在4下能保存1个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它
6、们聚合后则无毒。 由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因而四十年来得到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有：可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：109 1012 mol/L。由于聚丙烯酰胺凝胶是由CC键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基CONH2 ，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”。由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。无紫外吸收，不染色就
7、可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。还可以用作固定化酶的惰性载体。 ( (二二).).影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素电场强度电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/20cm10V/cm。当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。溶液的溶液的pHpH值值 溶液的pH决定被
8、分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团（-COOH），又有碱性基团（-NH2）的两性电解质，在某一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再移动，溶液的这一pH值为该蛋白质的等电点（Isoelctric point，pI）。若溶液pH处于等电点酸侧，即pHpI，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pH处于等电点碱侧，即pHpI，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pI越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。溶液的离子强度溶液的离子强度 电泳液中的离子浓度
9、增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionic atmosphere），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度I表示。式中S表示溶液中离子种类，Ci和Zi分别表示每种离子的摩尔浓度与化合价。最常用I值在0.02-0.2之间。电渗电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗(Electro-osmosis)。其产生的原因是固体支
10、持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。5.5.焦耳热焦耳热 电泳过程中释放的热量与电流的平方成正比，当电极缓冲液中离子强度增加时，电流强度会随之增加，这不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶支持物。6.6.筛孔筛孔 支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔，在筛孔
11、大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快；反之，则泳动速度慢。除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等对泳动速度的影响也应考虑。( (三三).).蛋白酶抑制剂电泳活性染色的原理：蛋白酶抑制剂电泳活性染色的原理： 分离纯化蛋白酶抑制剂时，常采用对其靶蛋白酶的抑制活性来进行检测和追踪。由于植物材料中蛋白酶抑制剂含量较少，而测定抑制活性的方法复杂、费时，需要人工合成的特殊底物，因此不太方便。 根据蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶的作用特点，采用明胶PAGE，分离胶中加入0.5% 明胶作为靶蛋白酶的底物，电泳后胶板（含明胶底物）在靶蛋白酶进行酶解时，除了蛋白酶抑制剂存在处的明胶不被酶解，胶板中其他位置的明胶均被蛋白酶水
12、解。酶解后再经水冲洗干净凝胶，然后再经考马斯亮蓝R250染色，显色带（蛋白带）为靶蛋白酶抑制剂的作用效果（抑制剂抑制蛋白酶活性从而使明胶不被水解部位）。采用不同靶蛋白酶可以检测同一植物中不同的蛋白酶抑制剂。三三. . 实验材料实验材料胰蛋白酶抑制剂：来自红豆提取液，经80盐析的上清液、Sephadex-G100柱层析。标准胰蛋白酶抑制剂（国产）。大概蛋白酶抑制剂的点样范围：抑活为110U都可以出带。电泳的样品：0.51mL/样品/班（15l/孔）四四. . 仪器设备仪器设备 1.DDY-5型稳压稳流电泳仪、DYCZ23A型电泳槽（垂直平板电泳槽）2.恒温箱3.水浴锅：调37或504.冰箱5.脱
13、色摇床6.移液管或移液器5mL(1)、1mL(2)、0.1mL（1）7.微量注射器50uL（1）五五. . 玻璃器皿（以组为单位）玻璃器皿（以组为单位）100 mL烧杯（3），吸管（1）、玻棒（1）， 滤纸（36），试剂瓶（1000 mL、500 mL、250 mL等）、培养皿。六六. . 实验试剂实验试剂（一）试剂准备：（一）试剂准备：丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵、浓HCl、Tris、氢氧化钠、蔗糖、冰醋酸、TEMED、考马斯亮蓝R250、NaCl、CaCl2、甲醇、甲醛、明胶、溴酚蓝、胰蛋白酶（国产）( (二二) ) 电泳部分的凝胶制备方法电泳部分的凝胶制备方法1
14、、30%凝胶贮液：取60g丙烯酰胺（Acr）、1.6g甲叉双丙烯酰胺(Bis)。先用约100 mL蒸馏水溶解，如溶解不了,可加热30oC-50oC溶解,再用量筒定容至200mL，然后过滤，后置于棕色瓶。4下保存备用。全班200mL2、10%过硫酸铵(AP)溶液：取2g过硫酸铵溶解后，定容至20mL，现配现用.3、1 mol/L HCl 500mL：在通风橱取浓HCl 42 mL，加蒸馏水至500 mL。4、分离胶缓冲溶液（1.5mol/L TrisCl缓冲液，pH8.8）：取36.3g Tris（三羟甲基氨基甲烷）溶解后，加1mol/L HCl溶液约96 mL ，调pH至8.8，定容至200m
15、L。 全班200mL5、浓缩胶缓冲液(0.5mol/L TrisHCl缓冲液，pH6.8)：取6g Tris（三羟甲基氨基甲烷）溶解后，加1mol/L HCl溶液约40 mL，调pH至6.8，定容至100mL。 6、电极缓冲液（0.05 mol/L Tris0.384 mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3）：取Tris（三羟甲基氨基甲烷）6g、28.8g甘氨酸(氨基乙酸)，加水溶解后,测定pH8.3，定容至。用时稀释倍。全班5000mL工作液7、25明胶：称取25g明胶，加入10mL蒸馏水，溶解混匀后低温保存。 (如果难以溶解可于37水浴中搅拌溶解)。8、0.5溴酚蓝指示剂：配50mL。9、10
16、% 四甲基乙二胺（TEMED）20mL。( (三三) ) 酶解和脱酶部分的试剂制备方法酶解和脱酶部分的试剂制备方法（电泳过程中再配）。1、0.5 mol/L HCl：全班配200 mL2、0.05mol/L Tris-HCl，pH7.5（内含0.2mol/LNaCl， 0.01mol/LCaCl2）： 取6.05 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、80.6mL 0.5 mol/L盐酸, 加入12.5g NaCl和1g CaCl2，加水定容至1000mL，用试纸检测pH7.5。3、100 U/mL的胰蛋白酶液0.2 mg/mL： 称取20mg胰蛋白酶，用0.05mol/L Tris-HCl，pH7
17、.5（内含0.2mol/LNaCl，0.01mol/LCaCl2）定容到100mL。( (四四) ) 染色和脱色部分的试剂制备方法染色和脱色部分的试剂制备方法（电泳过程中再配）。1、考马斯亮蓝R250染色液（0.1%考马斯亮蓝-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考马斯亮蓝R250，加入450 mL 甲醇、100mL冰乙酸，用水定容至1000 mL。过滤后使用。2、0.5mol/L NaCl脱色液，2000mL。3、 5%氨水：将氨水原液和水以1：4的比例稀释。七实验步骤七实验步骤（一）、电泳凝胶的制作（一）、电泳凝胶的制作1、清洗玻璃板;2、在塑料胶条两面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄脏
18、玻璃板）；3、安装好电泳槽（玻璃板）；4、用小烧杯按下表1配封胶液，用滴管滴加于封口槽处，静置约5-10分钟直到凝固。5、加入水于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水,要重装。6、用小烧杯按下表1配下层胶（分离胶），胶浓度13，混匀，灌胶，高度离梳子约11.5cm，然后覆盖一层水，凝胶时间为15-30分钟，胶与水分层，倾倒去水。7、小烧杯按上表配上层胶（浓缩胶），胶浓度，混匀，灌胶，插入梳子；8、在凝胶过程中，液面下降，要补充胶液，凝胶时间约10-20分，凝好胶，拔掉梳子；9、加入稀释的电极缓冲液,浸泡至上槽（低玻璃面）,但不能高过下槽（低玻璃面）,注意不能漏水。封胶 分离胶13% 浓缩
19、胶5% 凝胶贮液30%（mL） 2 2.2 0.81 上层胶缓冲液pH6.8（mL） 0 0 2.5 下层胶缓冲液pH8.8（mL） 0 1.25 010TEMED（四甲基乙二胺）（L） 200 50 100水（mL）61.451.55明胶(L) 0 100 AP（过硫酸氨）（L） 100 100 100总体积（mL） 8.3 5.15 5.01凝胶时间 （5min凝胶）凝胶） （15-20min凝胶）凝胶）（10min凝胶）凝胶）（二）、电泳的过程（二）、电泳的过程1、点样前，样品要加20蔗糖20ul以增加比重，同时加0.05的溴酚兰10ul指示剂，按下表2点样，用微量注射器点样，每点，每点
20、1 1个样品，都要清洗微量注射器，注意个样品，都要清洗微量注射器，注意不要交叉污染。不要交叉污染。2、将电泳槽上槽（低玻璃面）接（），下槽（高玻璃面）接（）， 恒电压电泳： 浓缩胶， 100V ，约 1h ；分离胶， 160V ，约 3-4h。指示剂离下面胶剩1cm左右停止电泳。3、剥胶。注意，不要把胶弄碎。1234567891011名称盐析过柱1标准过柱2过柱3体积（ul） 1010101010（三）、电泳后的活性染色（三）、电泳后的活性染色1、电泳完毕，取出胶板置于培养皿中，用去离子水冲洗数次，将胶板浸在含0.2 mg/mL胰蛋白酶0.05mol/LTris-HCl，pH7.5的缓冲液中，
21、37下保温酶解30minmin。2、室温下用水漂洗酶解过的胶板5次次。3、漂洗完毕，用考马斯亮蓝R-250 50染色0.5h，用5%氨水于摇床上进行脱色5min至背景清晰,到掉氨水，用水洗干净氨水。4、把胶置于照相板上进行拍照。八八 注意事项注意事项凡士林不要涂太多。封好底加水检测是不是漏水，漏水重做。加分离胶后记得加入一层水，但不要冲歪了分离胶。点样时，样品记得加入蔗糖，增加比重。可置于-4冰箱电泳。开始时可以加大电压量（100左右），使样品加快进入分离胶，进入分离胶后控制在80140之间，或者电流在2040之间，注意不要电流过大，使玻璃板裂开。电泳时间示情况而定，溴酚蓝不要跑过头，约23h。酶解时间不宜过长，否则轮廓较模糊。九九. . 实验结果分析实验结果分析1.做好电泳图谱记录和照相，区别蛋白酶抑制剂的各成分，并做好标记。2.本实验是蛋白酶抑制剂的专一性染色，是否是分离纯化蛋白酶抑制剂的较好的方法，如果不是，是否还有更好的快速鉴定方法，请说明之。3.学生对该实验提出些可行性的修改意见。4.递交实验报告。 （本实验由巫光宏老师编写）
