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1、实验九实验九 卵磷脂的提取、纯化和鉴定卵磷脂的提取、纯化和鉴定20082008年年1212月月 1 1、学习和掌握卵磷脂的提取和鉴定方法；、学习和掌握卵磷脂的提取和鉴定方法； 2 2、掌握薄层层析的原理、方法和应用。、掌握薄层层析的原理、方法和应用。一、实验目的一、实验目的n是细胞膜磷脂双分子层的重要成分。是细胞膜磷脂双分子层的重要成分。 n卵卵磷磷脂脂又又称称磷磷脂脂酰酰胆胆碱碱，是是甘甘油油磷磷脂脂的的一一种种。在在动动植植物物体体内内均均有有分分布布，在在动动物物的的脑脑、精精液液、心心、肝肝、肾肾上上腺腺和和卵细胞中含量较多，蛋黄中含量可达卵细胞中含量较多，蛋黄中含量可达8-108-1
2、0。其结构式为：其结构式为： 胆碱胆碱HO 磷磷磷磷脂脂脂脂易易易易溶溶溶溶于于于于乙乙乙乙醚醚醚醚、苯苯苯苯、氯氯氯氯仿仿仿仿，部部部部分分分分溶溶溶溶于于于于乙乙乙乙醇醇醇醇，极极极极难难难难溶溶溶溶于于于于丙丙丙丙酮酮酮酮；卵卵卵卵磷磷磷磷脂脂脂脂溶溶溶溶于于于于乙乙乙乙醇醇醇醇、甲甲甲甲醇醇醇醇、氯氯氯氯仿仿仿仿等等等等有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂，但但但但不不不不溶溶溶溶于于于于丙丙丙丙酮酮酮酮；丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等。丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等。丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等。丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等。 因因因因此此此此
3、，本本本本实实实实验验验验用用用用乙乙乙乙醇醇醇醇、乙乙乙乙醚醚醚醚为为为为溶溶溶溶剂剂剂剂，丙丙丙丙酮酮酮酮为为为为沉沉沉沉淀淀淀淀剂剂剂剂，干干干干燥燥燥燥后后后后获获获获得得得得卵卵卵卵磷磷磷磷脂脂脂脂。新新新新提提提提取取取取得得得得到到到到的的的的卵卵卵卵磷磷磷磷脂脂脂脂为为为为白白白白色色色色蜡蜡蜡蜡状状状状物物物物，与与与与空空空空气气气气接接接接触触触触后后后后因因因因所所所所含含含含不不不不饱饱饱饱和和和和脂脂脂脂酸酸酸酸被被被被氧氧氧氧化化化化而而而而呈呈呈呈黄黄黄黄褐褐褐褐色色色色。卵卵卵卵磷磷磷磷脂脂脂脂中中中中的的的的胆胆胆胆碱碱碱碱，在在在在碱碱碱碱性性性性溶溶溶溶
4、液液液液中中中中可可可可分分分分解解解解为为为为三三三三甲甲甲甲胺胺胺胺，而而而而具具具具有有有有特特特特异异异异的的的的鱼鱼鱼鱼腥腥腥腥味味味味，可可可可用用用用于鉴定。于鉴定。于鉴定。于鉴定。二、实验原理二、实验原理（一）（一）（一）（一）卵磷脂的提取和纯化卵磷脂的提取和纯化 物质提取、纯化受到多种因素的影响，如抽提物的种类及其配比、抽提条件（温度、时间等）都能影响提取的结果。这种多因素的试验可以通过正交法，即用一特制的表格正交表来安排试验，计算和分析试验结果。这样就能通过少量试验取得较好的效果。 本实验运用正交法抽提物的种类及其配比、时间种类及其配比、时间温度和料液比温度和料液比这4个因
5、素对卵磷脂提取和纯化的影响，并求得在什么样的条件下可以达到最佳的试验效果。正交法实验设计正交法实验设计水平水平影响因素影响因素乙醇乙醇 乙乙醚温度温度时间（min）料液比料液比15 14101 424 125201 533 160301 6表表1 1 抽提物、温度、时间和料液比抽提物、温度、时间和料液比4 4因素因素3 3水平水平表表3 L9 3 L9 表表按一般方法，如对4个因素3个水平的各种搭配都要考虑，共需做3*3*3*3=81次试验，而用正交表只需做9次试验，即选用L9表(L是正交表的代号，下标数字表示试验次数)。试验号号影响因素影响因素试验结果果乙醇乙醇 乙乙醚温度温度时间（min）
6、料液比料液比11 5 11 41 101 1 421 5 12 252 202 1 531 5 13 603 303 1 642 4 11 42 203 1 652 4 12 253 301 1 462 4 13 601 102 1 573 3 11 43 302 1 583 3 12 251 103 1 693 3 13 602 201 1 4I （I水平水平试验结果果总合）合）II （II水平水平试验结果果总合）合）III（III水平水平试验结果果总合）合）I/3II/3III/3级差差表表4 试试验验安安排排将本试验的4个因素依次放在L9表的第1，2，3，4列，再将各列的水平数用该列因素
7、相应的水平写出来，就得到上表的试验安排。 （二）薄层层析（二）薄层层析 薄层层析（薄层层析（TLCTLC）是一种微量而快速的层析方法。）是一种微量而快速的层析方法。其层析是在吸附剂（固相支持物）均匀涂布的的薄其层析是在吸附剂（固相支持物）均匀涂布的的薄层上进行的，故称薄层层析。而待分析的样品，是层上进行的，故称薄层层析。而待分析的样品，是点加到薄层板的一端，然后将该端浸入适宜的展层点加到薄层板的一端，然后将该端浸入适宜的展层剂中，在密闭的层析缸中展层。剂中，在密闭的层析缸中展层。 由于各种物质的结构和性质的不同，其在吸附由于各种物质的结构和性质的不同，其在吸附剂表面的吸附能力各异。吸附力大的易
8、被吸附剂吸剂表面的吸附能力各异。吸附力大的易被吸附剂吸附，而较难被展层剂所解吸。吸附力小的则不易被附，而较难被展层剂所解吸。吸附力小的则不易被吸附剂吸附，而易被展层剂携带至较远的距离。这吸附剂吸附，而易被展层剂携带至较远的距离。这样，各种物质在吸附剂和展层剂之间反复多次的被样，各种物质在吸附剂和展层剂之间反复多次的被吸附与解吸附，就表现出不同的迁移率而得以分离，吸附与解吸附，就表现出不同的迁移率而得以分离，并可以通过与显色剂的显色反应而得到鉴定与区分。并可以通过与显色剂的显色反应而得到鉴定与区分。（一）卵磷脂的提取和纯化（一）卵磷脂的提取和纯化1、实验材料：、实验材料：鸡蛋黄鸡蛋黄2、仪器：、
9、仪器：恒温水浴锅恒温水浴锅 蒸发皿蒸发皿 漏斗漏斗 磁力搅拌器磁力搅拌器 天平天平3、试剂：、试剂： 95乙醇乙醇 乙醚乙醚 丙酮丙酮三、实验材料、仪器和试剂三、实验材料、仪器和试剂1、实验材料：、实验材料：提取的卵磷脂提取的卵磷脂2、仪仪 器器： 电电热热鼓鼓风风干干燥燥箱箱、 层层析析玻玻璃璃板板、 层层析析 缸、吹风机、小型喷雾器缸、吹风机、小型喷雾器 。3、试、试 剂：剂： （1）硅胶）硅胶-G； （2）0. 2%羧甲基纤维素钠溶液；羧甲基纤维素钠溶液； （3）展层剂）展层剂 ：氯仿：氯仿甲醇甲醇水水(65254) ； （4）显色剂：）显色剂：1% 碘液。碘液。（二）卵磷脂的薄层层析（
10、二）卵磷脂的薄层层析1 1、卵磷脂的粗提、卵磷脂的粗提 蛋蛋黄黄10g放放入入洁洁净净的的带带塞塞三三角角瓶瓶中中，加加入入95%乙乙醇醇40ml，搅搅拌拌15min后后，静静置置15min；然然后后加加入入10ml的的乙乙醚醚，搅搅拌拌15 min后后，静静置置15min；过过滤滤；滤滤渣渣进进行行二二次次提提取取，加加入入乙乙醇醇与与乙乙醚醚(体体积积比比为为3：1)的的混混合合液液30ml，搅搅拌拌、静静置置一一定定时时间间；第第二二次次过过滤滤，合合并并二二次次滤滤液液，加加热热浓浓缩缩至至少少量量，加加入入一一定定量量丙丙酮酮除除杂杂，卵卵磷磷脂脂即即沉沉淀淀出出来来，即即得得到到卵
11、卵磷磷脂粗品。脂粗品。 四、实验步骤四、实验步骤（一）（一）卵磷脂的提取卵磷脂的提取 2 2卵磷脂的卵磷脂的纯化纯化 取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10% 的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10% 的ZnCl2 2水溶液，室温搅拌；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4）洗涤，搅拌1h，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。（二）卵磷脂的薄层层析（二）卵磷脂的薄层层析1、调浆：称取硅胶、调浆：称取硅胶-G 4.5g 烧杯烧杯 12ml 0. 2%羧羧甲基纤维素钠溶液甲基纤维素钠溶液用玻璃棒调匀搅拌为浆状液。用玻璃棒调匀搅拌为浆状液。2、涂布：取洁
12、净、干燥玻璃板一块、涂布：取洁净、干燥玻璃板一块下衬一张白纸下衬一张白纸在在桌面上放平桌面上放平用烧杯将浆状物均匀倒在玻璃板上，从用烧杯将浆状物均匀倒在玻璃板上，从一端开始，保持均匀一致，涂布面积一端开始，保持均匀一致，涂布面积1 4/5 。3、干燥：在室温下凉干、干燥：在室温下凉干2分钟分钟60干燥箱烘干燥箱烘30分钟。分钟。4、活化：将干燥箱升温至、活化：将干燥箱升温至120 ，活化，活化30分钟后，关分钟后，关闭电源，当玻璃板面温度降至不烫手时取出。闭电源，当玻璃板面温度降至不烫手时取出。5 5、点样：样点距玻璃板一端下缘、点样：样点距玻璃板一端下缘1cm 1cm ，相互间隔，相互间隔1
13、 11.2 cm 1.2 cm ；每位点重复点五次，每次用冷风吹干；每位点重复点五次，每次用冷风吹干后再点，每次点样直径不超过后再点，每次点样直径不超过2mm 2mm 。6 6、展层：在层析缸中加入展层剂深，加盖平衡、展层：在层析缸中加入展层剂深，加盖平衡3030分钟，将点样端浸入，密闭展层分钟，将点样端浸入，密闭展层10-30min10-30min。后取出。后取出薄层板，标出展层剂前沿位置，用电吹风热风将薄薄层板，标出展层剂前沿位置，用电吹风热风将薄层板吹干。层板吹干。7 7、显色：用喷雾器向薄层板上均匀喷洒、显色：用喷雾器向薄层板上均匀喷洒1%1%碘液溶碘液溶液，热风吹干至色斑显现。液，热
14、风吹干至色斑显现。五、实验结果五、实验结果1、卵磷脂收率、卵磷脂收率 卵磷脂收率卵磷脂收率 = 卵磷脂粗品重量卵磷脂粗品重量 / 蛋黄重量蛋黄重量100%2、计算各组分的、计算各组分的Rf 值值3、判断卵磷脂粗提物的组分、判断卵磷脂粗提物的组分 四种磷脂标准品的f值分别为:溶血卵磷脂；神经鞘磷脂；卵磷脂；磷脂酰乙醇胺0.96 OABCDO1O2E六、思考题：六、思考题： 1 1、简述卵磷脂的生物学功能。、简述卵磷脂的生物学功能。2 2、磷脂酰胆碱（卵磷脂），磷脂酰乙醇、磷脂酰胆碱（卵磷脂），磷脂酰乙醇 胺（脑磷脂），磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇胺（脑磷脂），磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇 的结构式。的结构式。 3 3、何谓薄层层析？其原理和方法？、何谓薄层层析？其原理和方法？4 4、制备硅胶、制备硅胶-G-G薄层板与点样时应注意些什么问题？薄层板与点样时应注意些什么问题？5 5、本实验中，哪一种组分的、本实验中，哪一种组分的R Rf f值大一些？值大一些？ 为什么？为什么？
