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1、第四章 目的基因的转化及其原理第一节第一节植物基因工程载体及其构建植物基因工程载体及其构建1植物基因转化系统植物基因转化系统载体转化系统（载体转化系统（Ti质粒转化载体质粒转化载体，Ri质粒转化载质粒转化载体）体）原生质体原生质体DNA直接导入转化系统直接导入转化系统基因枪基因枪DNA导入转化系统导入转化系统花粉粒介导转化系统花粉粒介导转化系统2一、植物基因工程载体命名规则及种类一、植物基因工程载体命名规则及种类1、植物基因工程载体命名规则：、植物基因工程载体命名规则：(1) pSC101plasmidStanleyCohen(人名)pTiT37/pAtT37根癌农杆菌的质粒类型根癌农杆菌的质
2、粒类型（Agrobacterium tumefaciens）pRiT37/pArT37发根农杆菌的质粒类型发根农杆菌的质粒类型（Agrobacterium rhizogenes）3（2）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，如：如：leu （亮氨酸基因位点）（亮氨酸基因位点）基因表基因表现型用正体表示，如型用正体表示，如Leu（3）基因中任何位点）基因中任何位点发生突生突变则在在该基因符号后基因符号后加加该位点斜体大写字母，如亮氨酸位点斜体大写字母，如亮氨酸A、B位点分位点分别为突突变型或缺陷型，表示型或缺陷型，表示为：leuA、leuB(4)抗性和敏感
3、性分抗性和敏感性分别用用R或或r，S或或s表示表示 42 2、植物基因工程载体的种类及特性、植物基因工程载体的种类及特性植物基因工植物基因工程载体程载体克隆载体克隆载体中间载体中间载体中间克隆载体中间克隆载体中间表达载体中间表达载体卸甲载体卸甲载体onc-onc+转化载体转化载体中间黏粒载体中间黏粒载体质粒质粒/黏粒载体黏粒载体基因标记载体基因标记载体一元转化载体一元转化载体（顺式载体）（顺式载体）双元转化载体双元转化载体（反式式载体）（反式式载体）共整合载体共整合载体SEV（拼接末端载体；（拼接末端载体；split-endvector）5二、根二、根癌农杆菌癌农杆菌TiTi质粒的结构与功能质
4、粒的结构与功能 1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能质粒的遗传特性、结构及功能2、T-DNA的基因结构与功能的基因结构与功能3、Vir区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能 6一、一、TiTi质粒的遗传特性、结构及质粒的遗传特性、结构及功能功能1.Ti质粒的粒的遗传特性及特性及类型型Ti质粒粒是是根根癌癌农杆杆菌菌染染色色体体外外的的遗传物物质，为双双股股共共价价闭合合的的环状状DNA分子。分子。根据其根据其诱导的植物冠的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘤中所合成的冠瘿碱种碱种类不同，不同，Ti质粒粒可以被分成四种可以被分成四种类型：型：章章鱼碱型碱型(octopine)胭脂碱型胭脂碱型(nop
5、aline)农杆碱型（杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型）或称琥珀碱型(succinamopine)7图图3-1章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒基因图。质粒基因图。章鱼碱基因章鱼碱基因T-DNA区区结合转移区结合转移区冠瘿碱代谢冠瘿碱代谢复制起始区复制起始区毒力区毒力区生长素基因生长素基因细胞分裂素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成冠瘿碱合成82.Ti质粒的功能质粒的功能区域区域Ti质粒可分为四个区：质粒可分为四个区：（1）T-DNA区（区（transferred-DNAregions）：）： T-DNA是是农农杆杆菌菌侵侵染染植植物物细细胞胞时时，从
6、从Ti质质粒粒上上切切割割下下来来转转移移到到植植物物细细胞胞的的一一段段DNA，称称为为转转移移DNA。该该DNA片片段上的基因与肿瘤的形成有关。段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（区（virulenceregion）该该区区段段上上的的基基因因能能激激活活T-DNA转转移移，使使农农杆杆菌菌表表现现出出毒毒性性，故故称称之之为为毒毒区区。T-DNA区区与与Vir区区在在质质粒粒DNA上上彼彼此此相相邻邻，约占约占Ti质粒质粒DNA的三分之一。的三分之一。9（3）Con区（区（regionsencodingconjugations）该该区区段段上上存存在在着着与与细细菌菌间间接接合合
7、转转移移的的有有关关基基因因（tra），调调控控Ti质质粒粒在在农农杆杆菌菌之之间间的的转转移移。冠冠瘿瘿碱碱能能激激活活tra基基因因，诱诱导导Ti质质粒粒转转移，因此称之为接合转移编码区。移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（区（originofreplication）该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。质粒的自我复制，故称之为复制起始区。103.Ti质粒的生物学功能质粒的生物学功能TiTi质粒的功能可归为以下质粒的功能可归为以下质粒的功能可归为以下质粒的功能可归为以下7 7个方面个方面个方面个方面: :参与参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（寄主细胞
8、合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动）和一些细胞分裂素的活动。诱发诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。赋予赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。赋予赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。为为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。决定决定寄主菌株的植物寄主范围寄主菌株的植物寄主范围。有有的的Ti质质粒粒能能够够抑抑制制某某些些根根瘤瘤土土壤壤杆杆菌菌噬噬菌菌体体生生长长与与
9、发发育育，即即具具有有对对噬噬菌菌体的体的“排外性排外性”。11表表4-1Ti质粒放入部分基因及其功能质粒放入部分基因及其功能基因缩写基因缩写表型及功能表型及功能在基因图上的位置（在基因图上的位置（kb）pTiC58（211kb）pTiAch5（195kb）age排斥噬菌体排斥噬菌体API111-11310-12agr对对PAT-K84质粒编码的农杆菌素敏感质粒编码的农杆菌素敏感138-141arc分解精氨酸分解精氨酸4-59-10agc分解农杆菌分解农杆菌54-57noc分解胭脂碱分解胭脂碱18-20nos合成胭脂碱合成胭脂碱0-1occ分解章鱼碱分解章鱼碱39-41ocs合成章鱼碱合成章鱼
10、碱0-1ori复制起点复制起点33-3590-95roi（tmr）抑制长根抑制长根206-207190-192shi（tms）抑制长芽抑制长芽202-203187-188traTi质粒转移质粒转移121-12321-30inc质粒不相容性质粒不相容性33-3590-9512二、二、T-DNA的基因结构与功能的基因结构与功能1.T-DNA的的发现发现 Chilton等等人人于于1982发发现现。(MDCHILTON,DTEPFER,APETIT,DCHANTAL,CDFRANCINE,TJACQUES.Agrobacterium rhizogenesinsertsT-DNA into the g
11、enomes of the host plant rootcells.Nature,1982(295):432-434）研研究究证证明明，这这部部分分DNA是是从从质质粒粒DNA上上切切割割后后，转转移移到到肿肿瘤瘤细细胞胞，故故称称之之为为转转移移DNA（transferred-DNA）。13GGCAGGATATATATTCAATTGTAATGGCAGGATATATATACCGGTTGTAATT图图3-2Ti质粒上几个重要区域及其序列质粒上几个重要区域及其序列LB：左边界序列；：左边界序列；RB：右边界序列：右边界序列142.T-DNA的结构特点的结构特点lTi质粒质粒T-DNA区的长度约为
12、区的长度约为23kb；l lT-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；中；l在在T-DNA的的5端端和和3端端都都有有真真核核表表达达信信号号。如如TATAbox、AATAAbox及及polyA等。等。15T-DNA的两端左右边界各为的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序的重复序列，即边界序列（列（bordersequence），分别称之为左边界（），分别称之为左边界（BL或或TL）和右边界（）和右边界（BR或或TR）。该该25bp边界序列属保守序列边界序列属保守序列,但通常右边界（但通常右边界（TR）序列更）序列更为保守，左边界为保守，左边界(TL)序列在某
13、些情况下有所变化。其核心序列在某些情况下有所变化。其核心部分是部分是14bp，可分为，可分为10bp(CACGATATAT)及及4bp(GTAA)两部分两部分,是完全保守的。是完全保守的。致瘤性：右边界作用大于左边界致瘤性：右边界作用大于左边界163.T-DNA上的编码基因及功能上的编码基因及功能T-DNA的转录有下述共同点的转录有下述共同点：T-DNA的两条链都是有意义链的两条链都是有意义链,即都能被转录即都能被转录。T-DNA上每个基因都有各自的启动子上每个基因都有各自的启动子。基因的转录由植物细胞基因的转录由植物细胞RNA聚合酶聚合酶完成完成。T-DNA具典型的真核生物具典型的真核生物R
14、NA合成起始和终止的调节信号合成起始和终止的调节信号，T-DNA的转录机理可能与真核生物相同的转录机理可能与真核生物相同。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。17TLTRTCiaaH iaaMauxiptcytocsfrsmasags图图4-3章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒的质粒的T-DNA编码基因结构编码基因结构iaaH：吲哚乙酸胺水解乙酸胺水解酶酶；iaaM：色氨酸：色氨酸单加氧加氧酶酶；aux：生：生长素；素；ipt:异戊异戊烯基基转移移酶酶；cyt：细胞分裂素；胞分裂素；frs：琥珀碱合成：琥珀碱合成酶酶；mas：甘露碱合成
15、：甘露碱合成酶酶；ags：农杆碱合成杆碱合成酶酶18T-DNA区基因的功能区基因的功能第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，如如:frs、mas、ags第二类是致瘤基因；包括生长素基因第二类是致瘤基因；包括生长素基因aux和细胞分和细胞分裂素基因裂素基因cyt19三、三、Vir区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能1、Vir区操纵子的基因结构：区操纵子的基因结构：农杆菌致瘤所必须的；Vir区仅位于T区DNA左侧；两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异。HABGCDEFtzsABGCDE章鱼碱章鱼碱胭脂碱胭脂碱图图4-5章鱼碱型和胭脂碱型章
16、鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒的质粒的Vir区编码基因结构区编码基因结构20表表4-4章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒质粒vir基因基本结构与功能基因基本结构与功能遗传座位遗传座位分子量分子量（kb）基因数基因数表达方式表达方式功能功能virA2.81组成型组成型帮助接受植物信号分子启动毒性区表达帮助接受植物信号分子启动毒性区表达virG1.01组成型组成型转录活化转录活化virC1.52诱导型诱导型T-DNA加工加工virD4.54诱导型诱导型T-DNA加工加工virE2.22诱导型诱导型T-DNA加工加工virB9.511诱导型诱导型膜转运蛋白膜转运蛋白virF1.01诱导型诱导型T-DNA转运转运vi
17、rH94.22诱导型诱导型细胞色素细胞色素P-450单氧化酶单氧化酶21三、农三、农杆菌杆菌Ti质粒基因转化机理质粒基因转化机理已已知知农农杆杆菌菌附附着着到到植植物物细细胞胞后后，只只留留在在细细胞胞间间隙隙中中。T-DNA首首先先在在细细菌菌中中被被加加工工、剪剪切切、复复制制，然然后后转转入入植植物物细细胞胞，并并非非整整个个Ti质质粒粒都都进进入入植植物物细细胞胞。该该基因转化过程是一个复杂的遗传工程。基因转化过程是一个复杂的遗传工程。221、T-DNA的加工及转移的加工及转移23四、四、T链整合植物链整合植物基因组的基因组的分子机理分子机理1、整合位点及其特性、整合位点及其特性T-D
18、NA在在植植物物染染色色体体中中的的插插入入是是随随机机的的，可可插插入入植植物物任任何何一条染色体一条染色体插入位点常有以下特点：插入位点常有以下特点：T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点；优先整合到转录活跃的植物基因位点；T-DNA与植物与植物DNA连接处富含连接处富含A，T碱基对；碱基对；植植物物DNA上上的的插插入入靶靶位位点点与与T-DNA边边界界序序列列有有一一定定程程度度的同源性。的同源性。242.T-DNA的整合机理的整合机理双链断裂修复模型（双链断裂修复模型（DSBRmodel） 单链缺口修复模型（单链缺口修复模型（SSGRmodel）25Sci，IF：9.205262
19、7Fig4-6IllegitimaterecombinationmodelsforT-DNAintegration.(a)Double-strandbreak-repair (DSBR) and single-strand gap-repair (SSGR) models equally explain the integrationeventsleadingtoT-DNAinsertion 621-x34.AsoutlinedintheDiscussion,theDSBRmodelpredictsadouble-strandbreakinthetarget.Unwoundorexonucle
20、aseprocessedendsoftheT-DNA and of the target anneal by partial homologous pairing. Single-strand overhangs areremovedbyendo-orexonucleasedigestion;theendsarerepairedandligated.TheSSGRmodelpredictsanickinthetargetthatisconvertedtoagapbya5-3exonuclease.TheT-strandinvadesthegapandasynapsisisformedbypar
21、tialpairingbetweenT-DNAendsandtarget.TheoverhangsoftheT-DNAareremovedandtheT-strandisligatedtothetarget.AnickintroducedintothesecondstrandofthetargetinitiatesrepairsynthesisofthesecondstrandoftheT-DNA.(b)ApplicationoftheSSGRmodelforT-DNAinsertion621-36.Asproposedinthemodelofinsertion621-x34,repairat
22、theendsofinvadingT-strandmayoccurbeforeligation.AbsenceofaninternalCAGTT-DNAsequencefromtherightjunctionofinsert621-36suggeststhat copying of the target plant DNA led to alteration of the right T-DNA end duringintegration. Mismatch repair may similarly explain the observed deletion. (c) A modifiedve
23、rsion of SSGR model explaining possible involvement of VirD2 protein in recombinationeventsthatresultedinT-DNAinsertions621-37andN6H-cs4.T-DNAinvasiondepictedinthemodelinvolvesVirD2-mediatedrecognitionofanick(orgap)thatisfollowedbyligationofthe5endoftheT-strandtothetargetDNA.The3endoftheT-strandmove
24、salongthetarget,whiletheunwoundtargetDNAstrandisremovedbyexonucleolyticdigestion.Atthepositionwherethe3endoftheT-strandisstabilizedbybase-pairing,theT-strandisligatedtothetarget.Atthesamepositionanickisintroducedinthesecondstrandofthetargetthatdefinestheleftbreak-pointoftargetdeletionandinitiatesthe
25、replicationoftheT-strand.Symbolsusedforpresentationofputativerecombinationeventsareexplainedunderneaththemodels.283.T-DNA整合的遗传效应整合的遗传效应T-DNA插入的遗传特性插入的遗传特性：(1)T-DNA的的插插入入不不引引起起植植物物DNA大大的的重重排排。但但多多数数插插入入会会导导致靶位点处小的缺失，缺失多至致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸个核苷酸。(2)另另一一个个常常见见的的结结果果是是，在在T-DNA植植物物DNA连连接接处处，会会有有几几个个至至33个
26、个核核苷苷酸酸的的“填填充充”DNA（FillerDNA）存存在在，这这些些“填充填充”DNA的序列与靠近连接处的植物的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似序列相似。(3)在在植植物物靶靶位位处处不不要要求求有有特特异异的的序序列列，但但若若在在T-DNA两两端端和和植植物物靶靶位位处处之之间间有有一一段段短短序序列列（510b）同同源源，则则可可以以在在整整合合中起作用。中起作用。29五、农杆菌五、农杆菌TiTi质粒的改造及载体构建质粒的改造及载体构建 1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建质粒的改造及卸甲载体构建2、中间载体、中间载体/表达载体的构建表达载体的构建3、植物基因转化载体系统的构建、
27、植物基因转化载体系统的构建301 1、TiTi质粒的改造及卸甲载体构建质粒的改造及卸甲载体构建野生型野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：Ti质粒分子量过大，一般在质粒分子量过大，一般在160240kb，基因工程，基因工程中难以操中难以操作作；大型的野生大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点质粒上分布着各种限制酶的多个切点，.难以难以找找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外DNA重组技重组技术直接向野生型术直接向野生型Ti质粒导入外源基因质粒导入外源基因；T-DNA区内含有许
28、多编码基因，区内含有许多编码基因，其中其中onc基因产物基因产物干扰宿主干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生植株的再生；Ti质粒不能在大肠杆菌中复制质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10左右）左右）,因此，因此，通过通过Ti质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在T-DNA中只有单一切点的载体中只有单一切点的载体；Ti质
29、粒上还存在一些对于质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。转移不起任何作用的基因。 31为为了了使使Ti质质粒粒成成为为有有效效的的外外源源基基因因导导入入载载体体，必必须须对对野野生生型型Ti质质粒粒进进行行一一番番科科学学的的改改造造。十十分分幸幸运运的的是是，大大肠肠杆杆菌菌具具有有能能与与农农杆杆菌菌高高效效地地接接合合转转移移的的特特性性。因因此此，科科学学家家们们可可以以先先将将T-DNA片片段段克克隆隆到到大大肠肠杆杆菌菌的的质质粒粒中中，并并插插入入外外源源基基因因，最最后后通通过过接接合合转转移移把把外外源源基基因因引引入入到到农农杆杆茵茵的的Ti质质粒粒上上，
30、这这是是一一种种把把预预先先进进行行亚亚克克隆隆、切切除除、插插入入或或置置换换的的T-DNA引引入入Ti质质粒粒的的有有效效方方法法。带带有有重重组组T-DNA的的大大 肠肠 杆杆 菌菌 质质 粒粒 衍衍 生生 载载 体体 称称 为为 ”中中 间间 载载 体体”（intermediatevector），而而接接受受中中间间载载体体的的Ti质质粒粒则则称称为为受受体体Ti质质粒粒（acceptorTip1asmid），一一般般是卸甲载体（是卸甲载体（disarmedvector）。）。322、onc-卸甲载体卸甲载体所所谓谓卸卸甲甲载载体体就就是是无无毒毒的的（non-oncogenic）Ti
31、质质粒粒载载体体。因因为为利利用用野野生生型型的的Ti质质粒粒作作载载体体时时，影影响响植植株株再再生生的的直直接接原原因因是是T-DNA中中onc基基因因的的致致瘤瘤作作用用。因因此此，为为了了使使野野生生型型的的Ti质质粒粒成成为为基基因因转转化化的的载载体体，必必须须切切除除T-DNA上上的的onc基基因因，即即“解解除除”其其“ 武武装装”,构构建建成成所所谓谓“卸卸甲甲”或或称称“缴缴械械”载载体体（disarmed vector）。在在这这种种onc-载载体体中中，已已经经缺缺失失的的T-DNA部部位位被被大大肠肠杆杆菌菌的的一一种种常常用用的的质质粒粒pBR322取取代代。这这样
32、样任任何何适适合合于于克克隆隆在在 pBR322质质粒粒中中的的外外源源DNA片片段段，都都可可以以通通过过与与 pBR322质质粒粒DNA的同源重组，而被共整合到的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。质粒载体上。33onc+卸甲载体卸甲载体对对于于研研究究外外源源基基因因在在转转基基因因植植株株中中的的表表达达，以以及及对对于于以以改改良良农农作作物物为为目目的的的的植植物物基基因因工工程程而而言言，onc-体体系系是是最最有有用用的的。不不过过，人人们们可可能能还还要要设设计计一一些些特特殊殊的的实实验验来来研研究究外外源源基基因因在在冠冠瘿瘿瘤瘤组组织织中中的的表表达达问问题题
33、。在在这这种种情情况况下下，使使用用onc+菌菌株株载载体体则则比比较较合合适适。由由于于冠冠瘿瘿瘤瘤组组织织具具有有不不依依赖赖于于激激素素的的表表型型特特征征，所所以以这这种种载载体体系系统统的的优优点点在在于于它它可可以以快快速速地地增增生生冠冠瘿组织，比较快速而容易得到转化体。瘿组织，比较快速而容易得到转化体。34 2 2、中间载体的构建、中间载体的构建（1）中间载体的基本结构与特点）中间载体的基本结构与特点为为解解决决Ti质质粒粒不不能能直直接接导导入入目目的的基基因因的的困困难难，构构建建中中间间载载体体（intermediatevector）是是有有效效方方法法之之一一。中中间间
34、载载体体是是一一种种在在一一个个普普通通大大肠肠杆杆菌菌的的克克隆隆载载体体（例例如如pBR322质质粒粒）中中插插入入了了一一段段合合适适的的T-DNA片片段段，而而构构成成的的小小型型质质粒粒。中中间间载载体体通通常常是是多多拷拷贝贝的的E.Coli小小质质粒粒，这这一一点点对对于于通通过过体体外外遗遗传传操操作作导导入入外外源源基基因因是是非非常常必必要要的的。从从结结构构特特点点看看可可分分为为两两类类中中间间载载体体，即即共共整整合合系系统统中中间间载载体体和和双双元元载载体体系系统统中中间载体。间载体。35共整合系统中间载体的特征中中间间载载体体必必须须含含有有与与Ti质质粒粒T-
35、DNA区区同同源源的的序序列列，此此外外含含有有pBR的的序序列列，在在其其被被引引入入到到根根癌癌农农杆杆菌菌后后即即可可高高频频地地与与Ti质质粒粒的的T-DNA的的同同源源序序列列进进行重组；行重组；它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；它它必必须须 有有bom位位点点，在在有有诱诱导导质质粒粒存存在在的的情情况况下下，bom位位点点的的存存在在可可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；它它应应该该含含有有阳阳性性植植物物选选择择标标记记，以以利利于于转转化化植植物物细细胞
36、胞的的筛筛选选，例例如如新新霉霉素素磷磷酸酸转转移移酶酶(neomycinphosphotransferase,Npt-)基基因因，其其可可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；无无Ti质粒的边界序列。质粒的边界序列。36双元载体系统的中间载体与共整合系统中间载体不同之处是与共整合系统中间载体不同之处是:无同源序列；无同源序列；具有具有LB和和RB;无无Co1E1复制点复制点 37（2）中间表达载体）中间表达载体启动子及其它调控序列启动子及其它调控序列转录的的调
37、控控对真真核核生生物物基基因因表表达达起起着着关关键性性作作用用。就就真真核核生生物物基基因因表表达达调控控序序列列而而言言，大大多多数数真真核核生生物物在在转录起起始始点点的的5端端上上游游区区第第30至至25bp处具具有有TATA盒盒，在在70至至80bp处还有有CAAT盒盒。在在大大多多数数真真核核生生物物基基因因的的3端端具具有有AATAA序序列列。这些些5和和3端端的的调控控序序列列对真真核核生生物物的的基基因因表表达达起起着着关关键性性作作用用。Ti质粒粒虽然然来来源源于于农杆杆菌菌，但但其其Nos、Ocs、Tmr等等基基因因具具有有与与真真核核生生物物启启动子子类似似的的TATA
38、盒盒和和CAAT盒盒，均均能能在在植植物物细胞胞中中表表达达，并并且且无无组织特特异异性性。因因此此，它它们成成为早早期期构构建建嵌嵌合合基基因因的的启启动子子，其其中中以以Nos启启动子（子（pNos）最常用。）最常用。38393、植物基因转化载体系统的构建、植物基因转化载体系统的构建（1）一元）一元载体系体系统（2）双元）双元载体系体系统401一元载体系统的构建这这一一类类载载体体是是中中间间表表达达载载体体与与改改造造后后的的受受体体Ti质质粒粒之之间间，通通过过同同源源重重组组所所产产生生的的一一种种复复合合型型载载体体，通通常常亦亦称称为为共共整整合合载载体体（co-intergra
39、tedvecter），又又由由于于该该载载体体的的T-DNA区区与与Ti质粒质粒Vir区连锁，因此又称之为顺式载体（区连锁，因此又称之为顺式载体（cis-vector）。）。一元载体的特点是一元载体的特点是:由两个质粒（由两个质粒（E.coli质粒和质粒和Ti质粒）重组质粒）重组而成，分子量较大；而成，分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频率共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关有关,相对较低；相对较低；必须用必须用Southern杂交或杂交或PCR对大的共整合对大的共整合体质粒进行检测；体质粒进行检测；构建时比较困难。一元载体系统目前主要有构建时比较困难。一元载体系统目前主要有两种
40、载体：共整合载体和拼接未端载体（两种载体：共整合载体和拼接未端载体（split-endvector,SEV）。）。 41（1）共整合载体的构建共整合载体的特点是：共整合载体的特点是：中间表达载体与受体中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；而构建；中间表达载体与受体中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是质粒之间同源序列是pBR322。共整合载体的构建共整合载体的构建过程过程l）中中间间载载体体pLGV1103导导入入农农杆杆菌菌:目目前前通通常常采采用用两两种种方方法法，即即接接合合转转移移法法（conjugativetransfer）和三亲杂交
41、转移法。）和三亲杂交转移法。2）中间载体与受体）中间载体与受体Ti质粒的同源重组。质粒的同源重组。3）共整合载体的选择。）共整合载体的选择。 42共整合转化程序共整合转化程序共整合转化程序共整合转化程序共整合转化程序共整合转化程序（2） SEV的构建SEV系系统统即即T-DNA边边界界拼拼接接系系统统，亦亦称称拼拼接接末末端端载载体体（sp1it-endvecter,SEV）。它它是是由由Freley等等人人于于1985年年建建立立的的另另一一种种共共整整合合载载体体，也也因因为为它它的的两两个个LIH序序列列在在同同源源重重组组前前分分别别处处于于不不同同质质粒粒上上而而得得名名。SEV与与
42、pGV3850的差异及构建过程如下述：的差异及构建过程如下述：1）SEV的的受受体体Ti质质粒粒的的T-DNA上上的的致致瘤瘤基基因因（onc）及及TR都都已已被被缺缺失失，T-DNA的的保保留留部部分分被被称称为为“左左边边界界内内部部同同源源区区”（1eftinsidehomcology，LIH）。该该受受体体Ti质质粒粒还还保保留留了了Vir基基因因及及其其它它正正常常的的功功能能基基因因，同同时时还还携携有用于细菌筛选的抗性基因。有用于细菌筛选的抗性基因。2）SEV中中间间载载体体具具有有一一个个细细菌菌的的抗抗性性基基因因，一一个个植植物物抗抗性性基基因因及及与与受受体体Ti质质粒同
43、源的粒同源的LIH序列及序列及TR。3）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有LIH同源序同源序列，即可发生同源重组，形成列，即可发生同源重组，形成SEV的共整合载体。的共整合载体。 44（3） SEV与pGV3850比较两两者者都都是是通通过过受受体体Ti质质粒粒与与中中间间载载体体同同源源重重组组而而形形成成，故故同同属属于共整合的一元载体系统，但它们之间有着一定的差异：于共整合的一元载体系统，但它们之间有着一定的差异：1）它它们们的的受受体体Ti质质粒粒与与中中间间载载体体的的结结构构不不同同。pGV3850的的左左
44、右右边边界界在在一一个个受受体体Ti质质粒粒上上，而而SEV来来自自二二个个质质粒粒，即即TR来来自中间载体。自中间载体。2）同同源源序序列列不不同同。pGV3850重重组组的的同同源源序序列列是是pBR322，而而SEV是是LIH。3）SEV是是更更有有效效的的共共整整合合载载体体。由由于于pGV3850共共整整合合载载体体，带带有有大大肠肠杆杆菌菌pBR322序序列列，外外源源基基因因嵌嵌合合在在该该序序列列中中，因因而而转转化化的的植植物物中中也也带带有有重重复复的的pBR322序序列列。此此重重复复序序列列可可能能对对转转化化植植物物中中的的外外源源基基因因的的稳稳定定性性有有影影响响
45、，而而SEV系系统统则则排排除除了了这种可能。这种可能。452双元载体系统双元载体（binaryvecter）系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（transvecter）.46（1）双元载体系统的构建原理双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。 Ti质粒上的Vir基因与T-DNA具有反式互补作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的转移。其次，中间载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点（oriV），而代替了共整合载体中用以重组的同源区，能够在
46、任何农杆菌寄主里自发复制。47（4）双元载体的构建将MiniTi质粒转入含有He1perTi质粒根癌农杆菌的途径有两条，一条是直接用纯化的MiniTi质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；另一条是与共整合载体构建一样，采用三亲接合的方式。MiniTi质粒均能以E.coli的pRK2013为辅助质粒，通过三亲杂交而接合转移到含有辅助Ti质粒的农杆菌细胞内。由于E.coli的pRK2013不能在农杆菌中复制最后消失，含有MiniTi质粒和He1perTi质粒的根癌农杆菌可直接用于植物细胞的转化。 4849（5）一元载体系统和双元载体系统的比较双元载体系统与一元载体系统之间有着较大的差异：双元载体系统
47、与一元载体系统之间有着较大的差异： 1）双元载体不需要共整合过程，因此系统中的两个质粒不必含）双元载体不需要共整合过程，因此系统中的两个质粒不必含有同源序列。有同源序列。 2）Mini-Ti质粒具有质粒具有E.coli质粒的复制位点、能在农杆菌的寄质粒的复制位点、能在农杆菌的寄主中复制，使其质粒的拷贝数增加主中复制，使其质粒的拷贝数增加10100倍，而且倍，而且Mini-Ti质质粒分子量小（粒分子量小（10kb），可以直接进行体外遗传操作。），可以直接进行体外遗传操作。 3）双元载体不需经过两个质粒的共整合过程，因此构建的操）双元载体不需经过两个质粒的共整合过程，因此构建的操作步骤比较简单。作
48、步骤比较简单。 4）由于）由于mini-Ti质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，而且构建的频率较高。农杆菌比较容易，而且构建的频率较高。50（5）一元载体系统和双元载体系统的比较5）由由于于根根癌癌农农杆杆菌菌感感染染的的寄寄主主范范围围是是由由Vir基基因因及及染染色色体体上上的的基基因因决决定定的的，因因此此，使使用用双双元元载载体体系系统统更更便便于于根根据据转转化化材材料料的的来源不同选择适宜的来源不同选择适宜的He1per系统。系统。6）双双元元载载体体在在外外源源DNA转转入入植植物物细细胞胞前前，无无需需进进行行同同源源
49、重重组组，插入载体的外源基因变异可能要比插入载体的外源基因变异可能要比pGV3850系统来得小。系统来得小。7）共共整整合合载载体体系系统统比比双双元元载载体体系系统统更更难难以以应应用用，通通常常一一个个共共整整合合载载体体在在用用于于植植物物转转化化之之前前，应应弄弄清清Ti质质粒粒的的拷拷贝贝数数和和大大小小，所以必须通过所以必须通过southern杂交来鉴定。杂交来鉴定。8)共共整整合合载载体体的的重重组组频频率率很很低低，而而双双元元载载体体系系统统的的两两个个质质粒粒接接合的频率较高，一般至少高合的频率较高，一般至少高4倍，因此双元载体的构建频率较高。倍，因此双元载体的构建频率较高
50、。9）共共整整合合载载体体构构建建成成功功后后，工工程程菌菌的的稳稳定定性性较较好好，双双元元载载体体稳稳定性较差，容易丢失。定性较差，容易丢失。10）双元载体在外源基因的植物转化中效率高于共整合载体。）双元载体在外源基因的植物转化中效率高于共整合载体。51载体构建中常用的选择标记及报告基因载体构建中常用的选择标记及报告基因选择标记基因和筛选标记基因选择标记基因和筛选标记基因必须必须具备以下四个条件具备以下四个条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；基因较小，可构成嵌合基因基因较小，可构成嵌合基因；能在转化体中得到充分表达能在转化体中得到充分表达；检测容易，
51、并且能定量分析检测容易，并且能定量分析。选择选择标记基因和筛选标记基因和筛选标记基因差异：标记基因差异：选择选择标记基因的功能主要是该基因的产物给予植物细胞产生标记基因的功能主要是该基因的产物给予植物细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来，例如，选择出来，例如， Cat（氯霉抗性基因）（氯霉抗性基因）。筛选筛选标记基因强调给转化细胞带上一种标记，起报告和识别标记基因强调给转化细胞带上一种标记，起报告和识
52、别作用，故称报告基因。作用，故称报告基因。 521选择标记的应用选选择择标标记记的的功功能能是是在在选选择择压压力力下下把把转转化化体体选选择择出出来来。为为达达到到这这一一目目的的，首首先先要要在在选选择择培培养养基基中中加加入入选选择择剂剂，产产生生一一种种选选择择压压力力，致致使使未未转转化化细细胞胞不不能能生生长长、发发育育。其其次次是是选选择择标标记记基基因因的的产产物物对对选选择择剂剂产产生生抗抗性性，致致使使转转化化细细胞胞不不受受选选择择剂剂的的影影响响，能能正正常常生生长长、发发育、分化，从而把转化体选择出来。育、分化，从而把转化体选择出来。近年来已研究出较多的选择标记基因。
53、近年来已研究出较多的选择标记基因。在在选选择择标标记记的的使使用用中中值值得得注注意意的的是是标标记记基基因因的的正正确确选选择择。没没有有一一种种标标记记在在所所有有的的植植物物全全都都行行之之有有效效；不不同同的的标标记记基基因因对对转转化化细细胞胞的的生生长长发发育育及及转转化化率率有有着着明明显显的的影影响响；即即使使是是同同一一种种标标记记基基因因，在在不不同同的的选选择择抑抑制制剂剂压压力力下下也也是是不不同同的的；不不同同的的植植物物种种类类对对选选择择系系统统的的敏敏感感性性程程度度差差异异很很大大。因因此此，当当试试图图转转化化一一种种新新的的植植物物时时，设设计计许许多多种
54、种可可替替代代的的选选择择标标记记是是有有利利的的。选选择择系系统统必必须须突突出出对对相相关关植植物物组织的约束性选择压力，要随选择的靶外植体或组织而异。组织的约束性选择压力，要随选择的靶外植体或组织而异。53表表4-5植物转化的遗传选择标记植物转化的遗传选择标记基因（缩写）基因（缩写）抗代谢物（英文）抗代谢物（英文）抗代谢物（中文）抗代谢物（中文）npt-IIAminoglycosideAntibiotics（Kan，neo，G418）氨基葡萄糖苷氨基葡萄糖苷抗生素抗生素（卡那霉素，新霉素，（卡那霉素，新霉素，G418）hptHygromycin潮霉素潮霉素gentGentamycin庆大
55、霉素大霉素bleoBleomycin博来霉素博来霉素blasBlasticidin杀稻瘟菌素稻瘟菌素aatStreptomycinSpecinomycin链霉素霉素壮壮观霉素霉素strl，spcStreptomycin链霉素霉素speSpectinomycin壮壮观霉素霉素catChloramphenicol氯霉素霉素barphosphinothricin草甘草甘膦gfpGreenfluorescentprotein绿色色荧光蛋白光蛋白manAphosphomannoseisomerase磷酸甘露粉异构磷酸甘露粉异构酶酶542报告基因的应用报告基因的应用1、对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至
56、细胞都要进一步、对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞都要进一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体。的筛选确定其是否属于真正的基因转化体。2、在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否成功，或、在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到表达，因此起到报告检测转化的基因是否能在转化细胞中得到表达，因此起到报告的作用，故亦称之为的作用，故亦称之为报告基因（报告基因（reportgene）。3、用于启动子表达特性的评估和亚细胞区问的研究分析等。、用于启动子表达特性的评估和亚细胞区问的研究分析等。 553选择标记和报告基因的选择策略选择标记和报告基因的选
57、择策略上上述述选选择择标标记记和和筛筛选选标标记记的的基基因因产产物物，按按其其性性质质特特点点可可分分为为三三大大类类型型：抗抗生生素素类类标标记记、生生化化类类标标记记及及荧荧光光素素类类标标记记。这这些些标标记记基基因因必必须须正正确确使使用用，总体来说要注意以下几个总体来说要注意以下几个原则原则：（1）不不同同的的植植物物种种类类对对选选择择系系统统的的敏敏感感程程度度差差异异极极大大；例例如如，Km抗抗性性已已在在许许多多植植物物中中被被成成功功地地用用作作可可选选择择的的标标记记，但但有有时时对对其其他他植植物物则则无无效效。其其无无效效的的原原因因有有两两个个方方面面：一一方方面
58、面由由于于产产生生对对该该化化合合物物的的高高水水平平的的耐耐受受性性；另另一一方方面是在植物组织上形成枯斑病而坏死。面是在植物组织上形成枯斑病而坏死。（2）标标记记基基因因化化合合物物的的有有效效作作用用可可能能随随被被选选择择的的靶靶外外植植体体或或组组织织而而异异，例例如如分分化化水水平平、外外植植体体的的类类型型（原原生生质质体体、单单细细胞胞、细细胞胞群群体体、胚胚状状体体、愈愈伤伤组组织、离体的根、茎、叶）织、离体的根、茎、叶）、大小等都会影响任何一个标记基因的使用。、大小等都会影响任何一个标记基因的使用。（3）在在众众多多的的选选择择标标记记中中，Km抗抗性性基基因因已已证证明明是是一一个个很很有有用用的的转转化化选选择择标标记。记。56
