酶类药物的分析

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1、1酶类药物的分析酶类药物的分析第一节第一节概述概述第二节第二节酶类药物的鉴别与检查酶类药物的鉴别与检查第三节第三节酶活力测定方法酶活力测定方法第四节第四节酶活力测定方法设计酶活力测定方法设计第五节第五节典型酶类药物的检测典型酶类药物的检测2。品种来源剂型类别门冬酰胺酶（埃希）大肠埃希菌提取粉剂抗肿瘤药注射用门冬酰胺酶（埃希）门冬酰胺酶（埃希）冻干粉剂抗肿瘤药门冬酰胺酶（欧文）欧文菌提取粉剂抗肿瘤药注射用门冬酰胺酶（欧文）门冬酰胺酶（欧文）冻干粉剂抗肿瘤药抑肽酶牛胰、牛肺提取粉剂蛋白酶抑制剂注射用抑肽酶抑肽酶冻干粉剂蛋白酶抑制剂尿激酶新鲜人尿提取粉剂溶栓药注射用尿激酶尿激酶冻干粉剂溶栓药细胞色素

2、C溶液猪心、牛心提取溶液细胞代谢改善药细胞色素C注射剂细胞色素C注射剂细胞代谢改善药注射用细胞色素C细胞色素C冻干粉剂细胞代谢改善药玻璃酸酶哺乳动物睾丸提取粉剂黏多糖分解酶注射用玻璃酸酶玻璃酸酶冻干粉剂黏多糖分解酶胃蛋白酶猪、羊或牛的胃黏膜提取粉剂助消化药胃蛋白酶片胃蛋白酶片剂助消化药胃蛋白酶颗粒胃蛋白酶颗粒剂助消化药含糖胃蛋白酶胃蛋白酶粉剂助消化药胰蛋白酶猪、羊或牛胰中提取粉剂蛋白分解酶注射用胰蛋白酶胰蛋白酶冻干粉剂蛋白分解酶胰酶猪、羊或牛胰中提取的酶混合物粉剂助消化药胰酶肠溶片胰酶片剂助消化药胰酶肠溶胶囊胰酶胶囊剂助消化药胰激肽原酶猪胰中提取粉剂血管舒张药凝血酶冻干粉牛血或猪血中提取的凝血

3、酶原冻干粉剂局部止血药糜蛋白酶牛或猪胰中提取粉剂蛋白分解酶注射用糜蛋白酶糜蛋白酶冻干粉剂蛋白分解酶3第一节第一节概述概述n在在生生物物体体内内，降降低低反反应应活活化化能能，加加快快可可逆逆反反应应的的进进行速度。行速度。n一、酶的特性一、酶的特性n二、酶的分类二、酶的分类n三、酶的化学组成三、酶的化学组成n四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制n五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学4一、酶的特性一、酶的特性1酶是高效催化剂。酶是高效催化剂。n2酶对底物的结构具有严格的选择性。酶对底物的结构具有严格的选择性。n（1）相对专一性：）相对专一性：脂肪水解酶，蛋白水解酶脂肪水解酶，蛋白水解酶n

4、（2）绝对专一性）绝对专一性:脲酶脲酶n（3）立体异构专一性）立体异构专一性:L-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶n3酶催化反应的反应条件温和。酶催化反应的反应条件温和。n4酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。5。56二、酶的分类二、酶的分类n氧化还原酶氧化还原酶n转移酶转移酶n水解酶水解酶n裂合酶裂合酶n异构酶异构酶n合成酶（或称连接酶）合成酶（或称连接酶）7三、酶的化学组成三、酶的化学组成n分为分为简单酶和结合酶简单酶和结合酶两大类。两大类。n结结合合酶酶类类中中除除含含有有蛋蛋白白外外，还还含含有有某某种种热热稳稳定定的的非非蛋蛋白白质质的的小小分分子子

5、物物质质，二二者者结结合合起起来来，称称为为“全酶全酶”，才呈现生物催化活性。，才呈现生物催化活性。n结合酶结合酶=酶蛋白酶蛋白+辅助因子辅助因子8四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制n1酶酶-底底物物复复合合物物的的形形成成在在酶酶促促反反应应中中，反反应应底底物物首首先先与与酶酶分分子子上上活活性性部部位位结结合合，形形成成酶酶-底底物物复复合合物物，降降低低反反应应的的活活性性能能，使使酶酶促促反反应应顺顺利利进行。进行。n2酶酶-底物复合物加速反应速率的原因底物复合物加速反应速率的原因n（1）定向作用与底物浓缩）定向作用与底物浓缩n（2）酶使底物分子变形）酶使底物分子变形n（3）酸

6、碱催化）酸碱催化n（4）共价催化）共价催化。9五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学n酶酶的的活活力力单单位位酶酶活活性性单单位位（U）是是酶酶活活性性高低的一种量度，用高低的一种量度，用U/g或或U/ml表示。表示。n酶酶活活力力单单位位定定义义：在在规规定定的的条条件件下下，每每分分钟钟能能转转化化1mol底底物物所所需需要要的的酶酶量量，称称一一个酶的活力单位。个酶的活力单位。n酶酶的的比比活活力力每每毫毫克克酶酶蛋蛋白白所所含含酶酶活活力力，U/mg。10Michaelis-MentenMichaelis-Menten快速平衡学说快速平衡学说n底底物物浓浓度度的的增增加加，反反应应速

7、度上升呈速度上升呈双曲线双曲线。n在在低低底底物物浓浓度度时时，反反应应速速度度呈呈直直线线上上升升，表表现现为为一级反应一级反应。n在在高高浓浓度度时时，反反应应速速度度达达到到一一个个极极限限值值，呈呈现现零级反应零级反应。11米氏方程米氏方程n酶反应动力学方程式：酶反应动力学方程式：nV反应初速度反应初速度nVm最大反应速度最大反应速度nKs 米米氏氏常常数数，Ks=K1/K1，Ks为为ES的的解解离离常常数数，表示酶与底物的亲和力表示酶与底物的亲和力。nKs为为反反应应速速度度V是是最最大大反反应应速速度度Vm一一半半时时所所需需底底物物浓浓度，即度，即V=1/2Vm时，时，Ks=S。

8、12Briggs-Haldane稳态学说稳态学说nES的的形形成成速速度度与与ES的的解解离离速速度度相相等等，达达到到动动态态平平衡衡，即，即“稳态稳态”，反应方程式：，反应方程式：nKm取代了取代了Ks，当当V=1/2Vm时，时，Km=S。nKm也表示为底物与酶的亲和力。也表示为底物与酶的亲和力。132015版药典收载的酶原料版药典收载的酶原料n胰酶，胃蛋白酶胰酶，胃蛋白酶n胰蛋白酶，糜蛋白酶，玻璃酸酶胰蛋白酶，糜蛋白酶，玻璃酸酶n尿激酶尿激酶n抑肽酶，门冬酰胺酶抑肽酶，门冬酰胺酶品种来源剂型类别门冬酰胺酶（埃希）大肠埃希菌提取粉剂抗肿瘤药注射用门冬酰胺酶（埃希）门冬酰胺酶（埃希）冻干粉剂

9、抗肿瘤药门冬酰胺酶（欧文）欧文菌提取粉剂抗肿瘤药注射用门冬酰胺酶（欧文）门冬酰胺酶（欧文）冻干粉剂抗肿瘤药抑肽酶牛胰、牛肺提取粉剂蛋白酶抑制剂注射用抑肽酶抑肽酶冻干粉剂蛋白酶抑制剂尿激酶新鲜人尿提取粉剂溶栓药注射用尿激酶尿激酶冻干粉剂溶栓药细胞色素C溶液猪心、牛心提取溶液细胞代谢改善药细胞色素C注射剂细胞色素C注射剂细胞代谢改善药注射用细胞色素C细胞色素C冻干粉剂细胞代谢改善药玻璃酸酶哺乳动物睾丸提取粉剂黏多糖分解酶注射用玻璃酸酶玻璃酸酶冻干粉剂黏多糖分解酶胃蛋白酶猪、羊或牛的胃黏膜提取粉剂助消化药胃蛋白酶片胃蛋白酶片剂助消化药胃蛋白酶颗粒胃蛋白酶颗粒剂助消化药含糖胃蛋白酶胃蛋白酶粉剂助消化药

10、胰蛋白酶猪、羊或牛胰中提取粉剂蛋白分解酶注射用胰蛋白酶胰蛋白酶冻干粉剂蛋白分解酶胰酶猪、羊或牛胰中提取的酶混合物粉剂助消化药胰酶肠溶片胰酶片剂助消化药胰酶肠溶胶囊胰酶胶囊剂助消化药胰激肽原酶猪胰中提取粉剂血管舒张药凝血酶冻干粉牛血或猪血中提取的凝血酶原冻干粉剂局部止血药糜蛋白酶牛或猪胰中提取粉剂蛋白分解酶注射用糜蛋白酶糜蛋白酶冻干粉剂蛋白分解酶中国中国药典典收收载的的酶酶类药品品种品品种15第二节第二节 酶类药物的鉴别与检查酶类药物的鉴别与检查n鉴别方法鉴别方法: :n蛋白质鉴别方法蛋白质鉴别方法，如在碱性条件下的双缩脲反，如在碱性条件下的双缩脲反应。应。nSDS-PAGESDS-PAGE电泳

11、：降纤酶电泳：降纤酶nHPLCHPLC：门冬酰胺酶：门冬酰胺酶n专用于酶的鉴别方法：专用于酶的鉴别方法：n 酶活性试验：与特异性底物反应（酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶胰蛋白酶）。）。n 沉淀试验沉淀试验：胃蛋白酶胃蛋白酶n 动物试验：动物试验：透明质酸酶透明质酸酶水解粘多糖。水解粘多糖。16酶类药物的检查酶类药物的检查n酶酶类类药药物物是是生生化化产产品品和和微微生生物物发发酵酵产产品品，在在生生产产过过程程中中可可能能带带入入微微量量的的脂脂肪肪类类物物质质、其其他他的的酶酶类类和和大大分分子子杂杂质质，影影响响酶酶质质量量，需需有有含量限度。含量限度。17酶类药物的检查酶类药物的

12、检查n（一）脂肪含量限度检查一）脂肪含量限度检查n检检查查方方法法，乙乙醚醚浸浸提提，干干燥燥，精精密密称称定定，脂脂肪肪不得过规定的含量。不得过规定的含量。n（二）其他酶类含量限度检查（二）其他酶类含量限度检查n胰胰蛋蛋白白酶酶、糜糜蛋蛋白白酶酶均均是是从从牛牛、猪猪的的胰胰脏脏中中提提取取的的蛋蛋白白分分解解酶酶。提提取取胰胰蛋蛋白白酶酶时时又又易易带带入入微微量的糜蛋白酶量的糜蛋白酶。n（三）大分子活性物质含量限度检查（三）大分子活性物质含量限度检查18胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量n每每2500U胰蛋白酶中不得多于胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。的糜蛋白酶

13、。n糜蛋白酶专属水解糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸芳香氨基酸（L-酪氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸）苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。n用用N-乙酰乙酰-L-酪氨酸乙酯酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-TyrosineEthylester，ATEE）作底物，通过）作底物，通过分光光度法测定此分光光度法测定此酶对底物的水解速率酶对底物的水解速率来检查来检查该酶的含量限度。该酶的含量限度。19第三节第三节酶活力测定方法酶活力测定方法n固定时间法固定时间法n连续监测法连续监测法n固定浓度法固定浓度法20一、固定时间法一、固定时间法（终点法）（终点法）n在适宜的条件下，使

14、酶和底物共同保温在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定一定时间时间，测定，测定产物生成的量产物生成的量或或底物消耗的量，底物消耗的量，计算出酶的含量（或活力）。计算出酶的含量（或活力）。nnE表表示示酶酶浓浓度度，P为为反反应应产产物物浓浓度度，t表表示酶作用时间，示酶作用时间，K为常数。为常数。21实例：n（1）胰胰弹弹性性蛋蛋白白酶酶活活力力单单位位定定义义：在在pH8.8，37条条件件下下作作用用20min，水水解解1.0mg刚刚果果红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位。红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位。nn（2）天天冬冬氨氨酸酸酶酶活活力力单单位位定定义义：在在测测定定条条件件下下，每

15、每小小时时每每克克细细胞胞转转化化生生成成1mol天天冬冬氨氨酸所需的酶量酸所需的酶量。 22注意事项注意事项n缺缺点点：无无法法了了解解整整个个反反应应过程是否都是零级反应。过程是否都是零级反应。n注意事项：注意事项：n1、底物饱和、底物饱和n2、时间、时间23二、连续监测法（反应速度法）二、连续监测法（反应速度法）n在酶反应过程中，在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量或产物生成量。n酶底物大多是人工合成的酶底物大多是人工合成的“色素元色素元”，其本身无色，其本身无色，经经酶作用后释放出有色的反应产物酶作用后释放出有色的反应产物。根据反应过程。

16、根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。中吸收度增高速率，算出酶活力单位。n测定时间测定时间.n例如：例如：n磷酸对硝基苯酚酯磷酸对硝基苯酚酯 对硝基苯酚对硝基苯酚n法法下文为中国药典下文为中国药典2012015 5版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？n供供试试品品的的制制备备：精精密密称称取取本本品品适适量量，用用盐盐酸酸（0.001mol/

17、L0.001mol/L）制制成成每每1ml1ml中中含含50506060胰蛋白酶单位的溶液。胰蛋白酶单位的溶液。n底底物物溶溶液液的的制制备备：取取N-N-苯苯甲甲酰酰-L-L-精精氨氨酸酸乙乙酯酯盐盐酸酸盐盐85.7mg85.7mg，加加水水溶溶解解使使成成100ml100ml，作为底物原液；底物溶液应在制成后，作为底物原液；底物溶液应在制成后2 2小时内使用。小时内使用。n测测定定法法：取取底底物物溶溶液液3.0ml3.0ml，加加盐盐酸酸溶溶液液（0.001ml/L0.001ml/L）0.2ml0.2ml，混混匀匀，作作为为空空白白，取取供供试试品品溶溶液液0.2ml0.2ml加加底底物

18、物溶溶液液（预预热热至至25250.50.5）3.0ml3.0ml，立立即即计计时时并并摇摇匀匀，使使比比色色池池内内温温度度保保持持在在25250.50.5，照照紫紫外外可可见见分分光光光光度度法法在在253nm253nm的的波波长长处处，每每隔隔3030秒秒种种读读取取吸吸收收度度，共共5 5分分钟钟。每每3030秒秒钟钟吸吸收收度度的的变变化化率率应应恒恒定定在在0.0150.0150.0180.018之之间间，呈呈线线性性关关系系的的时时间间不不得得少少于于3 3分分钟钟。若若不不符符合合上上述述要要求求，应应调调整整供供试试品品的的溶溶液液浓浓度度，另另行行测测定定。以以吸吸收收度度

19、为为纵纵坐坐标标，时时间为横坐标做图，取在间为横坐标做图，取在3 3分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算。分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算。n式中式中 P P为每为每1mg1mg供试样品中胰蛋白酶的单位数；供试样品中胰蛋白酶的单位数；nA A1 1为直线上终止的吸收度；为直线上终止的吸收度；A A2 2为直线上开始的吸收度；为直线上开始的吸收度；nT T为为A A1 1至至A A2 2读数的时间（分）；读数的时间（分）；W W为测定液中供试品的量；为测定液中供试品的量；n0.0030.003为上述条件下，吸收度每分钟改变为上述条件下，吸收度每分钟改变0.0030.003相当于一个胰蛋白酶单

20、位。相当于一个胰蛋白酶单位。25三、固定浓度法三、固定浓度法（fixed-concentrationessay）n根根据据酶酶催催化化反反应应，使使反反应应产产物物达达到到额额定定的的浓浓度度时时其其反反应应时时间间与与酶酶浓浓度度成成反反比比的的原原理理进进行行设计的。设计的。nP=KEtn以以所所需需时时间间的的倒倒数数（1/t）对对酶酶浓浓度度作作图图即即可可制备标准曲线。制备标准曲线。n优点：优点：1、记录时间。、记录时间。2、准确、准确26第四节第四节 酶活性测定方法的设计酶活性测定方法的设计n一、影响因素一、影响因素n二、底物与产物的测定方法二、底物与产物的测定方法n三、测定条件的

21、选择三、测定条件的选择27一、影响因素一、影响因素n1、底物底物n2、pHn3、温度温度n4、酶浓度酶浓度n5、空白和对照空白和对照28底物底物n酶可以同时作用多个底物。酶可以同时作用多个底物。n以以Km最小者最小者作为此酶的生理底物。作为此酶的生理底物。n从从底物性质底物性质看，选用的底物最好在物理化学性质看，选用的底物最好在物理化学性质上与产物不同，利于测定。上与产物不同，利于测定。n从底物浓度看，为不使酶反应受到它的控制，反从底物浓度看，为不使酶反应受到它的控制，反应系统应使用足够高的应系统应使用足够高的底物浓度底物浓度。29胰凝乳蛋白酶几种底物的胰凝乳蛋白酶几种底物的Km底物底物Km（

22、mmol/L）N苯甲酰苯甲酰酪氨酰胺酪氨酰胺2.5N甲酰甲酰酪氨酰胺酪氨酰胺12.0N乙酰乙酰酪氨酰胺酪氨酰胺32.0甘氨酰甘氨酰酪氨酰胺酪氨酰胺122.030底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响S/KmV/Vmax0.010.990.11.015010911009931pHn酶活力测定选用酶活力测定选用缓冲体系缓冲体系。n不同缓冲液所受影响不同。不同缓冲液所受影响不同。磷酸盐磷酸盐所受影响较所受影响较小，而小，而Tris则受影响较大。则受影响较大。n酶溶液用量与底物溶液比例不超过酶溶液用量与底物溶液比例不超过10为宜。为宜。32温度温度n温度变化温度变化1，反应速度可能相差，

23、反应速度可能相差10以上以上，控制在控制在0.1。n反应温度一般为反应温度一般为25，此时酶不易灭活，此时酶不易灭活，Km较小，可以使用较低的底物浓度。较小，可以使用较低的底物浓度。n有些酶在有些酶在37不稳定。不稳定。33酶浓度酶浓度n酶样要充分稀释酶样要充分稀释。n取取3个不同酶量测得的个不同酶量测得的产物量产物量和和酶浓度酶浓度之间为正比关系，这之间为正比关系，这样的酶浓度范围就是适当的。样的酶浓度范围就是适当的。34空白和对照空白和对照n空白：指杂质反应或自发反应引起的变空白：指杂质反应或自发反应引起的变化量，代表未知因素的影响。化量，代表未知因素的影响。n分为分为完全空白完全空白（如

24、测定时要终止反应，（如测定时要终止反应，则空白可先加终止反应试剂再加酶）。则空白可先加终止反应试剂再加酶）。n酶空白酶空白n底物空白底物空白35二、底物与产物的测定方法二、底物与产物的测定方法（酶反应的检（酶反应的检测方法）测方法）1、化学方法化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。n2、分光光度法分光光度法：常用的有常用的有比色法比色法和和紫外分光光度法紫外分光光度法。n3、荧光测定法：荧光测定法：简单、灵敏、快速。简单、灵敏、快速。n4、电化学分析法电化学分析法n（1）离子选择性电极分析法离子选择性电极分析法n（2）微电流法微电流法n5、

25、其他方法其他方法n如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。酶活力测定反应的检测方法酶活力测定反应的检测方法按照酶法分析方法测定酶活性时，需要跟踪酶促反应中按照酶法分析方法测定酶活性时，需要跟踪酶促反应中某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量（速度某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量（速度法），或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化法），或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化量（终点法）。可针对某些易于测定的酶促反应底物或量（终点法）。可针对某些易于测定的酶促反应底物或产物选择具体的检测方法，包括容量分析法、气

26、体检测产物选择具体的检测方法，包括容量分析法、气体检测法、光学检测法、黏度测定法、酶联免疫法等。法、光学检测法、黏度测定法、酶联免疫法等。分光光度法分光光度法若酶促反应中，反应底物或产物之一由于化若酶促反应中，反应底物或产物之一由于化学结构的改变，其吸光度的强度发生变化，可以通过测学结构的改变，其吸光度的强度发生变化，可以通过测定该酶促反应系统的光吸收度的变化量，推算出酶的活定该酶促反应系统的光吸收度的变化量，推算出酶的活力。多数酶类药物的含量检测（效价测定）均采用分光力。多数酶类药物的含量检测（效价测定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、门冬酰胺酶、溶菌酶光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、

27、门冬酰胺酶、溶菌酶等。等。37三、测定条件的选择三、测定条件的选择n1、单因素选择单因素选择n2 2、正交设计、正交设计多因素选择多因素选择381、单因素选择比色法测溶菌酶活性单因素选择比色法测溶菌酶活性n以以染染料料艳艳红红K-2BP标标记记的的 MLysodeikticus为为底底物物，分分解解后后产产生生游游离离染色碎片（产物）染色碎片（产物）n离离心心除除去去未未分分解解底底物物，上清液比色上清液比色n吸吸收收度度为为溶溶菌菌酶酶活活力力的的函数函数。39测定条件选择测定条件选择SpHn（1）酶反应）酶反应底物浓度底物浓度曲线曲线n以以染染料料标标记记的的MLysodeikticus为

28、为底底物物，酶酶量量为为20g时时，1%底物浓度已接近使酶饱和。底物浓度已接近使酶饱和。n（2）酶反应）酶反应PH曲线曲线n磷磷酸酸缓缓冲冲液液和和柠柠檬檬酸酸磷磷酸酸缓缓冲冲液。液。n不不同同组组分分的的缓缓冲冲液液，其其最最适适PH稍稍有有不不同同，选选用用pH6.5磷磷酸酸缓缓冲冲液。液。40测定条件选择离子强度测定条件选择离子强度、反应时间及、反应时间及En（3）离子强度离子强度对酶反应的影响对酶反应的影响n离离子子强强度度在在0.3mol/L以以上上为为宜宜，选用选用0.5mol/L。n（4）酶酶反反应应过过程程曲曲线线(反反应应时时间间)和和酶浓度酶浓度曲线曲线n酶酶量量为为20g

29、时时，反反应应在在30分分钟钟以以内内，吸吸收收度度与与反反应应时时间间有有良良好好的的线线性性关关系系，测测定定系系统统选选用用15分钟分钟。n酶酶量量在在50g之之内内，吸吸收收度度与与酶酶浓度具有线性关系。浓度具有线性关系。41测定条件测定条件n1%染色菌体染色菌体缓冲液缓冲液1mln37水浴保温约水浴保温约5分钟分钟n加加酶试样酶试样0.5ml准确反应准确反应15分钟分钟n加入酸加入酸/乳化剂混合液乳化剂混合液2ml，终止反应，反，终止反应，反应液经离心，上清液于应液经离心，上清液于540nm比色，所得比色，所得吸收度从酶浓度标准曲线即可查出试样中吸收度从酶浓度标准曲线即可查出试样中溶

30、菌酶含量。溶菌酶含量。42二、正交设计多因素选择二、正交设计多因素选择n正交试验设计（正交试验设计（Orthogonalexperimentaldesign）是一种高效的）是一种高效的利用正交表来安排多因利用正交表来安排多因素多水平设计试验素多水平设计试验的方法。的方法。n通过巧妙的安排和分组，通过巧妙的安排和分组，用较少的试验次数，用较少的试验次数，就能就能分析各因素的作用大小分析各因素的作用大小，找出最佳的试验，找出最佳的试验条件。条件。n利用各因素所对应指标的利用各因素所对应指标的极差极差R及平均极差及平均极差D作出判断。作出判断。43正交试验优选中性蛋白酶活力测定条件正交试验优选中性蛋

31、白酶活力测定条件n中中性性蛋蛋白白酶酶是是一一种种蛋蛋白白水水解解酶酶，活活力力测测定定以以酪酪蛋蛋白白为为底底物物，水水解解产产物物与与福福林林试试剂剂在在碱碱性性情情况况下下反反应生成有色物质，于应生成有色物质，于680nm处测定吸收值处测定吸收值。n中中性性蛋蛋白白酶酶作作用用受受缓缓冲冲液液的的pH值值、底底物物浓浓度度、反应时间反应时间及及酶浓度酶浓度等因素的影响。等因素的影响。n供试品：供试品：0.01%的中性蛋白酶溶液。的中性蛋白酶溶液。n底物：酪蛋白底物：酪蛋白44实验方案实验方案n实验取四个因素：实验取四个因素： PH值、底物浓度、值、底物浓度、反应时间、酶浓度反应时间、酶浓

32、度。n每个因素选三水平，属于多因素多水平，每个因素选三水平，属于多因素多水平，为此选用为此选用L9（34）正交表进行实验。正交表进行实验。4546正交试验表正交试验表n实验号A缓冲液pH 值B底物浓度(%)C反应时间(min)D酶浓度（U/ml）11111212223133342123522316231273132832139332147正交实验安排表正交实验安排表nn48正交实验安排表正交实验安排表49各因素试验值计算结果各因素试验值计算结果n平均极差越大，对应的因素影响越大。平均极差越大，对应的因素影响越大。n缓冲液缓冲液PH值值7.2，底物浓度，底物浓度0.5%，酶浓度用，酶浓度用100

33、U/ml为最佳反应条件。为最佳反应条件。n反应时间为反应时间为10，20，30min，对，对OD值无显著影响。值无显著影响。50各因素试验值的方差分析各因素试验值的方差分析结论：结论：PH值（值（A）、底物浓度（底物浓度（B）、酶浓度（酶浓度（D）为非常显著因子；为非常显著因子；反应时间（反应时间（C）为非显著因子。）为非显著因子。51第五节第五节酶类药物的检测酶类药物的检测n肽键水解酶肽键水解酶n脂键水解酶脂键水解酶n糖苷键水解酶糖苷键水解酶n其它（超氧化物歧化酶）其它（超氧化物歧化酶）52一、肽键水解酶一、肽键水解酶n1、胰蛋白酶、胰蛋白酶n2、弹性蛋白酶、弹性蛋白酶n3、尿激酶、尿激酶5

34、3541、胰蛋白酶、胰蛋白酶（Trypsin）n胰胰蛋蛋白白酶酶（Trypsin）：由由动动物物胰胰脏脏中中提提取取的的一一种种蛋蛋白水解酶白水解酶。n牛牛胰胰蛋蛋白白酶酶：223个个氨氨基基酸酸，分分子子量量24000，等等电电点点10.1。n猪猪胰胰蛋蛋白白酶酶：214个个氨氨基基酸酸，分分子子量量23400，等等电电点点10.8。n胰胰蛋蛋白白酶酶最最适适pH为为7.68.0，电电泳泳纯纯的的胰胰蛋蛋白白酶酶的的比比活为活为8000单位单位/mg。55胰蛋白酶胰蛋白酶56胰蛋白酶胰蛋白酶57原理原理n胰胰蛋蛋白白酶酶专专一一作作用用于于赖赖氨氨酸酸、精精氨氨酸酸等等碱碱性性氨氨基基酸酸的

35、的羧羧基基组组成成的的肽肽键键、酰酰胺胺键键及及酯酯键键，水水解解速速度度为为酯酯键键酰酰胺胺键键肽键。肽键。nBAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)nBAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)n苯苯甲甲酰酰L精精氨氨酸酸乙乙酯酯（BAEE）在在胰胰蛋蛋白白酶酶的的作作用用下下，酯酯键键被被水水解解生生成成苯苯甲甲酰酰L精精氨氨酸酸，在在253nm波波长长处处的的吸吸收收度度随随酶酶促促反反应应递递增增，因因此此连连续续记记录录不不同同时时间间的的产产物生产量，根据活力单位定义计算酶活力。物生产量，根据活力单位定义计算酶活力。58测定法：测定法

36、：n取呈取呈直线的吸收度直线的吸收度，按下式计算：，按下式计算：nP为为每每mg供试品含胰蛋白酶的单位供试品含胰蛋白酶的单位，U；A1为直线上终止的吸收度；为直线上终止的吸收度；nA2为直线上开始的吸收度；为直线上开始的吸收度；nT为为A1至至A2读数的时间，读数的时间，min；nW为测定液中供试品的量，为测定液中供试品的量，mg；n吸收度每分钟改变吸收度每分钟改变0.003，即相当于，即相当于1个胰蛋白酶单位个胰蛋白酶单位。下文为中国药典下文为中国药典2012015 5版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种

37、？并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？供供试试品品的的制制备备：精精密密称称取取本本品品适适量量，用用盐盐酸酸（0.001mol/L0.001mol/L）制制成成每每1ml1ml中中含含50506060胰蛋白酶单位的溶液。胰蛋白酶单位的溶液。底底物物溶溶液液的的制制备备：取取N-N-苯苯甲甲酰酰-L-L-精精氨氨酸酸乙乙酯酯盐盐酸酸盐盐85.7mg85.7mg，加加水水溶溶解解使使成成100ml100ml，作为底物原液；底物溶液应在制成后，作为底物原液；底物溶液应在制成后2

38、 2小时内使用。小时内使用。测测定定法法：取取底底物物溶溶液液3.0ml3.0ml，加加盐盐酸酸溶溶液液（0.001ml/L0.001ml/L）0.2ml0.2ml，混混匀匀，作作为为空空白白，取取供供试试品品溶溶液液0.2ml0.2ml加加底底物物溶溶液液（预预热热至至25250.50.5）3.0ml3.0ml，立立即即计计时时并并摇摇匀匀，使使比比色色池池内内温温度度保保持持在在25250.50.5，照照紫紫外外可可见见分分光光光光度度法法在在253nm253nm的的波波长长处处，每每隔隔3030秒秒种种读读取取吸吸收收度度，共共5 5分分钟钟。每每3030秒秒钟钟吸吸收收度度的的变变化化

39、率率应应恒恒定定在在0.0150.0150.0180.018之之间间，呈呈线线性性关关系系的的时时间间不不得得少少于于3 3分分钟钟。若若不不符符合合上上述述要要求求，应应调调整整供供试试品品的的溶溶液液浓浓度度，另另行行测测定定。以以吸吸收收度度为为纵纵坐坐标标，时时间为横坐标做图，取在间为横坐标做图，取在3 3分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算。分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算。式中式中 P P为每为每1mg1mg供试样品中胰蛋白酶的单位数；供试样品中胰蛋白酶的单位数；A A1 1为直线上终止的吸收度；为直线上终止的吸收度；A A2 2为直线上开始的吸收度；为直线上开始的吸收度；T

40、T为为A A1 1至至A A2 2读数的时间（分）；读数的时间（分）；W W为测定液中供试品的量；为测定液中供试品的量；0.0030.003为上述条件下，吸收度每分钟改变为上述条件下，吸收度每分钟改变0.0030.003相当于一个胰蛋白酶单位。相当于一个胰蛋白酶单位。602、胰胰弹性蛋白酶弹性蛋白酶（Elastase）n肽键水解酶肽键水解酶，存在于哺乳动物胰脏。，存在于哺乳动物胰脏。n胰弹性蛋白酶是由胰弹性蛋白酶是由240个氨基酸组成的单一肽链，个氨基酸组成的单一肽链，有四对二硫键。分子量为有四对二硫键。分子量为25900，等电点为，等电点为9.5。n胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解血

41、胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解血红蛋白、酪蛋白等蛋白。红蛋白、酪蛋白等蛋白。n刚果红弹性蛋白刚果红弹性蛋白。61胰胰弹性蛋白酶测定弹性蛋白酶测定原理原理n刚果红弹性蛋白法刚果红弹性蛋白法：以刚果红：以刚果红弹性蛋白为底物，由弹性蛋白为底物，由于刚果红于刚果红弹性蛋白结合的共价键能被弹性酶水解，根弹性蛋白结合的共价键能被弹性酶水解，根据据刚果红在刚果红在495nm处有最大吸收，由标准曲线即可查得处有最大吸收，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。弹性酶单位数。n单位：单位：20分钟水解分钟水解1mg刚果红弹性蛋白刚果红弹性蛋白所需的酶量为所需的酶量为一个弹性酶活力单位一个弹性酶活力单位。62

42、方法方法:n633、尿激酶、尿激酶（Urokinase）n由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶。由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶。n主要作用是激活人体内主要作用是激活人体内纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原使其成为使其成为有活性的有活性的纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。溶解血栓。n天然尿激酶的分子量为天然尿激酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶蛋白溶解酶。64效价测定原理效价测定原理(气泡上升法气泡上升法)n尿激酶尿激酶激活人体内激活人体内纤维蛋白溶酶原纤

43、维蛋白溶酶原使其转化成使其转化成纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶；n纤维蛋白原纤维蛋白原在在凝血酶凝血酶的作用下，转变成的作用下，转变成纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块，此凝块在，此凝块在纤维蛋纤维蛋白溶酶白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。作用下，水解为可溶性小分子多肽。n在在纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原过量的情况下，过量的情况下，尿激酶量尿激酶量与与纤维蛋白凝块的溶解时间纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。的对数成直线关系。65操作操作(气泡上升法气泡上升法)n试管中加试管中加纤维蛋白原纤维蛋白原溶液溶液0.3ml（37水浴）水浴）n标准品标准品(或供试品或供试品)1.0mln加混合溶液加混合溶液0

44、.4mln立即摇匀计时，立即摇匀计时，反应系统应在反应系统应在3045秒内凝结秒内凝结，当当凝块内小气泡上升到系统体积一半时凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应作为反应终点。终点。n以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。纵坐标。66二、脂键水解酶二、脂键水解酶 胰脂肪酶胰脂肪酶(PancreaticLipase)n胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把甘甘油三脂类脂肪油三脂类脂肪水解，最后生成水解，最后生成甘油及脂肪酸甘油及脂肪酸。n底物底物:橄榄油橄榄油n用已知浓度的用已知浓度的标准碱溶液标准碱溶液滴

45、定，可定量地测滴定，可定量地测定定脂肪酸脂肪酸的量，从而得知的量，从而得知脂肪酶脂肪酶活力。活力。67测定测定n68计算计算n每分钟每分钟水解橄榄油水解橄榄油产生产生1mol脂肪酸脂肪酸的酶量，的酶量，为为1个活力单位。个活力单位。n每克含有的胰脂肪酶单位每克含有的胰脂肪酶单位nA:供试品消耗供试品消耗NaOH（0.1mol/L）的体积）的体积nB:空白消耗空白消耗NaOH（0.1mol/L）的体积）的体积nW:供试品取样量（供试品取样量（g）nN:供试品稀释倍数。供试品稀释倍数。69三、糖苷键水解酶三、糖苷键水解酶溶菌酶溶菌酶n蛋清中提取的能蛋清中提取的能分解粘多糖的碱性水解酶分解粘多糖的碱

46、性水解酶。n溶菌酶溶菌酶（Lysozyme）具有抗菌、抗病毒等作具有抗菌、抗病毒等作用。用。n溶菌酶分子量为溶菌酶分子量为1400015000，由，由129个氨基个氨基酸残基组成，等电点为酸残基组成，等电点为10.011.1。n溶菌酶属糖苷溶菌酶属糖苷键键水解酶，能以某些细菌细胞中水解酶，能以某些细菌细胞中的多糖为底物。的多糖为底物。70溶菌酶作用位点溶菌酶作用位点71青霉素青霉素转肽酶底物转肽酶底物末端的二肽末端的二肽D-Ala-D-Ala结构结构72效价测定比浊法效价测定比浊法n以以溶酶小球菌溶酶小球菌为底物，主要成分为为底物，主要成分为粘多糖粘多糖，粘多，粘多糖由糖由NAG和和NAM重复

47、而成。重复而成。n只能水解只能水解NAMC1和和NAGC4之间的之间的1，4糖糖苷键苷键。n溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后，溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后，导致导致溶菌溶菌，溶液的，溶液的吸收度下降吸收度下降。n在一定的条件下，每分钟在一定的条件下，每分钟吸收度下降吸收度下降0.001为一为一个酶活力单位。个酶活力单位。73比浊法测定比浊法测定n计算：计算：n酶活力单位（酶活力单位（u/mg）=nW为测试液中供试品为测试液中供试品的重量（的重量（g）74比色法比色法- -测定溶菌酶活性测定溶菌酶活性n用用染染料料艳艳红红K2BP标标记记的的M.Lysodeikticus

48、为为底底物物，酶酶催催化化细细胞胞壁壁分分解解时时游游离离出出染染色色碎碎片片（产物）（产物）n反反应应后后离离心心除除去去未未分分解解底底物物，上上清清液液比比色色，吸吸收度为溶菌酶活力的函数收度为溶菌酶活力的函数。75溶菌酶效价测定比色法溶菌酶效价测定比色法n76四、超氧化物歧化酶四、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase）n由由动物红细胞动物红细胞制得的金属酶，能催化超氧阴制得的金属酶，能催化超氧阴离子转化成过氧化氢和氧。离子转化成过氧化氢和氧。n来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶（SOD）含铜和锌，分子量）含铜和锌，分子量320

49、00左右。左右。nSOD对热较稳定对热较稳定，在，在pH5.39.5范围内对范围内对酶活性影响不大。酶活性影响不大。n牛红细胞牛红细胞SODPI为为4.95。77效价测定效价测定nSOD测定方法：测定方法：n间接法：使用间接法：使用氧自由基指示清除剂氧自由基指示清除剂，SOD与指示清与指示清除剂竞争除剂竞争O2-，从而抑制指示清除剂与，从而抑制指示清除剂与O2-的结合，的结合，根据根据指示清除剂与指示清除剂与O2-反应速度的变化反应速度的变化可间接测定可间接测定SOD的活性。的活性。n间接法包括：间接法包括：黄嘌呤氧化酶细胞色素黄嘌呤氧化酶细胞色素C法法和和邻苯三邻苯三酚法酚法。78黄嘌呤氧化

50、酶细胞色素黄嘌呤氧化酶细胞色素C法法n原理：原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生尿酸，与此同时产生O2-，氧化型细胞色素，氧化型细胞色素C被被O2-还还原为还原型细胞色素原为还原型细胞色素C，后者在，后者在550nm有最大吸收，因有最大吸收，因此测定氧化性细胞色素此测定氧化性细胞色素C在加入在加入SOD前后的光吸收变化前后的光吸收变化可间接计算酶活性。可间接计算酶活性。79方法方法n80注意点注意点n在特定条件下，在特定条件下，25（pH7.8）每分钟抑制细）每分钟抑制细胞色素胞色素C还原速率达还原速率达50所需要的酶量为一个

51、活所需要的酶量为一个活力单位。力单位。n注意事项：注意事项：n重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体系中必须添加系中必须添加EDTA。n反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素C发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。81邻苯三酚法邻苯三酚法n原理：原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成红红酚，同时生成酚，同时生成O2-，当有，当有SOD存在时由于它存在时由于它能催化能催化O2-与与H+结合生成结合生成O2和和H2O2，从而阻止了

52、，从而阻止了中间产物的积累。中间产物的积累。n定义定义:在一定条件下，在一定条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧化每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达速率达50的酶量的酶量为一个酶活力单位。为一个酶活力单位。82操作操作n定义定义:在一定条件下，在一定条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达化速率达50的酶量的酶量为一个酶活力单位。为一个酶活力单位。83门冬酰胺酶（门冬酰胺酶（L-Asparaginase）n本品系自大肠杆菌（本品系自大肠杆菌（E Ecoli ASI.357coli ASI.357）中提取制备）中提取制备的具有的具有酰氨基水解作用的酶。酰氨基水解作用的酶。n每毫克蛋白含

53、门冬酰胺酶效价不得低于每毫克蛋白含门冬酰胺酶效价不得低于250U250U。抗肿抗肿瘤酶类药物瘤酶类药物( (肿瘤细胞缺乏肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺合成酶门冬酰胺合成酶)。n治疗小儿急性淋巴细胞性白血病和淋巴肉瘤。治疗小儿急性淋巴细胞性白血病和淋巴肉瘤。84测定n在上述规定条件下，每分钟在上述规定条件下，每分钟催化催化L-门冬酰胺水解门冬酰胺水解释放释放1g分子氨所需的酶量分子氨所需的酶量定义定义为为1个酶活力单位个酶活力单位n比活力测定方法：采用比活力测定方法：采用Lowry法测定蛋白质含量，法测定蛋白质含量，比活力比活力=酶活力酶活力(U)/蛋白含蛋白含量量(mg)。85天冬氨酸酶活力的测定天

54、冬氨酸酶活力的测定 ，一个酶活力单位定义为在测定一个酶活力单位定义为在测定条件下，条件下，每小时每克每小时每克细胞转化生细胞转化生成成1mol天冬氨酸所需的酶量天冬氨酸所需的酶量.86实例：尿激酶（实例：尿激酶（urokinase）n本本品品系系从从新新鲜鲜人人尿尿中中提提取取的的一一种种激激活活纤纤维维蛋蛋白白溶酶原溶酶原的酶。的酶。n由由高高分分子子量量54000和和低低分分子子量量33000组组成成的的混混合合物物，高高分分子子量量含含量量不不得得少少于于90%，每每1mg蛋蛋白白中中尿尿激激酶酶活活力力不不得得少少于于12万万U，蛋蛋白分解药物。白分解药物。87尿激酶尿激酶n（一）性状

55、（一）性状n本品为白色非结晶状粉末本品为白色非结晶状粉末n（二）鉴别（二）鉴别n取取比比活活力力测测定定项项下下的的供供试试品品溶溶液液，用用巴巴比比妥妥-氯氯化化钠钠缓缓冲冲液液（pH7.8）稀稀释释成成每每1ml中中含含20U的的溶溶液液，吸吸取取1ml，加加纤纤维维蛋蛋白白原原溶溶液液0.3ml，再再依依次次加加入入纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原溶溶液液0.2ml，凝凝血血酶酶溶溶液液0.2ml，迅迅速速摇摇匀匀，立立即即置置370.5恒恒温温水水浴浴中中保保温温，记记时时，反反应应系系统统应应在在3045s内内凝凝结结，且且凝凝块块在在15min内内重重新新溶溶解解。以以0.9%氯氯化化

56、钠钠溶溶液液作作空空白白，同同法法操操作作，凝凝块在块在2h内不溶。内不溶。88（三）检查（三）检查n1溶液的澄清度与颜色，溶液的澄清度与颜色，应澄清无色。应澄清无色。n2分分子子组组分分比比取取本本品品，加加水水制制成成每每1ml中中含含2mg的的溶溶液液后后，加加入入等等体体积积的的缓缓冲冲液液，置置水水浴浴中中3min，放放冷冷，作作为为供供试试品品溶溶液液；取取供供试试品品溶溶液液10l，加加至至样样品品孔孔，照照电电泳泳法法测测定定，按按下下式式计计算算高高分分子子尿尿激激酶酶相相对含量（对含量（%）。）。89（三）检查（三）检查n3干干燥燥失失重重取取本本品品，以以五五氧氧化化二二

57、磷磷为为干干燥燥剂剂，在在60减压干燥至恒重，减失重量不得过减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%。n4异异常常毒毒性性取取本本品品，加加氯氯化化钠钠注注射射液液制制成成每每1ml中中含含5000U的的溶溶液液，依依法法检检查查，按按静静脉脉注注射射法法给给药药，应符合规定。应符合规定。n5热热原原取取本本品品，加加氯氯化化钠钠注注射射液液制制成成每每1ml中中含含20000U的的溶溶液液，依依法法检检测测，按按家家兔兔体体重重每每1kg注注射射1ml，应符合规定。，应符合规定。906.凝血质样活性物质凝血质样活性物质n（1）血浆的制备）血浆的制备。n（2）复复钙钙试试验验取取小小试试管管，加

58、加血血浆浆0.1ml、6-氨氨基基己己酸酸溶溶液液0.1ml及及巴巴比比妥妥缓缓冲冲液液0.1ml，再再加加入入氯氯化化钙钙溶溶液液观观察察凝凝固固时时间间。以以凝凝固固时时间间最最短短的的一一管所加的氯化钙量，为复钙试验的氯化钙溶液用量。管所加的氯化钙量，为复钙试验的氯化钙溶液用量。n（3）测测定定法法取取小小试试管管加加入入上上述述倍倍比比稀稀释释的的供供试试品品溶溶液液各各0.1ml，再再依依次次加加入入上上述述6-氨氨基基己己酸酸溶溶液液和和血血浆浆各各0.1ml，轻轻轻轻摇摇匀匀，在在25水水浴浴中中，静静置置23min，迅迅速速加加入入已已预预温温至至25的的复复钙钙试试验验所所需

59、需的的上上述述氯氯化化钙钙溶溶液液用用量量，混混匀匀，记记录录放放入入时时间间。注注意意观观察察血血浆浆凝凝固固，观观察察时时轻轻轻轻倾倾斜斜，避避免免影影响凝血过程，记录凝固时间。响凝血过程，记录凝固时间。n空白对照管凝固时间减去供试品管凝固时间等于空白对照管凝固时间减去供试品管凝固时间等于复钙试验凝固缩短时间复钙试验凝固缩短时间。n在在单单对对数数纸纸上上，以以供供试试品品溶溶液液的的浓浓度度为为纵纵坐坐标标，以以复复钙钙试试验验凝凝固固缩缩短短时时间间（s）为为横横坐坐标标，绘绘图图，连连接接不不同同稀稀释释度度的的供供试试品品各各点点，应应成成一一直直线线，此此直直线线外外延延至至纵纵

60、轴轴，与与纵纵轴轴的的交交点点即即表表示示供供试试品品浓浓度度，也也是是凝凝血血质质样样活活性性为为零零值时的供试品酶活力，按每值时的供试品酶活力，按每1ml中供试品的单位表示，每中供试品的单位表示，每1ml应大于应大于150U。91（四）（四）效价测定效价测定(气泡上升法气泡上升法)n原理：激活原理：激活纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原使其转化成使其转化成纤维蛋白溶酶，纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶，纤维蛋白溶酶具有较强的蛋白水解酶的能力。具有较强的蛋白水解酶的能力。n纤维蛋白原纤维蛋白原在在凝血酶凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下

61、，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，的情况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。92操作操作n93计算：计算：n以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标对数为纵坐标。n注意：注意：n影响效价测定的主要因素是影响效价测定的主要因素是纤维蛋白溶酶原、凝纤维蛋白溶酶原、凝血酶及纤维蛋白原血酶及纤维蛋白原，如发现标准曲线斜率低于，如发现标准曲线斜率低于0.3，直线平坦，则纤维蛋白溶解酶原、凝血酶，直线平坦，则纤维蛋白

62、溶解酶原、凝血酶可能失活，需重新标定或更换。可能失活，需重新标定或更换。n效价测定过程中，各试剂需置效价测定过程中，各试剂需置37水浴中。水浴中。94第三节第三节酶活力测定方法酶活力测定方法n固定时间法固定时间法n连续监测法连续监测法n（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法：作指示的连续监测法：n直接测定法直接测定法n偶联法偶联法n三联酶活测定三联酶活测定n（二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法：作指示的连续监测法：n固定浓度法固定浓度法95第四节第四节 酶活性测定方法的设计酶活性测定方法的设计n一、影响因素一、影响因素n二、底物与产物的测定方法二、底物与产物的测定方法n三、三、测定条件的选择测定条件的选择n1、单因素选择单因素选择n 2 2、正交设计正交设计多因素选择多因素选择96第五节第五节酶类药物的检测酶类药物的检测n肽键水解酶肽键水解酶n1、胰蛋白酶胰蛋白酶n2、弹性蛋白酶弹性蛋白酶n3、尿激酶尿激酶（气泡上升法气泡上升法）n脂键水解酶脂键水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶n糖苷键水解酶糖苷键水解酶溶菌酶溶菌酶n其它其它（超氧化物歧化酶，门冬酰胺酶超氧化物歧化酶，门冬酰胺酶）