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1、动物克隆技术动物克隆技术 一、胚胎工程一、胚胎工程二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术三、动物克隆技术三、动物克隆技术四、核移植技术的应用四、核移植技术的应用一、胚胎工程一、胚胎工程1 1 1 1、受精卵、受精卵、受精卵、受精卵 胚胎胚胎胚胎胚胎 胚胎分裂、着床胚胎分裂、着床胚胎分裂、着床胚胎分裂、着床 着床前胚胎着床前胚胎着床前胚胎着床前胚胎“胚胎胚胎胚胎胚胎” 着床后胚胎着床后胚胎着床后胚胎着床后胚胎“胎儿胎儿胎儿胎儿” 胚胎细胞胚胎细胞胚胎细胞胚胎细胞 体细胞体细胞体细胞体细胞四四四四细细 胞胞细细 胞胞囊囊胚胚囊囊胚胚胎胎 儿儿胎胎 儿儿成成 体体成成 体体受受 精精 卵卵受受 精精 卵卵
2、四四四四细细 胞胞细细 胞胞囊囊胚胚囊囊胚胚胎胎 儿儿胎胎 儿儿成成 体体成成 体体受受精精受受精精两性配子的结合两性配子的结合细胞分裂细胞分裂细胞分化细胞分化胚层形成和胚层形成和组 织 发 生组 织 发 生器 官 系 统器 官 系 统新 的 个 体新 的 个 体特定基因表达特定基因表达 2 2 2 2、动物胚胎学、动物胚胎学、动物胚胎学、动物胚胎学四四四四细细 胞胞细细 胞胞囊囊胚胚囊囊胚胚胎胎 儿儿胎胎 儿儿成成 体体成成 体体受受精精受受精精 输卵管 ，输卵管液 子 宫M a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n gM a m m
3、 a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n g出生 培养箱，培养液 子 宫 人 造 子 宫出生 3 3 3 3、动物胚胎、动物胚胎、动物胚胎、动物胚胎工程工程工程工程动物胚胎工程定义动物胚胎工程定义 对配子或胚胎进行人为地干预，使其环境因素、对配子或胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化。这一发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化。这一综合技术，统称为胚胎生物工程，或简称为胚胎工程综合技术，统称为胚胎生物工程，或简称为胚胎工程（embryo engineering)embryo engineering)。 广义
4、而言，胚胎工程包括所有的对配子和胚胎的广义而言，胚胎工程包括所有的对配子和胚胎的操纵以及人为地干预的现代方法。操纵以及人为地干预的现代方法。M a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n gM a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n g4、动物胚胎工程主要技术、动物胚胎工程主要技术u体外受精、显微受精与体外培养技术体外受精、显微受精与体外培养技术u胚胎移植技术胚胎移植技术u卵母细胞与胚胎冷冻保存技术卵母细胞与胚胎冷冻保存技术u嵌合体动物制备技术嵌合体动物制备技术u性别选择与鉴定技
5、术性别选择与鉴定技术u转基因动物制备技术转基因动物制备技术u克隆技术克隆技术二、动物胚胎移植技术二、动物胚胎移植技术供受体的情期同步，超数排卵与受精，受精卵的回收，胚胎质量的评价，移植，妊娠，动物（或人）出生寄母羊羔回收胚胎超 排 的母波尔羊雄波尔羊波尔山羊手术冲卵检卵4细胞细胞2细胞细胞波尔山羊胚胎波尔山羊胚胎移入奶山羊输卵管移植后缝合的创口40日龄B超诊断图波尔羊羔与其养母（莎能奶山羊）动物的胚胎移植技术应用非常动物的胚胎移植技术应用非常广泛，广泛，试管婴儿试管婴儿人的胚胎移植？人的胚胎移植？ 第一代试管婴儿（第一代试管婴儿（第一代试管婴儿（第一代试管婴儿（IVFIVF） 第二代试管婴儿（
6、第二代试管婴儿（第二代试管婴儿（第二代试管婴儿（ISCI)ISCI) 第三代试管婴儿（遗传病第三代试管婴儿（遗传病第三代试管婴儿（遗传病第三代试管婴儿（遗传病诊断）诊断）诊断）诊断）北京时间10月4日下午5点30分，2010年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，英国科学家罗伯特爱德华兹（RobertEdwards）因发展体外授精疗法获奖。罗伯特?爱德华兹1925年出生于英格兰曼彻斯特。二战中服完兵役后，他进入威尔士大学和爱丁堡大学学习生物学，1955年获得博士学位，论文内容为小鼠胚胎发育。1958年他成为英国国立医学研究所研究人员，开始了对人类授精过程的研究。从1963年开始，爱德华兹相继在剑桥大学和B
7、ournHall诊所（世界首个试管授精中心）工作。BournHall由爱德华兹和PatrickSteptoe所建立，爱德华兹担任其研究主任多年。爱德华兹同时还是授精研究领域多本顶尖期刊的编辑。爱德华兹目前是剑桥大学名誉退休教授。早在1950年，爱德华兹就认为IVF可以有助不育症的治疗。通过系统的研究工作，他发现了人类受精的重要原理，并成功实现人类卵细胞在试管（或者更确切地说，是细胞培养皿）中受精。1978年7月25日，世界上第一例试管婴儿的诞生，就是对爱德华兹的不懈努力的最好表彰。在接下来的几年内，爱德华兹和他的同事将IVF进行改良，并将其与世界分享。到目前为止，因为IVF而得以出生的人大约有
8、四百万，他们中的许多人现已成年，甚至有的已为人父母了。在罗伯特?爱德华兹的引领下，对IVF疗法的研究获得了许多重要发现，一门新医学领域也由此诞生。他的贡献代表着现代医学史上的一座里程碑三、克隆技术三、克隆技术（一）克隆概念1 1 1 1、何为克隆？、何为克隆？、何为克隆？、何为克隆？我们生活中还有:?仙人球仙人球木景花木景花荷荷 花花菊菊 花花报罗报罗兰兰 我们生活中还有:? 克隆是英文clone的音译,简单讲就是一种无性繁殖。这门生物技术叫克隆技术. 克隆动物：遗传物质完全一致的一组动物称之为克隆动物。细菌四细胞囊胚胎儿成体2 2 2 2、什么是有性繁殖？、什么是有性繁殖？、什么是有性繁殖？
9、、什么是有性繁殖？与无性繁殖的区别与无性繁殖的区别与无性繁殖的区别与无性繁殖的区别3 3 3 3、实现哺乳动物无性繁殖的途径？、实现哺乳动物无性繁殖的途径？、实现哺乳动物无性繁殖的途径？、实现哺乳动物无性繁殖的途径？第一种途径：孤雌生殖第一种途径：孤雌生殖第一种途径：孤雌生殖第一种途径：孤雌生殖第二种途径：胚胎分割第二种途径：胚胎分割第二种途径：胚胎分割第二种途径：胚胎分割第三种途径：细胞核移植第三种途径：细胞核移植第三种途径：细胞核移植第三种途径：细胞核移植 第第 二二 节节 胚胚 胎胎 分分 割割 胚胎分割是指把着床前胚胎经过切割一分为二、或一分为四、胚胎分割是指把着床前胚胎经过切割一分为
10、二、或一分为四、胚胎分割是指把着床前胚胎经过切割一分为二、或一分为四、胚胎分割是指把着床前胚胎经过切割一分为二、或一分为四、乃至一分为八，然后把这种半胚，乃至一分为八，然后把这种半胚，乃至一分为八，然后把这种半胚，乃至一分为八，然后把这种半胚，1/41/41/41/4胚、和胚、和胚、和胚、和1/81/81/81/8胚移入受体生殖道胚移入受体生殖道胚移入受体生殖道胚移入受体生殖道后发育成个体。后发育成个体。后发育成个体。后发育成个体。 关键：一是分割后的胚胎能否发育成个体；关键：一是分割后的胚胎能否发育成个体；关键：一是分割后的胚胎能否发育成个体；关键：一是分割后的胚胎能否发育成个体； 二是分割
11、后获得的效率二是分割后获得的效率二是分割后获得的效率二是分割后获得的效率。 1 1 1 1、分割后的胚胎能否发育成个体、分割后的胚胎能否发育成个体、分割后的胚胎能否发育成个体、分割后的胚胎能否发育成个体动动动动物物物物种种种种类类类类胚胎分胚胎分胚胎分胚胎分割数割数割数割数妊娠率妊娠率妊娠率妊娠率（% % % %）半胚移植半胚移植半胚移植半胚移植一对半胚移一对半胚移一对半胚移一对半胚移植植植植同卵双胎同卵双胎同卵双胎同卵双胎妊娠（妊娠（妊娠（妊娠（% % % %）产仔（产仔（产仔（产仔（% % % %）黄黄黄黄牛牛牛牛9292929246/9646/9646/9646/96（47.47.47.
12、47.9 9 9 9）54/18154/18154/18154/181(29.8)(29.8)(29.8)(29.8)46/175(26.346/175(26.346/175(26.346/175(26.3) ) ) )8/35(22.9)8/35(22.9)8/35(22.9)8/35(22.9)奶奶奶奶牛牛牛牛18518518518579/19279/19279/19279/192(41.1)(41.1)(41.1)(41.1)101/341101/341101/341101/341(29.6)(29.6)(29.6)(29.6)95/341(27.995/341(27.995/341(2
13、7.995/341(27.9) ) ) )23/58(39.723/58(39.723/58(39.723/58(39.7) ) ) )绵绵绵绵羊羊羊羊7777777736/7736/7736/7736/77(46.8)(46.8)(46.8)(46.8)48/14048/14048/14048/14034.3)34.3)34.3)34.3) 10/28(35,710/28(35,710/28(35,710/28(35,7) ) ) )绵绵绵绵羊羊羊羊5656565637/5637/5637/5637/56(66.1)(66.1)(66.1)(66.1)12/5612/5612/5612/56
14、(21.4)(21.4)(21.4)(21.4)12/56(20.4)12/56(20.4)12/56(20.4)12/56(20.4)25/36(44.625/36(44.625/36(44.625/36(44.6) ) ) )山山山山羊羊羊羊10010010010027/10027/10027/10027/100(27.0)(27.0)(27.0)(27.0)18/10018/10018/10018/100(18)(18)(18)(18)19/100(19.019/100(19.019/100(19.019/100(19.0) ) ) )8/100(8.008/100(8.008/100(
15、8.008/100(8.00) ) ) )马马马马* * * *2 2 2 22/42/42/42/4(50.0)(50.0)(50.0)(50.0)2/42/42/42/4(50.0)(50.0)(50.0)(50.0)2/4(50.0)2/4(50.0)2/4(50.0)2/4(50.0) *每个受体仅移一个半胚2 2 2 2、分割后获得的效率、分割后获得的效率、分割后获得的效率、分割后获得的效率 ( ( ( (理论能够提高一倍）理论能够提高一倍）理论能够提高一倍）理论能够提高一倍）方法胚胎数移植受体*妊娠(%)产仔数(%)平均每个胚胎产犊分割 *666642/66(63.6)39/120
16、(32.5)39/66(0.59)整胚移植757530/75(40.0)30/75(40.0)30/75(0.40)*分割：每个受体移二个半胚；整胚移植：每个受体移一个胚胎. 表明,按每个胚胎的产犊数，胚胎分割的产犊效率较整胚移植可提高20%左右,其效率的提高主要表现在妊娠率的提高,显然是和每头受体移植胚胎数有关。其次是半胚移植后的同卵双胎。 乳牛胚胎分割和常规整胚胎移植效率比较乳牛胚胎分割和常规整胚胎移植效率比较 3 3 3 3、胚胎分割方法、胚胎分割方法、胚胎分割方法、胚胎分割方法 （1)1)1)1)针切割针切割针切割针切割 （2)2)2)2)刀切割刀切割刀切割刀切割 3 3 3 3、胚胎
17、切割中存在的问题、胚胎切割中存在的问题、胚胎切割中存在的问题、胚胎切割中存在的问题 （1 1 1 1）切割胚胎的发育期：显然胚胎切割后的存活率是和胚胎具）切割胚胎的发育期：显然胚胎切割后的存活率是和胚胎具）切割胚胎的发育期：显然胚胎切割后的存活率是和胚胎具）切割胚胎的发育期：显然胚胎切割后的存活率是和胚胎具有的细胞数有关。有的细胞数有关。有的细胞数有关。有的细胞数有关。（2 2 2 2）胚胎分割次数和分割胚的发育）胚胎分割次数和分割胚的发育）胚胎分割次数和分割胚的发育）胚胎分割次数和分割胚的发育; ; ; ;从理论上讲分割次数越多从理论上讲分割次数越多从理论上讲分割次数越多从理论上讲分割次数越
18、多其可获得的同卵多胎越多其可获得的同卵多胎越多其可获得的同卵多胎越多其可获得的同卵多胎越多, , , ,事实上胚胎最终发育成个体必须有事实上胚胎最终发育成个体必须有事实上胚胎最终发育成个体必须有事实上胚胎最终发育成个体必须有一个最低细胞数一个最低细胞数一个最低细胞数一个最低细胞数. . . . 分割次数动物种类分割胚胎数分割胚移植数妊娠(%)出生(%)平均每个胚胎获后代四分胚奶牛13396/20(30.3)6/39(15.48)6/13(0.461)牛20715/22(22.72)5/71(7.04)5/20(0.25)绵羊301067/24(29.16)10/106(9.43)10/30(0
19、.33)八分胚绵羊11832/31(6.45)2/83(2.4)2/11(0.18)（3 3 3 3）胚胎质量：用于分割的胚胎其质量显然影响效率）胚胎质量：用于分割的胚胎其质量显然影响效率）胚胎质量：用于分割的胚胎其质量显然影响效率）胚胎质量：用于分割的胚胎其质量显然影响效率 胚胎等级分割 胚胎数妊娠率(%)囊胚产犊率(%)优3522-35(62.9)24/66(36.4)良2312/23(52.9)9/40(22.5)可83/8(37.5)2/16(12.5)（4 4 4 4）分割胚胎在体外操作时间）分割胚胎在体外操作时间）分割胚胎在体外操作时间）分割胚胎在体外操作时间: : : : 在胚胎
20、质量良好和合适的培养在胚胎质量良好和合适的培养在胚胎质量良好和合适的培养在胚胎质量良好和合适的培养条件情况下条件情况下条件情况下条件情况下, , , ,分割胚胎在体外的时间并不影响半胚的出生率；分割胚胎在体外的时间并不影响半胚的出生率；分割胚胎在体外的时间并不影响半胚的出生率；分割胚胎在体外的时间并不影响半胚的出生率；在体外时间(小时)妊娠率(%)囊胚出生率(%)1.5-3.015/25(60.0)8/38(21.1)3.1-5.06/11(54.5)6/22(27.2)5.1-8.016/30(53.5)16/60(27.6)5 5、胚胎切割的在家畜生产中的应用、胚胎切割的在家畜生产中的应用
21、（1 1）分割胚可以发育成个体）分割胚可以发育成个体. .半胚能提高生产率半胚能提高生产率, ,四分胚和八分四分胚和八分胚则因分割胚细胞数减少而降低胚则因分割胚细胞数减少而降低, ,无实用价值。无实用价值。（2 2）胚胎分割可获同卵双胎）胚胎分割可获同卵双胎( (克隆动物克隆动物) )其效率在其效率在30%30%左右。首左右。首选是把一个卵对切后二个半胚同移于一个受体。选是把一个卵对切后二个半胚同移于一个受体。（3 3）胚胎分割技术可用于胚胎的基因型鉴定。）胚胎分割技术可用于胚胎的基因型鉴定。Nature,2004,428(22):860a a、b, b,孤雌发育的小鼠；孤雌发育的小鼠；c,d
22、c,d 妊娠妊娠19.5d19.5d的孤雌发育的小鼠（死亡）；的孤雌发育的小鼠（死亡）；e,e,孤雌发育的小鼠自然繁殖的后代孤雌发育的小鼠自然繁殖的后代第第 三三 节节 孤孤 雌雌 发发 育育概概 念：念：是指雌性生殖细胞不经受精作用而直接成胚的一种生是指雌性生殖细胞不经受精作用而直接成胚的一种生是指雌性生殖细胞不经受精作用而直接成胚的一种生是指雌性生殖细胞不经受精作用而直接成胚的一种生殖方式殖方式殖方式殖方式. .作为一种特殊的遗传生殖发育形式作为一种特殊的遗传生殖发育形式作为一种特殊的遗传生殖发育形式作为一种特殊的遗传生殖发育形式第第四四节节 核核移移植植动动物物一、核移植动物制备方法制备
23、核移植动物主要有三种方法制备核移植动物主要有三种方法核移植动物制备方法核移植动物制备方法去、移核操作过程图去、移核操作过程图去、移核操作过程图去、移核操作过程图去核前去核中移核前移核中融合体内培养的NT羊胚胎克克隆隆猴猴技技术术路路线线克隆人？克隆人？核移植动物制备方法核移植动物制备方法克隆动物制备程序克隆动物制备程序ABCDDay 7 blastocyst without zonaHandmade somatic cell cloned bovine embryos developing in WOWs at day 2 (a), day 3 (b), day 4 (c), day 6 (d
24、) after reconstruction. 二、种二、种间核间核移植移植何为种何为种何为种何为种间核间核间核间核移植（克隆）？移植（克隆）？移植（克隆）？移植（克隆）？何为亚种间核移植（克隆）？何为亚种间核移植（克隆）？何为亚种间核移植（克隆）？何为亚种间核移植（克隆）？为什么要做种间核移植？为什么要做种间核移植？为什么要做种间核移植？为什么要做种间核移植？克隆类别克隆类别克隆类别克隆类别供质供质供质供质供核供核供核供核种内核移植种内核移植种内核移植种内核移植物种物种物种物种1 1 1 1物种物种物种物种1 1 1 1亚种间核移植亚种间核移植亚种间核移植亚种间核移植物种物种物种物种1 1
25、1 1亚种亚种亚种亚种1 1 1 1种种种种间核移植间核移植间核移植间核移植物种物种物种物种1 1 1 1物种物种物种物种2 2 2 2三、核移植动物研究进展三、核移植动物研究进展（一）（一）（一）（一） 异种体细胞核移植动物进展异种体细胞核移植动物进展异种体细胞核移植动物进展异种体细胞核移植动物进展供质动物供核囊胚发育率（）受体供核动物供核细胞类型受体动物数量妊娠数妊娠率出生克隆动物猪鼠8-cell卵裂球0/兔大熊猫子宫上皮细胞9.99.99.99.9/骨骼肌细胞6.86.86.86.8/乳腺上皮细胞11.711.711.711.7/家猫2129.52 0牛耳成纤维细胞11.111.111.
26、111.1/人颗粒细胞18.218.218.218.2/成纤维细胞6.16.16.16.1/软骨细胞7.37.37.37.3、/鼠8-cell卵裂球5.45.45.45.4/奶牛绵羊成年皮肤成纤维细胞13.913.913.913.9绵羊14857.14 0猪成年皮肤成纤维细胞14.314.314.314.3猪25312.00 0猴成年皮肤成纤维细胞16.616.616.616.6/大鼠成年皮肤成纤维细胞NANANANA大鼠3226.25 0牦牛颗粒细胞10.910.910.910.9/狗颗粒细胞0.40.40.40.4/印度野公牛皮肤成纤维细胞12121212奶牛(cow)32825.00 0
27、白臀野牛皮肤成纤维细胞NONONONO奶牛(cow)301653.33 1羚牛5 5 5 5/牦牛28282828/绵羊盘羊颗粒细胞30.430.430.430.442501供供核核: :印度野牛印度野牛供质：家养奶牛卵母细胞供质：家养奶牛卵母细胞受体：家养奶牛受体：家养奶牛CLONING，Volume2,Number2,2000naturebiotechnologyVOLUME19OCTOBER2001供供核核: : 殴洲盘羊殴洲盘羊供质：绵羊供质：绵羊受体：绵羊受体：绵羊SCIENCEVOL30018APRIL2003供供核核: :白臀野牛白臀野牛供质：家养奶牛卵母细胞供质：家养奶牛卵母细
28、胞受体：家养奶牛受体：家养奶牛（二）（二） 种内体细胞核移植动物进展核种内体细胞核移植动物进展核供核细胞类型分化程度存活克隆动物胚胎细胞分裂球小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛、猴桑椹、囊胚内细胞团细胞兔、山羊、绵羊、猪、牛胚胎干细胞兔、牛、小鼠胎儿细胞胚盘细胞（16天）绵羊胎儿成纤维细胞（32-40天）山羊、绵羊、牛胎儿肌肉细胞（60天）牛成体细胞乳腺上皮细胞（6岁）绵羊皮肤（2周）牛颗粒细胞小鼠、山羊，猫神经细胞、足细胞小鼠第一极体小鼠尾尖细胞小鼠输卵管上皮细胞牛成年皮肤成纤维细胞牛，山羊，马，狗胎儿成纤维细胞山羊，猪，绵羊，雪貂，骡Nature.1997Feb27;385(6619):810-
29、3.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cellsReconstituted embryos (left) after coculture with BRL cells in vitro or 2 days (X200). Rhesus monkey infants (right) produced by nuclear transfer technology.BiolReprod.1997Aug;57(2):454-9.Full-termdevelopmentofmicefromenucleatedoocytesin
30、jectedwithcumuluscellnucleiNature.1998,394(6691):369-74.Clonedmice.a,Thefirstsurvivingclonedmouse,Cumulina(born3October1997)atfourweeks(foreground)withherfostermother.b,Cumulinaat2.5monthswiththepupssheproducedfollowingmatingwithaCD-1(albino)male.c,TwoB6C3F1-derived,cloned,agoutiyoung(centre)infront
31、oftheiralbinofostermother(CD-1),andaB6D2F1oocytedonor(black,right).Thetwoagoutioffspringinthecentreareclones(identicaltwinsisters)oftheagoutiB6C3F1cumulusdonorshownontheleft,andaretwooftheoffspringdescribedinseriesC(seetext)Tetra, a nonhuman primate quadruplet cloned from an eight-cell embryo by spl
32、itting Science.2000Jan14;287(5451):317-9PNAS,97(3):990-995,2000Theclonedcalvesandthe17-year-oldbullusedforcloning.Clonedcalvesfromlefttoright:Pass15-A,Pass15-B,Pass10-B,andPass10-C.Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cellsNatureBiotechnology2002,366-369(A)Clonedrabbit0107w
33、ithcorrespondingcontrols:(A1)expressionoftheEGFPproteinfluorescence(arrowhead)detectedbyconfocalmicroscopyfromhairfolliclesobtainedfromanearbiopsyat1monthofage;(A2)thesameundertransmissionlight;(A3)amplificationsoftheEGFPtransgene(PCR2)andoftheexon10oftheCFTRgeneusedasDNAqualitycontrol(PCR1)withexpe
34、ctedfragmentsizesof240bpfortheCFTRgeneand350bpfortheEGFPtransgene.Thisconfirmsthatrabbit0107anditslittermate107b(whodied1dayafterbirth)werederivedfromthedonorcumuluscell.(B1,B2)Threeotherrabbitsfromtwodifferentlitters;rabbitsinB1havenowprovedtobefertile.Targeteddisruptionofthealpha1,3-galactosyltran
35、sferasegeneinclonedpigsNatBiotechnol.2002Mar;20(3):251-5a,Adultfemalecatthatsuppliedcumuluscellsfornucleartransplantation.ThecellswereculturedinDMEM/F12mediumfor5daysat37Cuntilconfluent;micromanipulationwasusedtoenucleateovaobtainedafterroutineovariohysterectomyandtotransferthedonorscumuluscellsinto
36、theperivitellinespace.Enucleatedovaandcumuluscellswerefusedbyelectrofusion;asecondelectropulsewasappliedtoactivatetheoocytes.b,Thesurrogatemother,asynchronizedrecipientofthreeclonedembryos,producedoneclonedkitten,whichwasdeliveredbycaesariansection66daysafterembryonictransfer.Forfurtherdetails,seesu
37、pplementaryinformation.AcatclonedbynucleartransplantationNature415,859(21February2002)|doi:10.1038/nature723ProductionofclonedgoatsafternucleartransferusingadultsomaticcellsBiolReprod.2002Jan;66(1):199-203.a)Granulosacelldonor(IDno.356).b)Granulosacellclone(GC2.1)derivedfromthedonorgoatshownina.c)Gr
38、anulosacelldonor(IDno.358).d)Granulosacellclones(GC2.3,GC2.4,GC2.5,andGC2.6)derivedfromthedonorgoatshowninc.www.sciencemag.org SCIENCE VOL 301 22 AUGUST 2003 1063A Mule Cloned from Fetal Cells by Nuclear Transfer Clonedmulefoal,namedIdahoGem,bornon4May2003.Photographtaken5May2003;copyrightPhilSchofi
39、eld,UniversityofIdaho.骡骡NATURE| VOL424| 7AUGUST2003|Theclonedfoal,namedPrometea,withitsgeneticallyidenticalmothersevendaysafterbirth.Thecellsusedforcloningwerederivedfromaskinbiopsyofthemare.Theenucleatedoocyteswereobtainedbyinvitromaturationandremovalofthenucleusfromoocytesrecoveredfromhorseovaries
40、fromanabattoir.Afterembryoreconstructionbymicromanipulationandcellfusion,thecleavedembryoswereculturedinvitrototheblastocyststage.Twoofthederivedembryosweretransferredintothemaredonorofthecellline.Asinglepregnancywasestablishedandwascarriedtotermwiththebirthofafemalefoalwhoisgeneticallyidenticaltohe
41、rsurrogatemother.a,Snuppy,thefirstcloneddog,at67daysafterbirth(right),withthethree-year-oldmaleAfghanhound(left)whosesomaticskincellswereusedtoclonehim.SnuppyisgeneticallyidenticaltothedonorAfghanhound.b,Snuppy(left)wasimplantedasanearlyembryointoasurrogatemother,theyellowLabradorretrieverontheright
42、,andraisedbyher.DogsclonedfromadultsomaticcellsNature.2005Aug4;436(7051):641ClonedferretsproducedbysomaticcellnucleartransferDevBiol.2006May15;293(2):439-48.Epub2006Apr3.Fig.2.(A)Twoclonedsablecoat-colorfemaleferretpups,LibbyandLilly(at7weeksofage),producedbySCNTandETintoanalbinosurrogateJill.(B)Lil
43、lywithher6newbornpups.(C)Libbywithher10newbornpups.（三）上海转基因研究中心（三）上海转基因研究中心 获得的克隆动物获得的克隆动物SP3179SP3179号波尔羊克隆羊号波尔羊克隆羊SP3179SP3179SP3179SP3179CB-1CB-1CB-1CB-1CB-2CB-2CB-2CB-2CB-3CB-3CB-3CB-3CB-4CB-4CB-4CB-4CB-5CB-5CB-5CB-5CB-6CB-6CB-6CB-6CB-7CB-7CB-7CB-7138138138138号杂交一代波尔羊克隆羊号杂交一代波尔羊克隆羊号杂交一代波尔羊克隆羊号杂交
44、一代波尔羊克隆羊 138138138138CO-2CO-2CO-2CO-2CO-4CO-4CO-4CO-4CO-6CO-6CO-6CO-6CB-1OCB-1OCB-1OCB-1OCO-12CO-12CO-12CO-12CO-14CO-14CO-14CO-14CO-16CO-16CO-16CO-16CO-8CO-8CO-8CO-8No.1No.2No.3No.4No.5No.6No.7No.8No.9杂交二代波尔羊克隆羊杂交二代波尔羊克隆羊No.10No.11No.12No.13No.14No.15C C、获得了获得了LOXPLOXP基因打靶的体细胞及基因打靶的体细胞及其克隆山羊（存活其克隆山羊
45、（存活1616头）；头）；B B、获得了人溶菌酶基因打靶的体细获得了人溶菌酶基因打靶的体细胞及其克隆山羊（存活胞及其克隆山羊（存活5 5头）头）A A、获得了获得了人乳铁蛋白基因打靶的体人乳铁蛋白基因打靶的体细胞及其克隆山羊（存活细胞及其克隆山羊（存活1212头）头）基因打靶体细胞克隆羊四、影响核移植动物成功率的因素四、影响核移植动物成功率的因素 卵母细胞去核率 约70% 移核成功率 约90% 融合率 约80% 重构胚发育成囊胚 约30% 移入受体母畜产生后代 约30% 核移植最终获得后代 约3.8%核移植流程中各步骤的参数核移植流程中各步骤的参数（一）核移植操作技术（二）供核细胞（三）供质细
46、胞卵母细胞（四）核移植胚胎的着床及着床后的发育（五）分娩与克隆动物的出生后护理影响核移植动物成功率的因素影响核移植动物成功率的因素（一）核移植操作技术对克隆效率的影响（一）核移植操作技术对克隆效率的影响（一）核移植操作技术对克隆效率的影响（一）核移植操作技术对克隆效率的影响1 1 1 1、去核：（盲去、荧光下去核、化学去核、切割）、去核：（盲去、荧光下去核、化学去核、切割）、去核：（盲去、荧光下去核、化学去核、切割）、去核：（盲去、荧光下去核、化学去核、切割） 移核：胞质移核：胞质移核：胞质移核：胞质2 2 2 2、融合：电融合、仙台病毒、融合：电融合、仙台病毒、融合：电融合、仙台病毒、融合：
47、电融合、仙台病毒3 3 3 3、激活、激活、激活、激活4 4 4 4、NTNTNTNT胚胎的培养胚胎的培养胚胎的培养胚胎的培养5 5 5 5、NTNTNTNT胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植带下带下带下带下（二）供核细胞对克隆效率的影响因素（二）供核细胞对克隆效率的影响因素（二）供核细胞对克隆效率的影响因素（二）供核细胞对克隆效率的影响因素1、供核的分化程度对克隆效率的影响（1 1 1 1）胚胎细胞胚胎分裂球（）胚胎细胞胚胎分裂球（）胚胎细胞胚胎分裂球（）胚胎细胞胚胎分裂球（64-64-64-64-囊胚）囊胚）囊胚）囊胚）（2 2 2 2）胚胎干细胞（）胚胎干细胞（）胚胎干细胞（）胚胎干细胞（
48、ESESESES细胞）细胞）细胞）细胞）（3 3 3 3）体细胞（颗粒细胞、成纤维细胞）体细胞（颗粒细胞、成纤维细胞）体细胞（颗粒细胞、成纤维细胞）体细胞（颗粒细胞、成纤维细胞）1、供核的、供核的分化程度分化程度对克隆效对克隆效率的影响率的影响2、供核的类型对克隆效率的影响（三）供质细胞供质卵母细胞对克隆效率的影响（三）供质细胞供质卵母细胞对克隆效率的影响（三）供质细胞供质卵母细胞对克隆效率的影响（三）供质细胞供质卵母细胞对克隆效率的影响2-2-细胞胞质细胞胞质受精卵胞质受精卵胞质MIIMII卵母细胞（卵母细胞（In Vivo and In vitroIn Vivo and In vitro）
49、Serial Pronuclear Transfer Increases the Developmental Potential of In Vitro-Matured Oocytes in Mouse Cloning1（四）核移植胚胎的着床及着床后的发育（四）核移植胚胎的着床及着床后的发育（四）核移植胚胎的着床及着床后的发育（四）核移植胚胎的着床及着床后的发育1、着床或妊娠率：受体的同步性2、着床后的发育率（五）分娩与克隆动物的出生后护理（五）分娩与克隆动物的出生后护理（五）分娩与克隆动物的出生后护理（五）分娩与克隆动物的出生后护理1 1 1 1、妊娠期、妊娠期、妊娠期、妊娠期2 2 2 2
50、、分娩与助产、分娩与助产、分娩与助产、分娩与助产3 3 3 3、刚出生克隆动物的护理、刚出生克隆动物的护理、刚出生克隆动物的护理、刚出生克隆动物的护理M a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n gM a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n g四、核移植技术的应用四、核移植技术的应用第一个方面：在基础理论问题的研究第一个方面：在基础理论问题的研究第二个方面：在动物生产上的应用第二个方面：在动物生产上的应用第三个方面：在生物医药上的应用第三个方面：在生物医药上的应用第一个方面：在
51、基础理论问题的研究，如：，如： 核质之间的相互作用核质之间的相互作用 卵裂开始到着床前的发育母源性基因调控胚胎细胞全卵裂开始到着床前的发育母源性基因调控胚胎细胞全性的调控到胚胎基因的调控；性的调控到胚胎基因的调控； 器官形成与组织发生的研究组织发生的分子机制、基因器官形成与组织发生的研究组织发生的分子机制、基因表达的时空调的研究等表达的时空调的研究等M a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n gM a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n g第二方面：在动物生产上的应用第二方面
52、：在动物生产上的应用 (1)(1)(1)(1)挽救濒危动物挽救濒危动物挽救濒危动物挽救濒危动物M a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n gM a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n g (2) 快速扩大优质种畜群快速扩大优质种畜群M a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n gM a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n g (3) (3) 改造和培育动物新品
53、种改造和培育动物新品种改造和培育动物新品种改造和培育动物新品种 转基因动物克隆动物转基因动物克隆动物转基因动物克隆动物转基因动物克隆动物 生长快的动物（含人生长素基因的转基因小鼠）生长快的动物（含人生长素基因的转基因小鼠）生长快的动物（含人生长素基因的转基因小鼠）生长快的动物（含人生长素基因的转基因小鼠） 动物乳腺生物反应器（含人蛋白基因的转基因家畜）动物乳腺生物反应器（含人蛋白基因的转基因家畜）动物乳腺生物反应器（含人蛋白基因的转基因家畜）动物乳腺生物反应器（含人蛋白基因的转基因家畜） 抵抗某些传染病的动物品种，如不感染疯牛病的转抵抗某些传染病的动物品种，如不感染疯牛病的转抵抗某些传染病的动
54、物品种，如不感染疯牛病的转抵抗某些传染病的动物品种，如不感染疯牛病的转基因牛羊等基因牛羊等基因牛羊等基因牛羊等 M a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n gM a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n g第三个方面：在生物医药上的应用第三个方面：在生物医药上的应用 (1) (1) 生产人用珍贵蛋白（家畜生物反应器）生产人用珍贵蛋白（家畜生物反应器）生产人用珍贵蛋白（家畜生物反应器）生产人用珍贵蛋白（家畜生物反应器）供体供体动物动物产品产品临床试验临床试验治疗疾病治疗疾病开发公
55、司开发公司绵羊改造的人纤维蛋白原临床前手术和外伤止血PPL山羊人抗凝血酶III申请上市遗传性抗凝血酶缺陷GTC山羊组织型纤溶酶原激活剂/冠状动脉凝血GTC多种动物多种单克隆抗体临床前/风湿性关节炎等GTC兔人的C1抑制因子遗传血管性水肿Pharming兔人-葡萄糖苷酶/Pompes疾病Pharming牛人的纤维蛋白原临床前手术和外伤止血Pharming奶牛人的胶原蛋白临床前外科Pharming奶牛人的乳铁蛋白期完成药品和营养添加成分PharmingMammal Embryo Bio-engineeringMammal Embryo Bio-engineering(2) (2) 提供人类器官移植
56、用组织器官提供人类器官移植用组织器官提供人类器官移植用组织器官提供人类器官移植用组织器官-治疗性克隆治疗性克隆治疗性克隆治疗性克隆-供人类器官移植用猪器供人类器官移植用猪器供人类器官移植用猪器供人类器官移植用猪器官官官官克隆出可用于人体器官移植的猪克隆出可用于人体器官移植的猪-英国英国Targeteddisruptionofthes1,3galactosyltransferasegeneinclonepig.NatureBiotech.2002,M a m m a l E m b r y o B i o - e n g i n e e r i n gM a m m a l E m b r y
57、o B i o - e n g i n e e r i n g四、精子介导法将外源DNA与精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入受精卵。此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不能重复。Lavitrano, M. et al. (1989) Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 57, 717723最引人注目的报道是意大利学者Lavitrano等在小鼠上进行的研究,他们
58、将获得的小鼠附睾精子与线粒体或环状pSV2CAT质粒一起37孵育30min后,再与成熟卵子进行体外授精,这样得到的胚胎在2-细胞期移植入受体鼠的输卵管内,在受体鼠产出的250只体外受精鼠有30%(70/250)为阳性个体。实验还发现阳性个体中转入的基因可以稳定地整合入生殖细胞系,而且在转基因的后代个体的组织器官中,特别是在尾组织和肌肉组织中可检测到CAT基因的表达。Lavitrano,M.et al. (1989)SpermcellsasvectorsforintroducingforeignDNAintoeggs:genetictransformationofmice.Cell 57, 71
59、7723在Lavitrano的文章发表不久,Binster等根据Lavitrano的实验方案,用近10种基因结构、6个不同品系的小鼠、多种培养液和不同基因浓度在得到的1500只小鼠中没有阳性结果,这使人们对精子载体法变得谨慎和怀疑.SMGT方法离不开精子。精液来源、精液品质、精清、精子质膜和精液处理方法等构成了SMGT方法的精子因素。同时,SMGT方法被认为制备转基因小鼠、猪、兔、羊.精子载体转基因机理精子携带外源DNA的条件Spadafora等1998年的研究结果表明,几乎所有动物的精子都具有与外源DNA结合的能力,但只有附睾精子和经洗涤去除精清的射出精子才能够有效携带外源DNA,这说明精清
60、中的某些成分强烈抑制外源DNA的结合。在自然受精时,因为精清对精子的保护作用,杜绝了外源遗传物质对遗传稳定性的干扰,避免了物种的变异。目前,已在哺乳动物精清中和低等动物(如海胆)的精子表面发现了一种颉颃DNA结合的抑制因子(称为IF-1),来源于海胆精子的IF-1的提取物经纯化分析,确定它是一种37kDa的糖蛋白.精子结合外源DNA的核内化过程核内化的发生是在结合的最初几分钟开始并有精子细胞膜上CD4分子进行信号传导,DNA结合蛋白(DBP)与外源DNA形成的核蛋白复合体(DBP/DNA)是产生核内化的触发信号,使得DNA/DBP/CD4复合体进入精子内并穿过核孔抵达核基质区,此时DNA与DB
61、P/CD4解离,DBP和CD4分子返回精子细胞膜,继续介导其他的外源DNA进入精子细胞核内,而外源DNA则与核基质(MAR)区在染色体的拓朴异构酶的作用下发生外源基因的整合。精子与外源DNA结合的因素DNA片断的长短,大片段(7kb)较小片段(150750bp)更容易被精子所摄取DNA、多聚阴离子、低等电点的蛋白质等物质与精子相结合的过程中这些分子的电荷密度具有决定意义。分子电荷性的重要性最近已得到进一步证实:精子-DNA复合体可以很容易地被高盐溶液(250700mmol/LNaCl离子梯度)分开14。由于多聚阴离子物质在精子头部结合部位相同,因此存在一种特殊底物蛋白即DNA结合蛋白(DBP)
62、,这种蛋白充当精子和核酸相互作用底.正常生理条件下,动物排出的精液中含有特异的抑制因子IF-1,使精子失去了与外源DNA的结合能力。对精子和附睾精子的清洗可提高精子与DNA结合效率.精子获能是一个极其复杂的生理过程,受多种因素的影响,其中与Ca+、K+、Na+等离子的浓度密切相关.小结方法显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒精子介导优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点整合技术外源DNA的整合率高；整合在生殖细胞中的比例也很高。 可在整合点整合转移基因的单个拷贝； 该方法简单、方便 缺点精密仪器， 技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变供体细胞易衰老ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在动物各种组织中的分布不均 有些结果不能重复 Thank you
