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1、仪器分析曾曾 瑾瑾生命科学学院生命科学学院l分光光度技术(分光光度法)主要是指利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是Lambert和Beer定律。第一章第一章 紫外可见分光光度技术紫外可见分光光度技术紫外可见吸收光谱法的应用l可进行定量分析，l可用来对紫外可见光区具有吸收的物质进行定性鉴定和结构分析，l可用于测定有关的化学或物理化学常数，如平衡常数、配合物的配位比等。利用紫外可见吸收光谱法进行定量分析时，具有以下特点：l灵敏度高 一般可测定10-6g级的物质，在某些条件下，甚至达10-9g级的物质，适用于微量组分的测定；l准确度高 相对误差一般可达1以下；l选择性好 复
2、杂组分的系统中，不需要别离，即能检测出其中所含的极少量物质：l操作简便 分析速度快；l应用范围广 可用于无机物和有机化合物的定量测定，不仅用于微量组分的测定，还用于常量组分(用示差分光光度法)和多组分混合物的测定。 第一节第一节 根本原理根本原理 一、一、光分析法及其特点光分析法及其特点( optical analysis and its characteristics)optical analysis and its characteristics) 光光分分析析法法：基基于于电电磁磁辐辐射射能能量量与与待待测测物物质质相相互互作作用用后后所所产产生生的的辐辐射信号与物质组成及结构关系所建立
3、起来的分析方法；射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法； 电磁辐射范围：射线无线电波所有范围；电磁辐射范围：射线无线电波所有范围； 相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干预、衍射等；相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干预、衍射等； 光光分分析析法法在在研研究究物物质质组组成成、结结构构表表征征、外外表表分分析析等等方方面面具具有有其其他他方法不可区代的地位；方法不可区代的地位；三个根本过程：三个根本过程：三个根本过程：三个根本过程：1 1能源提供能量；能源提供能量；2 2能量与被测物之间的相互作用；能量与被测物之间的相互作用；3 3产生信号。产生信号。 根本特点：根本
4、特点：1 1所有光分析法均包含三个根本过程；所有光分析法均包含三个根本过程；2 2选择性测量，不涉及混合物别离不同于色谱分析；选择性测量，不涉及混合物别离不同于色谱分析；3 3涉及大量光学元器件。涉及大量光学元器件。二、电磁辐射的根本性质二、电磁辐射的根本性质 basic properties of electromagnetic basic properties of electromagnetic radiationradiation 电磁辐射电磁波：以接近光速真空中为光速传播的能量；电磁辐射电磁波：以接近光速真空中为光速传播的能量； c = =/ c = =/ E = h = h c /
5、 E = h = h c /c c：光速；：光速；：波长；：波长；：频率；：频率；：波数：波数 ；E E ：能量；：能量； h h：普朗克常数：普朗克常数 电磁辐射具有波动性和微粒性；电磁辐射具有波动性和微粒性；辐射能的特性辐射能的特性：(1) (1) 吸收吸收 物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；迁到高能级；(2) (2) 发射发射 将吸收的能量以光的形式释放出；将吸收的能量以光的形式释放出；(3) (3) 散射散射 丁达尔散射和分子散射；丁达尔散射和分子散射；(4) (4) 折射折射 折射是光在两种介质中的传播速度不同所造成的
6、；折射是光在两种介质中的传播速度不同所造成的；(5) (5) 反射反射(6) (6) 干预干预 干预现象；干预现象；(7) (7) 衍射衍射 光绕过物体而弯曲地向其后面传播的现象；光绕过物体而弯曲地向其后面传播的现象；(8) (8) 偏振偏振 只在一个固定方向有振动的光称为平面偏振光。只在一个固定方向有振动的光称为平面偏振光。按照产生光谱的物质类型的不同1原子光谱与分子光谱和固体光谱 气态原子发生能级跃迁时，能发射或吸收一定频率的电磁辐射，经过光谱仪所得到的一条条分立的线状光谱，称为原子光谱。 处于气态或溶液中的分子，当发生能级跃迁时，所发射或吸收的是一定频率范围的电磁辐射组成的带状光谱，称为
7、分子光谱。 炽热的固体物质及复杂分子受激后，发射出波长范围相当广阔的连续光谱，称为固体光谱。三、光分析分类三、光分析分类 type oftype of optical analysisoptical analysis l2吸收光谱与发射光谱 l 当物质受到光辐射作用时，物质中的分子或原子以及强磁声中的原子核吸收了特定的光子后，由低能态一般为基态被激发跃迁到高能态激发态，此时如将所吸收的光辐射记录下来，得到的就是吸收光谱。l吸收了光能处于高能态的分子或原子，其寿命很短，当它们回到基态或较低能态时，有时重新以光辐射形式释放出来，由此获得的光谱就是发射光谱。 光谱法光谱法基于物质与辐射能作用时，分子
8、发生能级跃迁而产生的发基于物质与辐射能作用时，分子发生能级跃迁而产生的发射、吸收或散射的波长或强度进行分析的方法；射、吸收或散射的波长或强度进行分析的方法； 原子光谱、分子光谱、非光谱法原子光谱、分子光谱、非光谱法 原子光谱线性光谱：最常见的三种原子光谱线性光谱：最常见的三种 基于原子外层电子跃迁的原子吸收光谱基于原子外层电子跃迁的原子吸收光谱AAS； 原子发射光谱原子发射光谱AES、原子荧光光谱、原子荧光光谱AFS； 基于原子内层电子跃迁的基于原子内层电子跃迁的 X射线荧光光谱射线荧光光谱XFS； 基于原子核与射线作用的穆斯堡谱；基于原子核与射线作用的穆斯堡谱； 分子光谱带状光谱： 基于分子
9、中电子能级、振基于分子中电子能级、振-转能级跃迁；转能级跃迁； 紫外光谱法紫外光谱法UV； 红外光谱法红外光谱法IR； 分子荧光光谱法分子荧光光谱法MFS； 分子磷光光谱法分子磷光光谱法MPS； 核磁共振与顺磁共振波谱核磁共振与顺磁共振波谱N； 非光谱法：非光谱法： 不涉及能级跃迁，物质与辐射作用时，仅改变传播方向不涉及能级跃迁，物质与辐射作用时，仅改变传播方向等物理性质；偏振法、干预法、旋光法等；等物理性质；偏振法、干预法、旋光法等； 光分析法光谱分析法非光谱分析法原子光谱分析法分子光谱分析法原原子子吸吸收收光光谱谱原原子子发发射射光光谱谱原原子子荧荧光光光光谱谱X射射线线荧荧光光光光谱谱折
10、射法圆二色性法X射线衍射法干涉法旋光法紫紫外外光光谱谱法法红红外外光光谱谱法法分分子子荧荧光光光光谱谱法法分分子子磷磷光光光光谱谱法法核核磁磁共共振振波波谱谱法法光谱分析法吸收光谱法发射光谱法原子光谱法分子光谱法原子发射原子吸收原子荧光X射线荧光原子吸收紫外可见红外可见核磁共振紫外可见红外可见分子荧光分子磷光核磁共振化学发光原子发射原子荧光分子荧光分子磷光X射线荧光化学发光原子光谱为线状光谱，原子光谱为线状光谱，分子光谱为带状光谱；分子光谱为带状光谱；为什么分子光谱为带状光谱？为什么分子光谱为带状光谱？原子光谱图原子光谱图分子光谱图分子光谱图1.分子中的能量分子中的能量E=Ee+ Ev + E
11、r + En + Et + Ei分子中原子的核能：分子中原子的核能： En分子的平移能：分子的平移能：Et电子运动能：电子运动能： Ee原子间相对振动能：原子间相对振动能： Ev分子转动能：分子转动能： Er基团间的内旋能：基团间的内旋能： Ei在一般化学反响中，在一般化学反响中， En不变；不变； Et 、 Ei较小；较小； E=Ee+ Ev + Er 分子产生跃迁所吸收能量的辐射频率：分子产生跃迁所吸收能量的辐射频率： =Ee / h + Ev / h + Er / h 四、物质对光波的吸收原理四、物质对光波的吸收原理2.双原子分子能级图双原子分子能级图 分分子子中中价价电电子子位位于于自
12、自旋旋成成对对的的单单重重基基态态S0分分子子轨轨道道上上，当当电电子子被被激激发发到到高高能能级级上上时时，假假设设激激发发态态与与基基态态中中的的电电子子自自旋旋方方向向相相反反，称称为为单单重重激激发发 态态 ， 以以 S1 、 S2 、表表示示；反反之之，称称为为三三重重激激发发态态，以以T1 、 T2 、表示；表示； 单重态分子具有抗磁性；单重态分子具有抗磁性； 三重态分子具有顺磁性；三重态分子具有顺磁性； 跃跃迁迁致致单单重重激激发发态态的的几几率率大大，寿命长；寿命长；3.跃迁类型与分子光谱跃迁类型与分子光谱 分子光谱复杂，电子跃迁时带有振动和转动能级跃迁；分子光谱复杂，电子跃迁
13、时带有振动和转动能级跃迁； 分子的紫外分子的紫外- -可见吸收光谱是由纯电子跃迁引起的，故可见吸收光谱是由纯电子跃迁引起的，故又称电子光谱，谱带比较宽；又称电子光谱，谱带比较宽； 分子的红外吸收光谱是由于分子中基团的振动和转动能分子的红外吸收光谱是由于分子中基团的振动和转动能级跃迁引起的，故也称振转光谱；级跃迁引起的，故也称振转光谱； 分子的荧光光谱是在紫外或可见光照射下，电子跃迁至分子的荧光光谱是在紫外或可见光照射下，电子跃迁至单重激发态，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态的最单重激发态，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态的最低振动能级，再跃回基态或基态中的其他振动能级所发出的低振动能级
14、，再跃回基态或基态中的其他振动能级所发出的光；光； 分子的磷光是指处于第一最低单重激发态的分子以无辐分子的磷光是指处于第一最低单重激发态的分子以无辐射弛豫方式回到第一最低三重激发态，再跃迁回到基态所发射弛豫方式回到第一最低三重激发态，再跃迁回到基态所发出的光；出的光； 当一束紫外可见光(通常为200800nm)照射分子时，假设分子的某些价电子的能级差E电恰好与某一定频率(或波长)的光相适应时(即E电E2-E1=hv)，那么该频率(或波长)的光被该物质选择性吸收，价电子由基态跃迁到激发态，将物质对光吸收的情况以波长为横坐标，对不同波长光的吸收程度A为纵坐标，绘制的A一曲线即为紫外可见吸收光谱，也
15、叫紫外可见吸收曲线，见图。l能量与频率的关系式如下；lE=E1-E2=hvl E=分子吸收或发射的辐射能l E1=电子在起始能级的能量 l E2=电子在最终能级的能量l h=普朗克常数=66310-27尔格秒 五、朗伯五、朗伯比尔比尔(Lambert(LambertBeer)Beer)定律定律1 1朗伯定律朗伯定律l-lgT=-lgIt/I0=lgI0/ItLl将上述比例式写成等式，得到l lgI0/It=K1Ll式中lgI0/It称为吸光度(A)(absorbance)，又称为消光度(E)(degree of extinction)或光密度(D)(optical density)。所以l A
16、=K1L2比尔定律lgI0/It=K2CA=K2C式中C为有色物质溶液的浓度；K2为比例系数，其值取决于入射光的波长，溶液的性质和液层的厚度，以及溶液的温度等。 3朗伯比尔定律l如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，那么必须将朗伯定律和比尔定律合并起来，得 llgI0/It=KLClA=KLC第二节第二节 分光光度技术的分光光度技术的应用应用一、紫外可见吸收光谱与分子一、紫外可见吸收光谱与分子结构的关系结构的关系1、紫外可见吸收光谱与电子跃迁从化学键性质来看，与紫外可见吸收光谱有关的电子是：成键电子、成键电子和未成键的n电子，这三种类型的电子可用乙醛分子例如如下 l当有机化合物吸收
17、光辐射以后，分子中的电 子 跃 迁 方 式 主 要 有 四 种 类 型 ， 即*、n*n，n*及*。这四种电子跃迁所吸收的能量(E)的大小关系为ln*n* *反键轨道 *反键轨道 n非成键轨道 成键轨道 成键轨道有机化合物分子的电子能级和跃迁类型 电子能级及跃迁类型图 1*跃迁 这是成键电子被激发到反键*轨道所产生的跃迁，饱和碳氢化合物可产生这类电子跃迁。2n*跃迁 这是未共用n电子被激发到*轨道所产生的跃迁，但凡含有未共用电子对的杂原子(如O、S、N、X)的饱和化合物都可能发生n*跃迁。3*跃迁 这是电子被激发到*轨道上所产生的跃迁，任何具有双键或叁键的不饱和有机化合物等( C=O， C=C
18、 )可发生*跃迁。4n*跃迁 这是未共用n电子被激发到*轨道上所产生的跃迁，这类跃迁一般发生在含有杂原子的双键(如 C=O，N=O， CS， NN等)不饱和有机化合物中。2、发色团与助色团，长移与短移l1发色团与助色团.l发色团 能够吸收紫外可见光，产生*或n*跃迁的基团称为发色团。l助色团 有些基团本身不能够吸收紫外可见光，但它与发色团相连时，可使发色团产生的吸收峰向长波方向移动，吸收强度增强，这类基团称为助色团。 l2长移与短移l长移 吸收峰向长波方向移动的这种现象称为长移，又称为红移或深色移动。l短移 吸收峰向短波方向移动的这种现象称为短移，又称为蓝移、紫移或浅色移动。3、影响紫外可见吸
19、收光谱的因素l1共轭效应 当两个或两个以上的发色团被一个单键隔开形成共轭体系时，由于大键的形成使各能级间能量差减小，使跃迁所需能量减小，吸收峰的波长长移、吸收强度增加的这种效应称为共轭效应。 化合物化合物（共轭）双（共轭）双键数键数maxmax（nmnm）K K乙烯丁二烯已三烯二甲基辛四烯癸五烯1234516521725829633511042.11043.51045.21041.2105共轭多烯的吸收情况共轭多烯的吸收情况 l2助色效应 当助色团与发色团相连时，助色团的n电子与发色团的电子共轭，使吸收峰的波长长移，吸收强度增强的这种现象称为助色效应。 l3超共轭效应 烷基上的电子与共轭体系中
20、的电子共轭，使吸收峰向长波方向移动，吸收强度增强，这种键与键共轭引起的现象称为超共轭效应。l4溶剂效应 由溶剂的极性强弱引起吸收峰波长发生位移，吸收强度和形状发生改变的这种现象，称为溶剂效应。溶剂溶剂正已烷正已烷氯仿氯仿甲醇甲醇水水*n*230nm329nm238nm315nm237nm309nm243nm305nm长移短移异丙叉丙酮的溶剂效应异丙叉丙酮的溶剂效应 l5空间效应 由于空间障碍，阻碍两个发色团处在同一平面(处在同一平面能产生最大的共轭效应)，使共轭程度降低，吸收峰向短波方向移动，吸收强度降低的这种现象，称为空间效应。空间效应越大，吸收峰位移越多，K值越小。 4、吸收带l吸收峰在紫
21、外可见吸收光谱中的波带位置称作吸收带 l1、R吸收带 由发色团(例 C=O、N=O、N=N等)的n*跃迁而产生的吸收带。l2、K吸收带 由共轭体系的*跃迁产生的吸收带。l3、B吸收带 由芳香族化合物的*跃迁产生的，在230270nm之间有一系列吸收峰，称为精细结构吸收带。l4、E吸收带 由芳香族化台物的*跃迁产生的，可分为E1带和E2带。 二、用紫外光谱鉴定化合物二、用紫外光谱鉴定化合物 定性分析定性分析三、结构分析三、结构分析四、测定溶液中物质的含量四、测定溶液中物质的含量定量分析定量分析1单组分物质的定量分析单组分物质的定量分析l(1)比较法lCx=Cs(Ax/As)l式中Cx代表未知液的
22、浓度，Cs代表标准液的浓度，Ax和As分别代表未知液和标准液所测得的吸光度值。 l2标准曲线法l3摩尔吸光率法l C=A/l2多组分物质的定量分析五、应用实例l1、Folin酚法测定蛋白质含量l(1)根本原理l(2)测定步骤l(3)影响因素 l(4)注意的问题l2、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量l(1)、常规测定法l(2)、微量测定法 l(3)、影响因素 l 第三节第三节 分光光度法的误差分光光度法的误差一、主要技术指标一、主要技术指标1、波长范围: 表示仪器能测定的波长范围。 2、波长精度: 表示仪器单色器波长误差程度。3、波长的重现性: 表示仪器每次测定后波长重现性的误差，即第一次调整波长和第
23、二次调整波长的误差。4、光度的测量精度： 表示仪器每次测定显示读数的精确度 。5、光度测量的重现性： 表示每次A读数的重观性，即第一次读数和第二次读数的误差，这与仪器使用的检测器的质量有关系。6、杂散光： 表示单色光的纯度。7、分辨率： 表示仪器分辨吸收光谱微细结构的能力。二、校正方法二、校正方法三、仪器的测量误差三、仪器的测量误差第四节第四节 分光光度计结构简介分光光度计结构简介光源单色器狭缝样品池检测系统分光光度计各部分示意图分光光度计各部分示意图光源光源单色器单色器参比池参比池样品池样品池单光束分光光度计测量示意图单光束分光光度计测量示意图检测器检测器一、光源一、光源二、分光系统二、分光
24、系统(单色器单色器)三、狭缝三、狭缝四、比色杯四、比色杯五、检测系统五、检测系统 第五节第五节 常见国产分光光度计的常见国产分光光度计的使用使用一、一、721型分光光度计型分光光度计二、二、751型分光光度计型分光光度计三、使用分光光度计的注意事三、使用分光光度计的注意事 项项四 核酸的检测紫外光谱分析法紫外光谱分析法 ssDNA=33(OD260-OD310)稀释倍数稀释倍数dsDNA=50(OD260-OD310)稀释倍数稀释倍数ssRNA=40(OD260-OD310)稀释倍数稀释倍数以上浓度单位为以上浓度单位为g/mL。Nucleic Acid Analysis via UV Spec
25、trophotometryBy measuring the amount of light absorbed by your sample at specific wavelengths, it is possible to estimate the concentration of DNA and RNA. Nucleic acids have an absorption peak at 260nm.dsDNA A260 x (50 g/mL)ssDNA A260 x (33 g/mL)ssRNA A260 x (40 g/mL)DNA Absorption Spectral组成核酸的嘌呤、
26、嘧啶碱基均有紫外吸收特性。l最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的根底。l蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子那么集中在230nm处。lOD值为1时，相当于大约50g/ml双链DNA 、l 40g/ml单链DNA或RNA、l 20g/ml单链寡聚核苷酸。l通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。l紫外法仅用于测定浓度大于g/ml的核酸溶液。紫外法测紫外法测DNA的纯度及浓度的纯度及浓度操作方法操作方法: 取15ul DNA样品加ddH2O 至3mL，分别于260、280、230nm处比色并记录。定量分析： DNAA260核酸稀释倍数50/1000纯度分析： ，有RNA杂
27、质，用RNase消化； A260/A2801.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤;，可能有盐未除尽。注：此法不能区分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。Quantifying DNA: SpectrophotometrylMaximum absorption of DNA at 260 nmlConvert absorption to OPTICAL DENSITY (OD)lOD = absorption X dilution factorl1 OD = 50 mg dsDNA per mllGenerally need large sample sizeImages from Wikip
28、ediaNanoDrop ND1000 lSmall sample size: only 1 2 L!lNo sample dilution: measures up to 3700 ng/ullFast and easy to uselStores data on computerlConverts OD to molarity Quantifying DNA: SpectrophotometryUsing the ND10001.Turn on PC2.Open NanoDrop program3.Select “DNA from menuUsing the ND10001.Lift ar
29、m2.Place 1 L water on pedestal to initialize instrument3.BLANK instrument using water or elution buffer4.Place 1-2 L of DNA sample on pedestal5.Click “MEASURE on instrument screen6.Recover sample if precious, or clean pedestals using a lab wipe NanoDrop Data ScreenSample (1-2 L)How does it work?Receiving fiber (fiber optic cable)Xenon lampSpectrophotometerFiber optic cable in measurement armQuick QuizThe Nanodrop reads: A.1ul of sample at visible wavelengthsB.10ul of sample at visible wavelengthsC.1 ul of sample at UV wavelengthsD.10 ul of sample at UV wavelengths
