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1、蛋白质概述蛋白质概述一、蛋白质的化学组成与分类一、蛋白质的化学组成与分类二、蛋白质的形状、大小和分子量二、蛋白质的形状、大小和分子量三、三、蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性蛋白质的化学组成与分类蛋白质的化学组成与分类1.1.元元素素组组成成：蛋蛋白白质质是是一一类类含含氮氮有有机机化化合合物物，除除含含有有碳碳、氢氢、氧氧外外，还还有有氮氮和和少少量量的的硫硫。某某些些蛋蛋白白质质还还含含有有其其他他一一些些元元素素，主主要要是是磷磷、铁铁、碘碘、钼钼、锌锌和和铜铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳碳 5050-55%-55% 氢氢 6.5
2、-7.36.5-7.3 氧氧 19-2419-24 氮氮 16%16% 硫硫 0-30-3 其他其他 微微 量量蛋白质的含氮量蛋白质的含氮量大大多多数数蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量接接近近于于16%16%，这这是是蛋蛋白白质质元元素素组组成成的的一一个个特特点点，也也是是凯凯氏氏（KjedahlKjedahl）定定氮氮法法测测定定蛋蛋白白质质含含量量的的计计算算基基础础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：样品中蛋白质含量样品中蛋白质含量= =蛋白氮蛋白氮 6.256.256.256.25为为蛋蛋白白质质系系数数，即即1 1克克氮氮所所代代表表的的蛋蛋白质量（克数）白质量（
3、克数）蛋白质的分类蛋白质的分类一、按化学组成分一、按化学组成分1、单纯蛋白单纯蛋白：只含蛋白成分：只含蛋白成分2、缀合蛋白缀合蛋白：蛋白：蛋白+辅基辅基单纯蛋白单纯蛋白单纯蛋白只含由单纯蛋白只含由 - -氨基酸组成的肽链，不含其它成分。氨基酸组成的肽链，不含其它成分。1 1，清蛋白和球蛋白：，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。易溶于稀酸中。2 2，谷蛋白，谷蛋白( (glutelin) )和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白( (prolamin) )：植物：植物
4、蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70708080乙醇中。乙醇中。3 3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。4 4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。由单纯蛋白与其它非蛋白成分结合而成。由单纯蛋白与其它非蛋白成分结合而成。1 1、色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。、色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。
5、如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。2 2、糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如、糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。细胞膜中的糖蛋白等。3 3、脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。、脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如如血清血清 - -， - -脂蛋白等。脂蛋白等。4 4、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。细胞核中的核糖核蛋白等。缀合蛋白缀合蛋白按形状和溶解度可将蛋白质分为：按形状和溶解度可将蛋白质分为：1、纤维蛋白纤维蛋白2、球状蛋白球状蛋白3、膜蛋白膜蛋白按肽链构成分按肽链构成分1、单体蛋白单体蛋白 2、寡
6、聚蛋白或多聚蛋白寡聚蛋白或多聚蛋白蛋白质分子量的变化范围很蛋白质分子量的变化范围很大，从大约大，从大约60006000到到10000001000000道道尔顿（尔顿（DaDa）或更大。）或更大。某些蛋白质是由两个或更多某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基个蛋白质亚基( (多肽链多肽链) )通过非通过非共价结合而成的，称共价结合而成的，称寡聚蛋白寡聚蛋白质质。有些寡聚蛋白质的分子量。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。可高达数百万甚至数千万。（TMVTMV：4x104x107 7）1 D = 1.66033 1 D = 1.66033 1010-27-27 Kg Kg对于对于只含有多肽
7、链的只含有多肽链的简单蛋白质：简单蛋白质：氨基酸残基的数目氨基酸残基的数目= =蛋白质的分子量蛋白质的分子量 / 110/ 110 （氨基酸残基平均分子量（氨基酸残基平均分子量 110110）JohnDalton三、蛋白质功能的多样性三、蛋白质功能的多样性1. 1.催化催化2.2.调节调节3.3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能 催化代谢反应。这是蛋催化代谢反应。这是蛋白质的一个最重要的生白质的一个最重要的生物学功能物学功能 调节蛋白参与基因表调节蛋白参与基因表达的调控。它们激活或达的调控。它们激活或抑制
8、遗传信息转录为抑制遗传信息转录为RNA激素参与代谢调节激素参与代谢调节1. 1.催化催化2.2.调节调节3.3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子OR1. 1.催化催化2.2.调节调节3.3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能受体蛋白起接受和传递受体蛋白起接受和
9、传递信息的作用。信息的作用。1. 1.催化催化2.2.调节调节3.3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能 某些蛋白质具有转运功能，某些蛋白质具有转运功能，携带各种小分子、离子等携带各种小分子、离子等从一处到另一处。从一处到另一处。有些蛋白质有贮藏氨基酸的作用，用有些蛋白质有贮藏氨基酸的作用，用作有机体生长发育的氮源。作有机体生长发育的氮源。如蛋类中的卵清蛋白为鸟类胚胎发育如蛋类中的卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供氮素提供氮素小麦种子中的醇溶蛋白为种子发芽提小麦种子中的醇溶蛋白为种子发芽提供氮素。供氮素。1. 1.
10、催化催化2.2.调节调节3.3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能1. 1.催化催化2.2.调节调节3.3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能人和动物的运动，靠肌肉的收人和动物的运动，靠肌肉的收缩来实现，参与肌肉收缩的主缩来实现，参与肌肉收缩的主要成分是要成分是肌球和肌动蛋白肌球和肌动蛋白，没，没有肌球蛋白和肌动蛋白，就没有肌球蛋白和肌动蛋白，就没有人和动物的运动。有人和动物的运动。 构建和维持生物体的结构，这类蛋构建和
11、维持生物体的结构，这类蛋白称为结构蛋白。白称为结构蛋白。细胞的片层结构，如细胞膜、线粒细胞的片层结构，如细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜和内质网膜等都是体膜、叶绿体膜和内质网膜等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。由不溶性蛋白与脂类组成的。在高等动物里，胶原蛋白参与结缔在高等动物里，胶原蛋白参与结缔组织和骨骼的形成，作为身体的支组织和骨骼的形成，作为身体的支架。架。 动物的毛发和指甲都是由角蛋白构动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。成的。1. 1.催化催化2.2.调节调节3.3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能有些蛋
12、白质具有主动的防护功能，抵有些蛋白质具有主动的防护功能，抵抗外界不利因素对生物体的干扰。抗外界不利因素对生物体的干扰。如脊椎动物体内的免疫球蛋白（抗体）如脊椎动物体内的免疫球蛋白（抗体），能中和外来有害物质（抗原）。，能中和外来有害物质（抗原）。抗冻蛋白：南极水域中某些鱼类血液抗冻蛋白：南极水域中某些鱼类血液中含有，保护血液不被冻凝。中含有，保护血液不被冻凝。蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神经毒蛋白蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神经毒蛋白以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等少量可引起高等动物产生强烈毒性反少量可引起高等动物产生强烈毒性反应。应。1. 1.催化催化2.2.调节调节3.
13、3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能应乐果甜蛋白有着极高的甜度，应乐果甜蛋白有着极高的甜度，作甜味剂。作甜味剂。某些海洋生物如贝类，分泌一某些海洋生物如贝类，分泌一类胶质蛋白，能将贝壳牢固地类胶质蛋白，能将贝壳牢固地粘在岩石或其他硬表面上粘在岩石或其他硬表面上1. 1.催化催化2.2.调节调节3.3.受体受体4.4.转运转运5.5.贮存贮存6.6.运动运动7.7.结构成分结构成分 8.8.防御防御9.9.异常功能异常功能综上所述综上所述：蛋白质存在于所有的生物细蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最
14、基本的结构物质和胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。与了几乎所有的生命活动过程。蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构1. 定义定义 1969年，国际年，国际纯化学与应用化学委员会纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 规定：规定：蛋白蛋白质的一级结构指蛋白质多质的一级结构指蛋白质多肽连中肽连中AA的排列顺序，包的排列顺序，包括二硫键的位置。括二硫键的位置。其中最其中最重要的是多肽链的氨基重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。物功能的基础。胰岛素（胰岛素
15、（insulin insulin ）的一级结构：）的一级结构：胰岛素的分子量为胰岛素的分子量为57345734道尔顿，由道尔顿，由5151个氨基酸组个氨基酸组成。成。含含A A、B B两条链，（两条链，（A A链：链：2121肽肽 ，B B链：链：3030肽）。肽）。 A A链和链和B B链之间由两个链间二硫键（链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20-A7-B7,A20-B19)B19)连接，连接，A A链本身第链本身第6 6位和第位和第1111位的位的2 2个个CysCys残基之残基之间形成一个链内二硫键。间形成一个链内二硫键。胰岛素是动物胰脏胰岛素是动物胰脏细胞分泌的一种分子量较小的激
16、素蛋白，主细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，主要功能是降低体内血糖含量。要功能是降低体内血糖含量。 肽（肽（peptidepeptide）一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物肽键，所形成的化合物称为肽。称为肽。一、肽与肽键一、肽与肽键由由两两个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为二二肽肽，由由多多个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽则则称称为为多多肽肽。组组成成多多肽肽的的氨氨基基酸酸单单元元称称为氨基酸残基。为氨基酸残基。 肽键肽键（peptide bondpeptide bond）： 0
17、.127nm0.127nm键长键长=0.132nm=0.132nm 0.148nm0.148nm肽平面：构成肽键的四肽平面：构成肽键的四个原子（个原子（C C、O O、N N、H H）和与之相连的两个和与之相连的两个碳碳原子都处在同一个平面原子都处在同一个平面内，此刚性结构的平面内，此刚性结构的平面称肽平面或酰氨平面。称肽平面或酰氨平面。肽键的特点是氮原子上的孤对电子与肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。羰基具有明显的共轭作用。肽键中的肽键中的C-NC-N键具有部分双键性质，不能自由旋键具有部分双键性质，不能自由旋转。转。肽键肽键肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部部
18、分分双键性质，不能自由旋转。双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式在大多数情况下，以反式结构存在结构存在。在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为列顺序称为氨基酸顺序氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的 - -氨基，称为氨氨基，称为氨基端或基端或N-N-端；端；在另一端含有一个游离的 - -羧基，称为羧基，称为羧基端或羧基端或C-C-端。端。氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨端氨基酸残基为终点基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln二二、肽
19、肽链链中中A AA A的的排排列列顺顺序序和和命命名名 从肽链的从肽链的N-N-末端开始，残基用末端开始，残基用酰酰称呼。称呼。 例如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸例如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸, , 简写：简写：Ser-Gly-Tyr - Ala - LeuSer-Gly-Tyr - Ala - Leu， 书写时，通常把书写时，通常把NHNH2 2末端末端AAAA残基放在左边，残基放在左边，COOHCOOH末端末端AAAA残基放在右边。残基放在右边。 共价主链共价主链：肽链的骨干是由：肽链的骨干是由-N -C -C -序列重复排序列重复排列而成，称为共价主链。列而成，称为共价主链。肽
20、的命名肽的命名四肽的结构四肽的结构三、肽的重要理化性质三、肽的重要理化性质1.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。2.在在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端末端 -NH2和游离末端和游离末端 -COOH以及侧链上可以及侧链上可解离的基团解离的基团。3.每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。一致且复杂。 B2+B B+ +B BB B- -B B2-2-K K 1 1K K 2 2K K 3 3K K 4 4pI=pKpI=pK2 2+ pK+ pK3 3/2/
21、24. 肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、 Sanger反应、反应、DNS反应和反应和Edman反应；反应；还可发生双缩脲反应。还可发生双缩脲反应。双缩脲反应含有两个以上肽键的多肽，具含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成也能发生双缩脲反应，生成紫紫红色或蓝紫色络合物红色或蓝紫色络合物。这是多。这是多肽定量测定的重要反应。肽定量测定的重要反应。红紫色络合物红紫色络合物(硷性溶液硷性溶液)Cu2+双缩脲是两分子的尿素经加热失双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子去一分子NHNH3 3而得到的产物而得到
22、的产物肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应四、四、 天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽常称为活性肽（active peptideactive peptide）。）。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。胱甘肽
23、；蛇毒多肽等。与真核生物的与真核生物的RNARNA聚合酶聚合酶 和和牢固结合牢固结合 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-ValL-OrnL-OrnL-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽短杆菌肽S(S(环十肽环十肽) )由由细细菌菌分分泌泌的的多多肽肽，有有时时也也都都含含有有D-D-氨氨基基酸酸和和一一些些非非蛋蛋白白氨氨基基酸酸。如如鸟鸟氨氨酸酸（OrnOrnithine, ithine, 缩缩写写为为 OrnOrn）。）
24、。能抗革兰氏阳性菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、能抗革兰氏阳性菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、变性菌也有效。临床上用于治疗和预防化脓性病变性菌也有效。临床上用于治疗和预防化脓性病症。症。 CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCHCH2 2CHCH2 2CHNHCHNH2 2COOHCOOHCH2CH2SHSH 谷胱甘肽谷胱甘肽存在与动、植物及存在与动、植物及微生物中：微生物中： 1. 1.参与体内氧化还原反应参与体内氧化还原反应 2. 2.作为辅酶参与氧化还原反应作为辅酶参与氧化还原反应 保护巯基酶或含保护巯基酶或含CysCys的蛋白质中的蛋白质中 SH SH的还原性的还原性, ,防止氧化物积累
25、防止氧化物积累2GSH2GSHGS-SGGS-SG 2.2.蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从研究的基础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。上千种不同蛋白质的一级结构被测定。测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义：测定蛋白质中的测定蛋白质中的AAAA顺序，是走向阐明其生物功顺序，是走向阐明其生物功能基础中的很重要步骤。顺序可以给出更多的能基础中的很重要步
26、骤。顺序可以给出更多的信息。信息。为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的限制，为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的限制，顺序测定是必须的。顺序测定是必须的。AAAA顺序的改变可以导致异常的功能和疾病，所顺序的改变可以导致异常的功能和疾病，所以顺序测定是以顺序测定是分子病理学分子病理学的一个重要部分。的一个重要部分。蛋白质中的蛋白质中的AAAA顺序很能指明它的进化史。顺序很能指明它的进化史。 a a、样品必需纯（、样品必需纯（97%97%以上）；以上）；b b、知道蛋白质的分子量；、知道蛋白质的分子量；可以预测可以预测AAAA数数目，工作量大小。目，工作量大小。c c、知道蛋白质由几个亚基组成；、
27、知道蛋白质由几个亚基组成；（1 1）测定蛋白质一级结构的要求）测定蛋白质一级结构的要求 (2) 测定步骤测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链的数目和种类。测定蛋白质分子中多肽链的数目和种类。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。目。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定B.多肽链的拆分。多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定B.多肽链的拆
28、分。多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚寡聚蛋白质，蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用聚体；可用8mol/L8mol/L尿素尿素或或6mol/L6mol/L盐酸胍盐酸胍处理，即处理，即可分开多肽链可分开多肽链( (亚基亚基).).尿素和盐酸胍与蛋白质的尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式可能作用方式：a.a.与肽链竞争氢键与肽链竞争氢键b.b.增加非极性侧链在增加非极性侧链在 水中的溶解度水中的溶解度蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定（NH
29、NH）脲或胍脲或胍C.二硫键的断裂二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的 - -巯基乙醇巯基乙醇( (还原法还原法) )处理，使处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICHICH2 2COOHCOOH）保护生成的巯基，以防止保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。它重新被氧化。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定SH-CHSH-CH2 2-CH-CH2 2-OH-O
30、H可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用间的非共价力；应用过甲酸氧化法过甲酸氧化法拆分拆分多肽链间的二硫键。多肽链间的二硫键。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定s ss sHcoooHHcoooHSOSO3 3H HSOSO3 3H HS SS SS SS SS SS S胰岛素胰岛素HO-CHHO-CH2 2-CH-CH2 2-SH-SHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2
31、2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HICHICH2 2COOHCOOH还原还原保护保护 D.D.分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端。多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基端氨基酸酸(amino-terminal)(amino-terminal)和和C-C-端氨基酸。端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定N-N-端氨基酸分析：端氨基酸分
32、析：SangerSanger反应、反应、EdmanEdman反应、反应、与丹磺酰氯反应、氨肽酶法。与丹磺酰氯反应、氨肽酶法。C-C-端氨基酸分析：端氨基酸分析：又称又称SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯与肽链二硝基氟苯与肽链N-N-端的游离氨基作端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（用，生成二硝基苯衍生物（DNP-DNP-蛋白质）。蛋白质）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够用氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的乙醚抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。N N- -
33、末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定（1 1）二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）与）与N-N-端氨基酸的游离氨基作用，得到端氨基酸的游离氨基作用，得到DNS-DNS-蛋白质，水解得蛋白质，水解得DNSDNS氨基酸。氨基酸。此法的优点是此法的优点是DNS-DNS-氨基酸有很强的荧光性质，不需提取可氨基酸有很强的荧光性质，不需提取可直接检测，检测灵敏度高。直接检测，检测灵敏度高。N N- -末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定（2 2）丹磺酰氯法）丹磺酰氯法（3） PITC法（法（ Edman 法法）N N- -末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定氨肽酶是一种肽
34、链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。根根据据不同的反应时间测出酶水解所释放出的不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。N N- -末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定（4 4）氨肽酶法氨肽酶法此法是多肽链此法
35、是多肽链C-C-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条。多肽与肼在无水条件下加热，件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质成不溶于水的物质而与而与C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。肼解法肼解法还原法还原法肽链肽链 C C末端氨基酸可用硼氢化锂还末端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的氨基醇，再用层析法加以原成相应的氨基醇，再用层析法加以鉴定。鉴定。SangerSanger早期就是采用这个方法早期就是采用这个方法鉴定胰岛素鉴定胰岛素A A、B B链
36、的链的C C末端氨基酸末端氨基酸羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解端逐个的水解AAAA。根据不同的反应时间测。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有
37、以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键。端残基的肽键。羧肽酶羧肽酶(carboxypeptidase)(carboxypeptidase)法法E.E.多肽链断裂成多个肽段，多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽链断裂法：多肽链断裂法：酶解法和化学法酶解法和化学法 酶解法酶解法: :胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，
38、嗜热菌蛋白酶等白酶等Trypsin ：R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg时（专一性较强，水解时（专一性较强，水解速度快）。速度快）。R R2 2=Pro =Pro 水水解受抑。解受抑。水解位点水解位点胰胰蛋蛋白白酶酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R1R2R2或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（ChymotrypsinChymotrypsin）：）：R R1 1=Phe, Trp,Tyr=Phe, Trp,Tyr时水解快时水解快; R; R1 1= = LeuLeu，MetMet和和HisHis水水解稍慢。解稍慢。R R2 2=Pro =Pro
39、 水解受抑。水解受抑。肽链水解位点水解位点糜糜蛋蛋白白酶酶PepsinPepsin：R R1 1和和R R2 2Phe, Trp, Tyr; Phe, Trp, Tyr; LeuLeu以及其它疏水以及其它疏水性氨基酸水解速度性氨基酸水解速度较快较快。R R1 1=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。肽链水解位点水解位点胃胃蛋蛋白白酶酶thermolysinthermolysin：R R2 2=Phe, Trp, Tyr; =Phe, Trp, Tyr; LeuLeu，Ile, MetIle, Met以及其它疏水性强的以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。氨基酸水解速度较快。R R2 2=Pr
40、o=Pro或或Gly Gly 水解受抑。水解受抑。R R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。肽链水解位点水解位点嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶谷氨酸蛋白酶：谷氨酸蛋白酶： R R1 1=Glu=Glu、Asp(Asp(磷酸缓磷酸缓冲液冲液); R); R1 1=Glu (=Glu (磷酸缓冲液或醋酸磷酸缓冲液或醋酸缓冲液缓冲液) )精氨酸蛋白酶：精氨酸蛋白酶： R R1 1=Arg=Arg肽链水解位点水解位点谷谷氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶和和精精氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（R1=Arg,GlyAlaLeuGluAspR1=Arg,GlyAlaLeuGluAsp）和弹
41、性蛋白酶和弹性蛋白酶(R1=AlaValGlySer)(R1=AlaValGlySer) 化学法：化学法：可获得较大的肽段可获得较大的肽段溴化氰溴化氰(Cyanogen bromide)(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地水解法，它能选择性地切割由切割由甲硫氨酸的羧基甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。所形成的肽键。 羟胺（羟胺（NHNH2 2OHOH）：）：专一性断裂专一性断裂-Asn-Asn- -Gly-Gly-之间之间的肽键。也能部分裂解的肽键。也能部分裂解-Asn-Asn- -Leu-Leu-之间的肽之间的肽键以及键以及-Asn-Asn- -Ala-Ala-之间的肽键。之间
42、的肽键。F.F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定 测测定定每每条条多多肽肽链链的的氨氨基基酸酸组组成成EdmanEdman反应反应2 2、氨肽酶法或羧肽酶法、氨肽酶法或羧肽酶法3 3、质谱法（、质谱法（MSMS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快灵敏度高、所需样品少、测定速度快核糖体核糖体蛋白质链蛋白质链4.4.根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法G.G.确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼
43、此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。酸顺序。H.H.确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置。采用胃蛋白酶水解：采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳切点多，二硫键稳定定一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链( (切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换) )。将所得的肽段利用将所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的对角线的对角线电泳技术电泳技术进行分离。进行分离。+ +- -+ +- -第第二二向向第一向第一向BrownBrown和和Har
44、tlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中黄色斑点是图中黄色斑点是含有二硫键的肽段含有二硫键的肽段S SS SHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO3 3H H+ +- -+ +- -第第二二向向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是两个斑点是由一个二硫键断裂由一个二硫键断裂产生的肽段产生的肽段 同源蛋白质：同源蛋白质：来自来自不同不同生物体、生物体、 执行同一执行同一 /相似功能的蛋白相似功能的蛋白质质 同种蛋白质：同种蛋白质：来
45、自来自相同相同生物体、生物体、 执行同一功能的蛋白质执行同一功能的蛋白质1 1、同源蛋白质、同源蛋白质同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质的物种差异与生物进化 一百多个一百多个AA残基残基 MW约约12.5103 2 8个不变残基个不变残基 细胞色素细胞色素C的的AA序列差异可用于核对各物序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。进化树。细胞色素细胞色素C C与系统树与系统树invariant residues (yellow) conservative substitutions (blue)nonconservative or vari
46、able residues (unshaded)Conservation and variation of cytochrome c sequences1、氧合血红蛋白、氧合血红蛋白（二）同源蛋白质具有共同的进化起源（二）同源蛋白质具有共同的进化起源该酶类活性中心的该酶类活性中心的Ser残基残基起关键作用起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、 凝血酶和纤溶酶凝血酶和纤溶酶有有序列同源性序列同源性对对底物偏爱不同底物偏爱不同2、丝氨酸蛋白酶类、丝氨酸蛋白酶类卵清中的溶菌酶（卵清中的溶菌酶（lysozymelysozyme）- 乳清蛋白（乳清蛋白（lac
47、talbuminlactalbumin）三级结构很相似三级结构很相似 也可能具有共同的祖先。也可能具有共同的祖先。3、一些功能差异很大的蛋白质、一些功能差异很大的蛋白质（三）血液凝固与（三）血液凝固与AA序列的局部断裂序列的局部断裂 凝血酶原凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。可溶性的可溶性的血纤蛋白原血纤蛋白原酶酶有活性的凝血酶有活性的凝血酶不溶性的不溶性的血纤蛋白网血纤蛋白网（一）肽的人工合成（一）肽的人工合成 保护（保护（氨基、羧基、侧链活性基团氨基、羧基、侧链活性基团） 活化（活化（氨基、羧基氨基、羧基） 缩合剂缩合剂 （二）胰岛素的人工合成（二）胰岛素的人工合成（三）固相肽合成（三）固相肽合成肽与蛋白质的人工合成肽与蛋白质的人工合成
