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1、RNA测序技术原理及应用测序技术原理及应用遗传的中心法那的中心法那么么基因组基因组转录组转录组表观遗传组表观遗传组蛋白组层次蛋白组层次什么是转录组？什么是转录组？All All transcriptstranscripts All All mRNAsmRNAsRNA是解读基因组的关键是解读基因组的关键RNAProteinProteinPhenotypePhenotypeGenotypeGenotype DNA测序技术测序技术RNA-SeqRNA-SeqSmall RNA测序测序降解组测序降解组测序Non-coding RNA测序测序研究对象研究对象mRNASmall RNAmRNANon-co
2、ding RNA鉴定新分子鉴定新分子OOOO表达谱研究表达谱研究OOOO基因结构分析基因结构分析O/XXXOEST 测序测序O/XXXX 筛选分子标记筛选分子标记 OOOX转录融合基因转录融合基因表达表达O/XXXXRNA 测序技术测序技术Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq样品检测样品检测文库制备文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析生物信息分析Total RNA样品检测样品检测 Agilent 2200 检测lOD260/280:1.82.2 lRNA 28S:18S 1.0; RIN7 新型安捷伦2
3、200 TapeStation系统是新一代测序NGS、生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制QC的理想解决方案。可扩展的通量16联或96孔微量滴定板快速得到结果平均每个样品只需一分钟便可获得结果使用简单可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程样品用量少每次运行仅需要不到2ul样品检测报告检测报告- -合格样品合格样品棉铃虫/果蝇检测报告检测报告- -不合格样品不合格样品Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq样品检测样品检测文库制备文库制备Cluster StationIllumina Sequ
4、encing生物信息分析生物信息分析真核真核mRNA的纯化的纯化lmRNA的纯化主要通过的磁珠与生物素吸附原理从而别离纯化lOligodT25磁珠纯化原理主要是mRNA的3的poly A与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC磁别离器从溶液中别离出来。lmRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。链霉霉亲合素包被磁珠合素包被磁珠+ +生物素生物素标记OligoOligodTdT25+poly25+polyA A原核原核mRNA的纯化的纯化Ambion MICROExpress KitLNALNA扣扣锁型探型探针mRNA反转录反转录-fragm
5、ent+RTl纯化过的mRNA样品参加1 l的fragment buffer 70作用。l参加1l的stop buffer终止反响。l参加沉淀剂NaAc 糖原 无水乙醇沉淀产物。lRTlds cDNAl末端修复(防止自连lcDNA 3末端加AlAdapter连接第一天第一天消化消化DNADNAmRNAmRNA的分离的分离mRNAmRNA的打的打断断cDNAcDNA的合成的合成第二天第二天末端修末端修复复 加接加接头胶胶回收回收33端加端加A A第三天第三天PCRPCRPCRPCR胶胶回收回收 文库制备文库制备 文文库质量量检测：Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度qPCR：片段大小、
6、浓度手工检测：跑胶验证。Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq样品检测样品检测文库制备文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析生物信息分析ApplicationRNA-Seq (单端测序单端测序-Quantification)RNA-Seq (双端测序双端测序-Transcriptome)Expression-profilingAlternative SplicingFusion GeneSNP detectionHiSeq 2500Applications of RNA-Seq17RNA-Seq (Tran
7、scriptome)RNA-Seq (Transcriptome)Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq(Transcriptome)(Transcriptome)(Transcriptome)(Transcriptome)生物信息生物信息学学分析分析RNA-Seq (Transcriptome)Characterize the transcriptome in unparalleled detailTechnique 220RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)RNA-Seq (Transcriptome res
8、equencing)RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)文文库构构建建测序序组装装De novo assemble a transcriptome组装流程组装流程数据产出统计及测序数据的成分和质量评估组装结果分析Contig 长度分布、Scaffold 长度分布、Unigene 长度分布Unigene transcript功能注释Unigene 的GO 分类Unigene 代谢通路分析预测编码蛋白框CDSUnigene 表达差异分析两个或两个以上样品Unigene 在样品间的差异GO 分类需两个或两个以上样品和Pathway 富集性分析De novo
9、 assembly transcriptome 信息分析主要信息分析主要内内容容：De novo assembly transcriptome信息分析流程信息分析流程Unigenes的的GO 注释注释Pathway 分析分析RNA-Seq (Transcriptome resequencing)cDNAcDNA文文库构构建建测序序比比对到到参参考序列考序列Transcriptome resequencing比比对流程流程比对统计基因表达注释基因差异表达分析基因结构优化可变剪接分析预测新转录本cSNP分析Transcriptome resequencing信息分析主要信息分析主要内内容容Tran
10、scriptome resequencing信息分析流程信息分析流程应用应用-优化转录组注释信息优化转录组注释信息l基因结构优化基因结构优化l可变剪接鉴定可变剪接鉴定l基因融合鉴定基因融合鉴定lRNA水平水平SNP分析分析Genomic intergenic regionReadsclusterPaired Readsdistribution优化基因结构优化基因结构鉴定新的转录本鉴定新的转录本Paired-End (PE) ReadsReads Reads 比比对到到参参考序列基因考序列基因间区区域域鉴定可变剪接鉴定可变剪接 Alternative Splicing exon1exon1exo
11、n2exon2exon3exon3exon1exon1exon2exon2exon3exon3exon1exon1exon3exon3common readsjunction readsmRNA鉴定基因融合鉴定基因融合Paired ReadsSingle ReadsGene AGene AGene BGene B分析分析RNA水平水平SNP转录组重重测序比序比对软件：件：SOAPDe novo 转录组测序序: 组装装软件：件：SoapDenovo比比对软件：件： SoapSNP36转录组研究技术横向比较转录组研究技术横向比较TechnologyTiling ArraycDNA or EST s
12、equesing Transcriptome SequencingPrincipleHybridizationSanger sequencingNext-GensequencingResolutionFrom several to 100Single baseSingle baseThroughputHighLowHighReliance on genomic sequenceYesNoIn some casesBackground noiseHighLowLowApplicationSimutaneously map transcribed regions and gene expressi
13、onYesLimited for expressionYesDynamic range to quantify gene expression levelUp to a few-hundred foldNot practical 8,000-foldAbility to distinguish different isoforms and allelic expressionLimitedYesYes转录组测序的优势转录组测序的优势RNA测序与芯片检测基因数比较 RNA测序序与与芯片芯片检测基因的表基因的表达达量分布量分布Technique 1Genome Res 2021CaseCase 实
14、验材料收集：实验材料收集： 叶片，花序, 果实, 根 时间点：0 , 4, 8, 12, 16, 20和 24 h 将每个时间点采集的样品均匀混合 测序策略：测序策略： Illumina 测序，1G data1. High light 2.Heat 3. Cold 4. Salt 5.Drought抗逆相关可变剪接抗逆相关可变剪接外包膜蛋白外包膜蛋白16 (AT2G28900)Intron-retentionIntron-retentionControlLow Temperature Resistance低温胁迫相关的低温胁迫相关的ASAS低温胁迫下这个内含子和对照相比被保存了下来，揭示了可变
15、剪接有重要功能。ASAS调节机制调节机制CCA1CCA1生物钟相关基因，例如调节气孔的开关等RNA-SeqRNA-Seq单端测序单端测序QuantificationQuantification等同于数字表达谱等同于数字表达谱(DGE)(DGE)Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq单端测序单端测序单端测序单端测序QuantificationQuantification生物信息生物信息学学分析分析RNA-Seq单端测序单端测序Quantification生物信息分析内容生物信息分析内容v测序数据评估测序数据评估v筛选差异表达基因筛选差异表达基因v表达模式聚类
16、分析表达模式聚类分析vGO 功能富集分析功能富集分析vPathway 富集分析富集分析v蛋白互作网络分析蛋白互作网络分析RNA-Seq单端测序单端测序Quantification信息分析流程信息分析流程RNA-SeqRNA-Seq与基因芯片优缺点比较与基因芯片优缺点比较技术技术优点优点缺点缺点RNA-seq1）检测基因数比基因芯片多25%2）定量准，可重复性高（重复相关系数0.99）3）数字化信号，无背景噪音，无交叉杂交4）高、低丰度基因高、低丰度基因均均可检测可检测5）不受研究物种限制，不受研究物种限制，模式生物和非模式生物均可检测6）数据可与时俱进，数据可与时俱进，即随数据库更新而更新7）
17、具有较好的分析兼容性，数据格式与芯片相同，可与芯片的分析软件兼容1）样本要求量比基因芯片多2）数据量大，需要具备一定的生物信息分析基础，才能更好的挖掘数据蕴含的丰富信息基因芯片1）平台应用较早2）信息分析软件较多3）有些平台要求样品量少1）检测灵敏度较低、重复性差、检测阈值较狭窄2）有背景噪音，假阳性率1%3）受物种限制，只能检测部分模式生物受物种限制，只能检测部分模式生物4）受基因拷贝数限制，无法检测出低丰度基因无法检测出低丰度基因5）只能检测已知转录本，无法检测出新转录本，无法检测出新转录本6）受数据库数据所限，因探针依靠现有数据库探针依靠现有数据库或比较旧的版本的数据库来设计的，可能出现
18、注释注释不准确不准确的情况casecasePlant Physiology 2021Plant Physiology 2021Plant Physiology 2021取样：取样： 选取在成熟季节开花后选取在成熟季节开花后 5, 10, 5, 10, 和和1515个星期葡萄分别个星期葡萄分别代表葡萄果实成熟中的三个时期代表葡萄果实成熟中的三个时期post setting, vepost setting, veraisonraison和和ripeningripening数据量：数据量： 超过超过59M reads59M reads数据，数据， 长度在长度在36-44bp36-44bp之间之间运用
19、RNA-Seq技术对葡萄果实发育过程中复杂转录特征的研究。表二表二 reads在基因组上的分布情况在基因组上的分布情况表一表一 测序数据测序数据葡萄葡萄RNA-Seq单端测序单端测序浆果发育三个阶段共有、特有基因表达分布图浆果发育三个阶段共有、特有基因表达分布图基因表达量分布基因表达量分布表达簇的分类分布情况表达簇的分类分布情况差异表达的基因GO功能注释-分成了19个功能类群-按照基因在三个不同时期的表达趋势进行分类，分成8个cluster。将基因的表达和它调控的一个生理功能联系在了一起。RNA-Seq对浆果标记基因的验证对浆果标记基因的验证用RNA-Seq的数据去验证已报到的十个浆果成熟期的mark基因。事实上从其它方法得到的数据去验证了RNA-Seq数据的准确性。RNA-Seq结果与RT-PCR具有高度一致性RT-PCR验证结果验证结果Thats all, thank you!
