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1、医学微生物学实验医学微生物学实验微生物学教研室 第一次 实验内容l细菌基本形态观察（球菌、杆菌、螺形菌）l细菌特殊结构观察（荚膜、鞭毛、芽胞）l革兰染色法1.细菌的三种基本形态l球菌：葡萄球菌。l杆菌：大肠杆菌。l螺形菌：霍乱弧菌。 细菌的三种基本形态示意图葡萄球菌：葡萄球菌：Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells. 显微镜下的杆菌杆菌(bacillus) Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells弧菌弧菌霍乱弧菌Figure 3 - Gram stain of Gram Ch
2、olera cells2.细菌的特殊结构观察l芽胞示教片：破伤风杆菌。l鞭毛示教片：变形杆菌。l荚膜示教片：肺炎双球菌。 芽孢产芽孢细菌的种类 菌体 （营养细胞）芽胞破伤风梭菌破伤风梭菌1000鞭毛变形杆菌鞭毛1000细菌荚膜示意图细菌荚膜示意图荚膜的观察： 负染色负染色 l【菌种菌种】 齿垢齿垢l【试剂试剂】 生理盐水、结晶紫、碘液、生理盐水、结晶紫、碘液、95%95%乙醇、复红乙醇、复红l【材料材料】 酒精灯、接种环、玻片、酒精灯、接种环、玻片、3.革兰氏染色法革兰氏染色法由丹麦医生由丹麦医生Hans Christian GramHans Christian Gram于于18841884年
3、年创立创立。【操作步骤】结晶紫初染结晶紫初染碘液媒染碘液媒染乙醇脱色乙醇脱色复红复染复红复染涂片固定涂片固定1 min1 min30 s1 min滤纸吸干，油镜观察滤纸吸干，油镜观察 结晶紫结晶紫 1 1 碘液碘液 1 1 95% 95% 乙醇乙醇 30” 30” 复红复红 1 1 冲洗冲洗 滤纸干燥滤纸干燥 油镜观察油镜观察冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗染色染色初染初染媒染媒染脱色脱色复染复染紫色（紫色（G）革兰氏革兰氏染色步骤示意图染色步骤示意图革兰氏染色革兰氏染色甲菌甲菌乙菌乙菌初染初染结晶紫结晶紫媒染媒染碘液碘液脱色脱色乙醇乙醇复染复染复红复红紫色（紫色（G）红色（红色（G-）革兰氏革兰氏染
4、色步骤示意图染色步骤示意图【结果结果】l细菌被染成紫色者，称为革兰氏阳性菌；细菌被染成紫色者，称为革兰氏阳性菌；l而细菌染成红色者，称为革兰氏阴性菌；而细菌染成红色者，称为革兰氏阴性菌；阳性菌阳性菌紫色紫色 阴性菌阴性菌红色红色【意义意义】l鉴别细菌，用本法染色可将细菌分成两大类。鉴别细菌，用本法染色可将细菌分成两大类。l了解致病性了解致病性l指导选择用药指导选择用药【革兰氏染色法的原理革兰氏染色法的原理 】 革革兰兰氏氏染染色色法法的的原原理理尚尚未未阐阐明明，可能与以下因素有关。可能与以下因素有关。 1、通透性学说、通透性学说 2、等电点学说、等电点学说 3、化学学说、化学学说 通透性学说
5、通透性学说G+菌菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易进入。脂质含量少，乙醇不易进入。G-菌菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。大量脂质，乙醇易渗入。 等电点学说G+菌菌等电点（等电点（pI23）G-菌菌等电点（等电点（pI45） 在相同在相同pH条件下条件下G+菌所带负电荷比菌所带负电荷比G-菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。结合较牢固，不易脱色。化学学说化学学说G+菌菌菌体内含有大量菌体内含有大量核糖核酸镁盐核糖核酸镁盐，可，可与碘、结晶紫等染料牢固结
6、合，与碘、结晶紫等染料牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱色使已着色的细菌不易被乙醇脱色G-菌菌 菌体内含菌体内含核糖核酸镁盐核糖核酸镁盐很少，故易很少，故易被脱色被脱色注 意 事 项1.涂片的厚度。涂片的厚度。2.固定的程度。固定的程度。3.染色的时间控制：一一半一。染色的时间控制：一一半一。4.冲洗的方法，不要对着涂片区。冲洗的方法，不要对着涂片区。5.95% 乙醇脱色时间。乙醇脱色时间。第二次 实验内容一、细菌基础培养基的制备（示教）一、细菌基础培养基的制备（示教）二、细菌分离接种技术（操作）二、细菌分离接种技术（操作） 平板划线接种法；斜面培养基接种法平板划线接种法；斜面培养基接种法
7、液体培养基接种法；半固体穿刺接种法液体培养基接种法；半固体穿刺接种法三、细菌在培养基上生长现象（观察）三、细菌在培养基上生长现象（观察） 一、细菌基础培养基制作一、细菌基础培养基制作l液体培养基制作液体培养基制作 普通肉汤培养基成分： 新鲜牛肉浸液100ml，蛋白胨1g，NaCl 0.5g 称量，包装，灭菌后使用。l固体培养基制作固体培养基制作 称取营养琼脂4.5g，加入100ml蒸馏水中溶解。 包装后灭菌使用。l斜面培养基制作斜面培养基制作 1、称量及溶化称量及溶化2、调、调pH 3、加琼脂、溶化、定容、（过滤）、加琼脂、溶化、定容、（过滤）4、分装、加塞、包扎、分装、加塞、包扎5、灭菌、灭
8、菌（6、摆斜面）、摆斜面）操作步骤操作步骤 1. 半固体培养基接种法（操作）半固体培养基接种法（操作）2. 斜面培养基接种法斜面培养基接种法3. 液体培养基接种法液体培养基接种法 细菌的分离接种接技术细菌的分离接种接技术（一）分离培养（一）分离培养1. 平板分离划线接种法（操作）平板分离划线接种法（操作）（二）纯培养（二）纯培养平板分离划线接种法平板分离划线接种法连续划线法 分段划线法 IVIII1/5 I1/10 Rotate 90Flame loopRotate 90Rotate 90III1/4 Flame loop平板划线接种法（分离培养法）平板划线接种法（分离培养法）培养结果培养结果
9、132注意事项：注意事项：1.1.各区之间接种环要灭菌各区之间接种环要灭菌2.2.用力适当，不要划破用力适当，不要划破 琼脂表面琼脂表面3.3.注意无菌操作注意无菌操作斜面培养基接种法斜面培养基接种法（操作）（操作）l用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。液体培养基接种法液体培养基接种法半固体培养基接种法（操作）半固体培养基接种法（操作）方法：穿刺接种方法：穿刺接种结果：沿穿刺线生长结果：沿穿刺线生长动力动力- 扩散生长扩散生长动力动力+三、细菌在培养基上生长现象三、细菌在培养基上生长现象沉淀沉淀成链生长成链生长浑浊浑浊均匀分散生长均匀分散生长菌膜菌膜表面生长（需氧菌）表面生长（需氧菌）1
10、. 固体固体2. 半固体半固体3. 液体液体菌落菌落 菌苔菌苔动力动力+ 动力动力-固体培养基生长现象固体培养基生长现象液体培养基中生长现象液体培养基中生长现象沉沉淀淀生生长长混混浊浊生生长长表表面面生生长长半固体培养基中生长现象半固体培养基中生长现象有鞭毛动力+无鞭毛动力沿刺线生长混浊生长 培养基培养基生长现象生长现象用途用途 固体平板固体平板 固体斜面固体斜面液体液体半固体半固体细菌在培养基上生长现象细菌在培养基上生长现象第三次 实验内容一、细菌分布实验一、细菌分布实验 空气中细菌空气中细菌的检查的检查 皮肤、日常物品细菌皮肤、日常物品细菌的检查的检查二、药敏实验二、药敏实验一、细菌的分布
11、实验一、细菌的分布实验l（1）空气细菌检查）空气细菌检查 材料：培养基，普通琼脂平皿l（2）皮肤（其他物品）消毒前后的细菌检查）皮肤（其他物品）消毒前后的细菌检查 材料：培养基，无菌生理盐水，75%酒精棉球， 2.5%碘酒棉球，无菌棉棒l（3）自来水中的细菌检查）自来水中的细菌检查 材料：培养基，无菌棉棒，酒精灯1. 1. 空气中细菌空气中细菌的检查的检查取三块琼脂平板，将取三块琼脂平板，将2 2个打开皿盖个打开皿盖分别置于不同的环境分别置于不同的环境1530min1530min后，后，盖好皿盖。另外盖好皿盖。另外1 1个不启盖作为对个不启盖作为对照。置照。置3737培养培养1824h1824
12、h。材料：材料：普通琼脂平板普通琼脂平板方法：方法：结果：结果：计数菌落数，观察菌落数的差异。计数菌落数，观察菌落数的差异。2 2、皮肤消毒皮肤消毒前后的细菌检查方法前后的细菌检查方法l在在1个平皿底部做好标记，分为个平皿底部做好标记，分为消毒前消毒前与与消毒后消毒后两个区域。两个区域。l取一支无菌棉签放入无菌盐水中浸泡，取一支无菌棉签放入无菌盐水中浸泡，在管壁上挤干水在管壁上挤干水后擦拭皮肤或其他物品，然后将该棉签涂布于无菌平皿后擦拭皮肤或其他物品，然后将该棉签涂布于无菌平皿消毒前区域，消毒前区域，作来回划线，注意勿划破琼脂表面。作来回划线，注意勿划破琼脂表面。l将将皮肤区域或物品皮肤区域或
13、物品用碘酒棉球及酒精棉球涂擦消毒，另用碘酒棉球及酒精棉球涂擦消毒，另取一支无菌棉棒用消毒前所述方法取材，接种于标有消取一支无菌棉棒用消毒前所述方法取材，接种于标有消毒后的平皿区域。毒后的平皿区域。l平皿平皿37、24h培养后取出观察表面有无细菌生长，比培养后取出观察表面有无细菌生长，比较消毒前后菌落数目，描述菌落特征。较消毒前后菌落数目，描述菌落特征。结果：结果：计数菌落数计数菌落数371824h消毒前消毒后自来水中的细菌检查l在在1个平皿底部做好标记。个平皿底部做好标记。l用酒精灯对水管口灭菌，拧开水管开关放水用酒精灯对水管口灭菌，拧开水管开关放水15S。l取一支无菌棉签蘸取自来水，将该棉签
14、涂布于标有消毒取一支无菌棉签蘸取自来水，将该棉签涂布于标有消毒前的无菌琼脂平皿表面，前的无菌琼脂平皿表面，作来回划线，注意勿划破琼脂作来回划线，注意勿划破琼脂表面。表面。l将平皿于将平皿于37、24h培养后取出观察平皿表面有无细菌培养后取出观察平皿表面有无细菌生长，描述菌落特征。生长，描述菌落特征。 二、药敏试验（二、药敏试验（纸片扩散法）纸片扩散法）材料：材料：方法：方法：普通琼脂平板普通琼脂平板(2块平板块平板/组）组）大肠杆菌、金葡菌大肠杆菌、金葡菌氯霉素、青霉素、碘酒、结晶紫氯霉素、青霉素、碘酒、结晶紫 大肠杆菌大肠杆菌葡菌球菌葡菌球菌氯氯青青庆庆链链氯氯青青庆庆链链371824hG+
15、G-l步骤步骤（无菌操作）（无菌操作）1、在培养基平皿上做标记。、在培养基平皿上做标记。2、接种；用棉签分别沾取菌液（、接种；用棉签分别沾取菌液（G+，G-）均匀分）均匀分别涂布于别涂布于2个平皿上。个平皿上。3、贴药片；镊子灭菌取药片放置于平皿上的标记、贴药片；镊子灭菌取药片放置于平皿上的标记 位置，再灭菌后可取另一药片放置。位置，再灭菌后可取另一药片放置。4、37，过夜培养，观察结果。，过夜培养，观察结果。药敏实验（纸片扩散法）药敏实验（纸片扩散法）药敏实验结果药敏实验结果药敏实验结果药敏实验结果药敏实验药敏实验纸片法抑纸片法抑菌环直径菌环直径青霉素青霉素(10ug/片片)链霉素链霉素(1
16、0ug/片片)氯霉素氯霉素(30ug/片片)庆大霉素庆大霉素(10ug/片片)敏感标准敏感标准抗药抗药2011 10 12中度敏感中度敏感21-2812-1410-1713-14高度敏感高度敏感29 15 17 15白色葡萄球菌白色葡萄球菌（ G+ ）大肠杆菌（大肠杆菌（ G- ）第四次 实验内容l病原性球菌标本片观察 链球菌、 脑膜炎双球菌 l血浆凝固酶试验l抗“O”试验 目的要求l掌握病原性球菌的基本形态。l掌握药敏实验操作技术与判断。链球菌链球菌脑膜炎双球菌脑膜炎双球菌 原理和意义原理和意义 致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因
17、此，测定血浆凝固酶的有动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验步骤：步骤： 血浆血浆 血浆血浆12 金葡金葡 白葡白葡+ + + + 凝集（凝集（+）不凝集（不凝集（-）血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 生理盐水生理盐水+ + + + 无菌操作：无菌操作：血浆凝集试验结果血浆凝集试验结果l链球菌侵入体内产生链球菌侵入体内产生SLOSLO，刺激机体产生相应抗体刺激机体产生相应抗体ASOASO，当两者中和后，再加入当两者中和后，再加入SLO SLO 乳胶试剂，因病人血清中乳胶试剂，因病人血清中ASOASO
18、量很多，未被中和掉的抗体与乳胶试剂反应，产生清晰量很多，未被中和掉的抗体与乳胶试剂反应，产生清晰凝集，为阳性；无凝集，为阴性。凝集，为阳性；无凝集，为阴性。方法方法：间接凝集：间接凝集结果结果：效价大于：效价大于400400单位单位意义意义：风湿热及其活动性的辅助诊断风湿热及其活动性的辅助诊断抗抗“O”试验（试验（ASO test）原理原理：步骤：步骤：抗抗“O”试验（试验（ASO test） 阴性对照（阴性对照（1滴）滴） 待检血清待检血清 （1滴）滴） + + 胶乳试剂（胶乳试剂（1滴）滴） 胶乳试剂（胶乳试剂（1滴）滴）- ？2min2min第五次 实验内容l操作：肥达试验l肉毒梭菌、产
19、气荚膜菌标本肥达实验肥达实验 肥达试验（肥达试验（Widal test）是用已知的伤寒）是用已知的伤寒杆菌杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原抗原与与病人血清做定量凝集试验，以测定患者血清中有病人血清做定量凝集试验，以测定患者血清中有无相应抗体，根据抗体含量的多少以及增长情况，无相应抗体，根据抗体含量的多少以及增长情况，可帮助诊断伤寒及副伤寒。可帮助诊断伤寒及副伤寒。 【原理原理】 肥达反应稀释法示意表肥达反应稀释法示意表试验管（每管试验管（每管0.5ml） 对照管对照管 1234567生理生理盐盐水水0.50.50.50.5 0.50.5 0.5-1“O”抗原抗原
20、 0.50.50.50.5 0.50.50.52“H”抗抗原原0.50.50.50.50.50.50.53PA抗原抗原0.50.50.50.50.50.50.54PB抗原抗原0.50.50.50.50.50.50.5血清最血清最终终稀稀释释度度 1:401:801:1601:3201:640 1:1280-肥达实验结果判断肥达实验结果判断 血清的凝集效价（滴度）：血清的凝集效价（滴度）：是指能与一定量的抗是指能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即原发生肉眼可见的明显凝集（即“+”凝集）的血凝集）的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的含量，清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的含量，
21、血清效价越高，所含抗体的量愈多。血清效价越高，所含抗体的量愈多。 结果判断结果判断1、正常凝集效价、正常凝集效价 伤寒沙门菌伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在抗体凝集效价在1：80以下，以下，伤寒沙门菌伤寒沙门菌“H”抗体在抗体在1：160以下，以下， 甲、乙型副伤寒沙门菌甲、乙型副伤寒沙门菌“H”抗体凝集效价在抗体凝集效价在1：80以下。以下。2、病程中动态观察、病程中动态观察 二份血清，第二次效价增长四倍以上有意义二份血清，第二次效价增长四倍以上有意义3、O与与H抗体在诊断上的意义抗体在诊断上的意义 O H A B 诊诊 断断 意意 义（义（可能可能）伤寒及副伤寒伤寒及副伤寒感染早期感染早期/
22、交叉反应交叉反应伤寒及副伤寒伤寒及副伤寒感染晚期感染晚期/预防接种预防接种/非特异性回忆反应非特异性回忆反应伤寒伤寒甲型副伤寒甲型副伤寒乙型副伤寒乙型副伤寒接种接种伤寒及副伤寒伤寒及副伤寒三联疫苗三联疫苗非非肠热症肠热症/早期用抗生素早期用抗生素/免疫功能低下免疫功能低下3、O与与H抗体在诊断上的意义抗体在诊断上的意义肉毒梭菌肉毒梭菌产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌第六次 实验内容一、细菌染色标本检查法一、细菌染色标本检查法 抗酸染色法（操作）抗酸染色法（操作）二、标本片观察：二、标本片观察：（钩钩端端螺螺旋旋体体 、白白色色念念珠珠菌菌，曲曲霉霉、枯枯草草杆菌）杆菌） l分枝杆菌的细胞壁内含有大量的
23、脂质，主要是分枝菌酸脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色抗酸染色。l齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色兰色。一、抗酸染色原理一、抗酸染色原理 抗酸染色抗酸染色l材料： 标本：卡介苗 染液：石炭酸复红，3%盐酸酒精，美蓝 器具：同革兰氏染色 实验方法：实验方法：1、细菌涂片标本的制备
24、、细菌涂片标本的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定3、油镜观察油镜观察1）初染：）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗待标本冷却后用水冲洗。2）脱色：）脱色： 3%盐酸酒精脱色301；用水冲洗。3）复染复染：用碱性美兰溶液复染1，用水冲洗后用吸水纸吸干。2、染色染色 抗酸染色步骤抗酸染色步骤 1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。、涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片涂片 干燥干燥 固定固定抗酸染色步骤抗酸染色步骤l2、染色包括初染、脱色、复染三步。、染色包括
25、初染、脱色、复染三步。 石炭酸复红维持石炭酸复红维持 3-5 5 3%盐酸酒精盐酸酒精30 1 美蓝复染美蓝复染1 冲洗冲洗 干燥干燥 油镜观察油镜观察冲洗冲洗冲洗冲洗初染初染脱色脱色复染复染三、抗酸染色结果三、抗酸染色结果抗酸菌呈红色抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。注意事项：1、无菌操作、无菌操作2、菌种管摇匀后取菌、菌种管摇匀后取菌3、涂片均匀、涂片均匀4、初染加热维持、初染加热维持35分钟，勿沸腾烧干分钟，勿沸腾烧干5、冷却后冲洗、冷却后冲洗6、油镜下从视野中找红色抗酸菌、油镜下从视野中找红色抗酸菌二、标本片观察二、标本片观察l白色念珠菌l钩
26、端螺旋体l枯草杆菌l曲霉白色念珠菌钩端螺旋体类炭疽（枯草杆菌）类炭疽（枯草杆菌） 炭疽杆菌炭疽杆菌曲霉第七次第七次 实验内容实验内容l脓汁标本中金黄色葡萄球菌的鉴定脓汁标本中金黄色葡萄球菌的鉴定 实验器材实验器材l标本：脓拭子、感染分泌物或模拟脓汁标本l菌种：金黄色葡萄球菌培养物、表皮葡萄球菌l培养基：血琼脂平板、甘露醇发酵管l其他：血浆、生理盐水、革兰染液、玻片、滴管 培养箱、 酒精灯、接种环等检查原则检查原则l 在脓汁标本中，以化脓性球菌最为常见，本实 验主要检测金黄色葡萄球菌 l用药前采集标本 l无菌操作标本检测程序标本检测程序 脓汁、脓性分泌物（未知菌液/固体培养物）涂 片革兰染色镜
27、检血琼脂平板接种直接菌落观察血浆凝固酶试验甘露醇发酵诊断报告检查方法和结果报告检查方法和结果报告 l直接显微镜检查：取标本直接涂片，均匀涂成菌膜，自然干燥，固定后革兰染色，油镜观察。l注：若染色后未发现细菌，可报告“直接镜检未发现细菌” 革兰染色镜检革兰染色镜检 形态形态 排列排列 染色性染色性 金黄色金黄色 葡萄球菌葡萄球菌检查方法和结果报告检查方法和结果报告 l细菌分离培养：取脓液或创伤分泌物接种于血琼脂平板上（接种后4保存），划线分离，37培养1824h后，观察菌落特征，取单个菌落进行革兰染色镜检。l注：第2天观察记录结果；如培养4872h后仍然无菌生长，则报告“无细菌生长”。 血平板培
28、养结果观察血平板培养结果观察 菌落特点菌落特点 溶血性溶血性 菌落颜色菌落颜色金黄色金黄色葡萄球菌葡萄球菌检查方法和结果报告检查方法和结果报告l血浆凝固酶试验（玻片法）： l用灭菌接种环取标本和白葡菌（阴性对照）培养物少许，分别与玻片左右二侧的生理盐水制成均匀菌悬l于玻片玻片左右二侧菌悬液中各加血浆一滴并轻轻摇匀l13分钟内观察结果，出现颗粒状凝集为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性结果报告： 标本标本+ +血浆血浆 白葡菌白葡菌+ +血浆血浆阳性（阳性（+ +）/ /阴性（阴性（）检查方法和结果报告检查方法和结果报告l甘露醇发酵试验：无菌操作取标本和白葡菌（阴性对照）培养物分别接种于甘露醇发酵管，其上覆盖无菌液体石蜡油，37培养1824小时，观察结果。金葡菌发酵甘露醇产酸，使培养基变混充，颜色由紫色变黄色，是为甘露醇发酵试验阳性，而白葡菌相反。l注：第2天观察记录结果 标本标本+ +甘露醇甘露醇 白葡菌白葡菌+ +甘露醇甘露醇 阳性（阳性（+ +）/ /阴性（阴性（）
