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1、第三章第三章高效液相色谱分析高效液相色谱分析High Performance Liquid Chromatography, HPLC3-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法：高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典液相色谱的基础上，引入气相色它在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、高灵敏度检测器。高灵敏度检测器。1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压：高压： HPLC采用高压输液设备
2、采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速：高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分流速大增，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。时。 高效：高效：化学键和固定相化学键和固定相, 30000塔板塔板/米米 高灵敏：高灵敏：10-9g （紫外检测）、（紫外检测）、10-11g （荧光检测）（荧光检测）2、HPLC与与GC的区别的区别分析对象及范围分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的这些物质只点有机物总数的20%；
3、HPLC可以分析高沸点、高分子可以分析高沸点、高分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种采用的流动相中为有限的几种“惰性惰性”气体，气体，只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流采用的流动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生
4、竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。改进分离。操作温度操作温度：GC需高温；需高温；HPLC通常在室温下进行。通常在室温下进行。3-2 3-2 高效液相色谱法理论基础高效液相色谱法理论基础1.速率理论速率理论 P69 = 2l l dp +Cd Dmu+Cm dP2 CSmdP2 Cs df2Dm Dm Ds+uH = A + + CuBu 由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：
5、速率方程：速率方程： H=A+B/u+Cu（1）液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，HPLC中中速率方程中的速率方程中的分子扩散项分子扩散项分子扩散项分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，较小，可以忽略不计，（2）影响柱效的主要因素是）影响柱效的主要因素是传质项。传质项。传质项。传质项。2、提高柱效的途径：、提高柱效的途径：提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择薄壳形担体）薄壳形担体）选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流动相粘度动相粘度; 减小粒度是最有效的途径减小粒度是最有效的途
6、径.3-3 3-3 高效液相色谱法高效液相色谱法主要类型及分离原理主要类型及分离原理1 1、液液分配色谱法、液液分配色谱法、液液分配色谱法、液液分配色谱法2 2、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法3 3、离子交换色谱法、离子交换色谱法、离子交换色谱法、离子交换色谱法4 4、离子对色谱、离子对色谱、离子对色谱、离子对色谱5 5、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法 1 1、液液-液分配色谱液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
7、 分离机制分离机制分离机制分离机制：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配； 流流流流动动动动相相相相：对对对对于于于于亲亲亲亲水水水水性性性性固固固固定定定定液液液液，采采采采用用用用疏疏疏疏水水水水性性性性流流流流动动动动相相相相，即即即即流流流流动动动动相相相相的的的的极极极极性性性性小小小小于于于于固固固固定定定定液液液液的的的的极极极极性性性性（正正正正相相相相色色色色谱谱谱谱），反反反反之之之之，流流流流动动动动相相相相的极性大于固定液的极性（的极性大于固定液的极性（的极性大于固定液的极性（的极性
8、大于固定液的极性（反相反相反相反相色谱色谱色谱色谱）。）。）。）。 固定相固定相固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用; ; 目前应用最广的固定相目前应用最广的固定相目前应用最广的固定相目前应用最广的固定相: :化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相 正相色谱与反相色谱比较正相色谱与反相色谱比较正相色谱与反相色谱比较正相色谱与反相色谱比较正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱
9、，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 甲酰胺甲酰胺甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈乙腈乙腈 甲醇甲醇甲醇甲醇 乙醇乙醇乙醇乙醇 丙丙丙丙醇醇醇醇 丙酮丙酮丙酮丙酮 二氧六环二氧六环二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚乙醚乙醚 异丙醚异丙醚异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷溴乙烷溴乙烷 苯苯苯苯 四氯化碳四氯化碳四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷环己烷环己烷 己己己己烷烷
10、烷烷 煤油煤油煤油煤油( (最小最小最小最小) ) 采采采采用用用用二二二二元元元元或或或或多多多多元元元元组组组组合合合合溶溶溶溶剂剂剂剂作作作作为为为为流流流流动动动动相相相相可可可可以以以以灵灵灵灵活活活活调调调调节节节节流流流流动动动动相相相相的的的的极极极极性性性性或或或或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3-6 3-6 高效高效液相色谱仪器液相色谱仪器液相色谱仪（液相色谱仪（1）液相色谱仪（液相色谱仪（2）流程及主要部件流程及主要部件 process and mai
11、n assembly of HPLC1.1.流程流程高压输高压输液系统液系统进样系统进样系统色谱柱色谱柱检测系统检测系统数据记数据记录及处录及处理系统理系统2.主要部件主要部件(1)高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器）高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器）高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器）高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器）(2)高压泵高压泵高压泵高压泵 为为为为了了了了获获获获得得得得高高高高柱柱柱柱效效效效，HPLCHPLC使使使使用用用用粒粒粒粒度度度度很很很很小小小小的的的的固固固固定定定定相相相相（1020002000排阻色谱排阻色谱排阻色谱排阻色谱2 2、根据溶解度选择、根
12、据溶解度选择、根据溶解度选择、根据溶解度选择样品溶于水不离解样品溶于水不离解反相色谱反相色谱样品溶于水并能离解样品溶于水并能离解离子交换色谱离子交换色谱样品溶于烃类（苯或异辛烷）样品溶于烃类（苯或异辛烷）液固吸附色谱液固吸附色谱样品溶于甲醇样品溶于甲醇反相色谱反相色谱3 3、根据分子结构选择、根据分子结构选择、根据分子结构选择、根据分子结构选择异构体异构体液固吸附色谱液固吸附色谱同系物同系物正相色谱、反相色谱正相色谱、反相色谱3-8 3-8 HPLC的的应用应用 application of HPLC 1. 1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相固定相：薄壳型硅胶薄
13、壳型硅胶(37 (37 5050 m)m) 流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 1.5 mL/minmL/min 色谱柱：色谱柱：5050cmcm 2.5mm(2.5mm(内径内径) ) 检测器：示差折光检测器检测器：示差折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。2. 2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。 固定相固定相：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%20%甲醇甲醇- -水水 100%100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/2%/minmin 流
14、流 速：速：1 1mL/minmL/min 柱柱 温：温：5050 C C 柱柱 压：压：70 70 10104 4 PaPa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器3-9 3-9 液相制备色谱液相制备色谱 制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效方法。方法。方法。方法。 分析分析HPLC制备制备HPLC目的目的目的目的样品组成信息样品组成信息纯品回收纯品回收通常研究大部分或全部样通常研究大部分或全部样品组分品组分通常只对一种或几种样品通常只对一
15、种或几种样品组分感兴趣组分感兴趣1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）分析柱：分析柱：不影响柱效时的最大进样量；制备柱：制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。制备柱允许超载制备柱允许超载（以柱效下降一半或容量因子（以柱效下降一半或容量因子k降低降低10%为宜）为宜）2. 2. 液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况： （1 1）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰
16、使用制备柱，超载提高效率使用制备柱，超载提高效率使用制备柱，超载提高效率使用制备柱，超载提高效率( (图图图图3-283-28）；）；）；）； （2 2）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分超载，分离切分使待分离组分超载，分离切分使待分离组分超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离成为主成分（富集）后，再次分离成为主成分（富集）后，再次分离成为主成分（富集）后，再次分离制备。制备。制备。制备。 3.3.液相制备色谱仪液相制备色谱仪 液相制备色谱仪液相制备色谱仪液相制备色谱仪液相制备色谱仪 ：结构与分析型一样，但泵流量大、进：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；检测器后增加馏分收集器。样量大、采用制备柱；检测器后增加馏分收集器。 制备柱制备柱制备柱制备柱：内径：内径20205050mmmm，柱长柱长5050cmcm。
