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1、第二章第二章基因工程的载体基因工程的载体 载体载体在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受进入受体细胞的体细胞的DNA分子叫分子叫载体（载体（vector）。）。基因工程对载体基因工程对载体 的要求的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。 复制子：载体上有特殊的复制起点，使其能够携带外源基因在宿主细胞中独立复制繁殖（2）有利于检测筛选的标记。（3）有一段多克隆位点。 便于外源DNA插入载体而不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。载体的种类载体的种类按照来源分为：按照来源分为：按照功能分为：按照功能分为：质粒（质粒（plasmi
2、d） 单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（动物病毒（virus） 克隆载体克隆载体: : 克隆一个基克隆一个基因或因或DNADNA片断片断表达载体表达载体: : 用于一个基用于一个基因编码的蛋白表达因编码的蛋白表达整合载体整合载体: : 把一个基因把一个基因插入到染色体组中插入到染色体组中 载体的分类载体的分类分类依据分类依据 类类 别别举举 例例1.按功能分成按功能分成（1）克隆载体）克隆载体（2）表达载体）表达载体pBR322pCDN32.按进入受体细胞类型分按进入受体细胞类型分（1）原核载体）原核载体（2）真核载体
3、）真核载体（3）穿梭载体）穿梭载体pUC18pBUDCE41YEC3.按载体来源分按载体来源分质粒（质粒（plasmid） 单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（动物病毒（virus） 4.按克隆片段得大小（克隆能按克隆片段得大小（克隆能力）分力）分(1)1kb (2)10kb (3)22kb(4)40 oC）时，拷贝数会很快增）时，拷贝数会很快增加到加到1000个以上。个以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等构建。等构建。（4） 插入失活型质粒
4、载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。标记基因内部。如如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性抗菌素抗性外源外源DNA无抗菌素抗性无抗菌素抗性（5 5）正选择的质粒载体正选择的质粒载体如如pUR2、pTR262等。等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。能在选择培养基上生长。直接选择转化后的细胞。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。选择载体。Direct selection vectors（6） 表达型质粒载体
5、表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下。翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。密码、终止密码的阅读正确。复制起始点复制起始点ORI、 选择标记、选择标记、 多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）
6、转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通载体元件）普通载体元件 表达载体的表达载体的结构结构重要的质粒载体重要的质粒载体pBR322pBR322pUC18/19pUC18/19pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因1. pBR322：（1）元件来源）元件来源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工构建载体。人工构建载体。 复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）的的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。（2）长度）长度4363bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨
7、苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）； 3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。个克隆位点。（5）pBR322的优点的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp
8、中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通过接合转移。不能通过接合转移。 高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。 10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的）的作用位点作用位点。（6）pBR322的缺点的缺点能够被能够被ColK质粒编码的质粒编码的mob蛋
9、白识别，蛋白识别，如果再有如果再有F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就有可能转移！ 删除删除mobmob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：从从pBR322上切去上切去HaeII片断，既除去片断，既除去了了mob识别位点，又增加质粒的拷贝识别位点，又增加质粒的拷贝数。数。（7）PBR322的改进的改进pBR325：在在pBR322位点上接入一段来自噬菌位点上接入一段来自噬菌体体PICm的的HaeII酶切片断（带有氯霉酶切片断（带有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。 cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点位点。使使EcoRI 也成为
10、插入失活型位点。也成为插入失活型位点。 改造改造EcoR I 位点位点2. pUC系列系列University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改的基础上改造而成。造而成。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 复制起点复制起点pBR322的的 ori但其上失去了克隆位点。但其上失去了克隆位点。 Ampr 基因基因（1）元件来源）元件来源 lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 lacZ基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的 -肽链序列，肽链序列， 是是LacZ 的氨基端片
11、断。的氨基端片断。pBR322的的Ampr基因基因（2）长度）长度约约2.7kb（3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位个连续的单一限制酶切位点，位于点，位于lacZ基因的基因的5端。端。pUC18/19Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互补肽互补（蓝白（蓝白斑）相结合。斑）相结合。（4）选择标记）选择标记蓝白斑选择原理：蓝白斑选择原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个分解成半乳糖和一个深蓝色深蓝色的物的物质质5-溴溴-
12、4-氯靛蓝。氯靛蓝。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal显色反应：显色反应： lacZ的的 肽互补肽互补1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4 4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体2）受体菌：）受体菌：lacZ突变（突变（lacZ
13、M15）受体菌基因组的受体菌基因组的 -半乳糖苷酶基因的氨半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失基端有缺失（缺失 肽），只编码肽），只编码C端端序列，不能形成活性酶，因而不能分序列，不能形成活性酶，因而不能分解解Xgal 受体菌株：受体菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC质粒载体上的质粒载体上的lacZ 编码编码 肽与这个肽与这个缺失突变的缺失突变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使它，使它能形成能形成4聚体。又能分解聚体。又能分解Xgal。产生。产生蓝色物质。蓝色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41
14、aapUC lacZ 受体菌受体菌lacZ3）载体）载体lacZ与与 互补互补4） 互补的插入失活互补的插入失活pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位端有一段多克隆位点点(MCS)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰LacZ的合的合成，但插入外源基因就会阻止成，但插入外源基因就会阻止LacZ的的合成。不能互补。合成。不能互补。 lacZ 5 3 肽移码突变肽移码突变lacZ 5 3 肽肽不互补不互补互补互补MCS外源外源DNA IPTG的诱导作用的诱导作用IPTG ( Isopropyl -D-1-Thiogalactopyranoside )是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导
15、lac操纵子的启动转录，使操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的受体菌基因组中的lacZ 的的C端部分端部分和载体的和载体的lacZ 肽肽都表达。从而互补。都表达。从而互补。但载体但载体MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，仍然不后，仍然不能产生能产生 肽！肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：诱导的结果：无质粒的无质粒的 受体菌受体菌 - -半乳糖苷半乳糖苷酶部分缺失
16、，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌 - -半乳糖苷半乳糖苷酶的的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有蓝色有蓝色菌斑生菌斑生长长带外源带外源DNADNA插插入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 - -半半乳糖苷乳糖苷酶的缺的缺失。不能分解失。不能分解XgalXg
17、al，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有白色有白色菌斑生菌斑生长长（5）pUC系列载体的优点系列载体的优点 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18为为2682bp，pUC8为为2750bp。 选择方便选择方便X-gal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS），使有两个不），使有两个不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。 测序方便测序方便pUC的的MCS与与M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCS完完全相同，便于把外源全相同，便于把外源
18、DNA转移到转移到M13载载体上测序。体上测序。M13mp18的多克隆位点的多克隆位点六、其它质粒载体六、其它质粒载体1. pGEM-3Z由由pUC派生而来。派生而来。与与pUC的主要区别是在的主要区别是在MCS的两侧分别的两侧分别加了一个噬菌体加了一个噬菌体启动子启动子T7和和SP6。T7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶识别转录。聚合酶识别转录。 如果加入纯化的如果加入纯化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在试管里就可以转录在试管里就可以转录mRNA 外源基因正接反接都可以转录。外源基因正接反接都可以转录。 MCS与与p
19、UC18的完全一样。的完全一样。2. pGEM-4Z：与与pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7启动子和启动子和SP6启动子的启动子的位置互换位置互换。（1 1）pGEM-3Z的特点：的特点：3. 穿梭质粒载体穿梭质粒载体（1 1）穿梭质粒载体的结构）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。细胞中存活和复制的质粒载体。（shuttle plasmid vectors）Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择
20、标记选择标记MCS大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体（2 2）常用的穿梭质粒载体）常用的穿梭质粒载体（3 3）穿梭载体的优点）穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。间来回转移基因。克隆、构建克隆、构建表达表达E.coliAnimal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达利用大肠杆菌进行基因
21、克隆、表达七、质粒载体的不稳定性七、质粒载体的不稳定性1. 质粒稳定遗传必须的两个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分 配到两个子细胞中。配到两个子细胞中。有主动分配和随机分配两种假说。有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配）主动分配天然质粒。天然质粒。2. 质粒分配方式质粒分配方式具有一个控制质粒拷贝分配的功能区具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。粒能正确分配
22、到两个子细胞中。人工构建的质粒载体人工构建的质粒载体缺失了缺失了par区区，只，只能以随机分配方式分到子细胞中。能以随机分配方式分到子细胞中。人工质粒。人工质粒。（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（2）随机分配）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。质粒的优势群体。3. 分离的不稳定性分离的不稳定性（segregation instability）4. 结构的不稳定
23、性结构的不稳定性（structural instability）寄主基因组的寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。或缺失。ISdimer重组重组（1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：5. 影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞生长减缓：使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。 复制负荷复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比。减缓的程度与质粒的分子量成正比。 转录和翻译负荷转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！丢失质粒的细胞反而
24、会成为优势群体！每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。全相同，称差度。（2）质粒载体的拷贝数）质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。差度（差度（variance）：）：是产生无质粒细胞的重要原因。是产生无质粒细胞的重要原因。高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。野生型野生型E.coli中，质粒在寄主的中，质粒在寄主的重组酶重组酶作作用下会发生重组形成用下会发生重组形成二聚体质粒二聚体质粒。（3）寄主菌的重组
25、体系）寄主菌的重组体系二聚体灾难（二聚体灾难（dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片断的质粒载体普遍含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。能形成质粒寡聚体。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。导致质粒失控。第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒（噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。）。一、噬菌体的一般特性一、噬菌体的一般特性结构：结构： 蛋白质外壳内包裹蛋白质外壳内包裹着着DNA（双链、单（双链、单链、线性、环状等）链、线性、环状等）。T4 Bacteriophagesingle
26、linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNA噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能： 1 1、保护自己的核苷酸分子（、保护自己的核苷酸分子（DNADNA、RNARNA）免遭）免遭环境化学物质的破坏；环境化学物质的破坏； 2 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗
27、粒；系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒 噬菌体的结构和其核酸类型噬菌体的结构和其核酸类型： 结构：结构：无尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、 具尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、 线状体型线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性核酸类型：最常见的是双链线性DNADNA、 双链环形双链环形DNADNA、 单链环形单链环形DNADNA、 单链线形单链线形DNADNA、 单链单链RNARNA。分为两种：分为两种：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌体的生活周期二、噬菌体的生活周期感染细菌后立
28、即在菌体内复制和合成蛋感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。菌体。烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage)2. 溶原周期：溶原周期：感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌整合到细菌的染色体的染色体DNA中。形成这一过程称为溶中。形成这一过程称为溶源化（源化（lysogenization)。整合到细菌染色体的整合到细菌染色体的噬菌体噬菌体DNA称为称为原原噬菌体噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。，随细菌的染色体复制而复制。温和噬
29、菌体（温和噬菌体（temperate phage)原噬菌体（原噬菌体（prophage)：温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶 源生命周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化： 用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶 源性细菌的过程整合： 噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体 DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的 噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并 使之溶源化的同种噬菌体再感染溶源周期的主要特征：溶源周期的主要特征：噬菌体噬菌体特征：特征： 1 1、噬菌体的、噬菌体的DNADNA分子注入细菌细胞分子注入细菌细胞 2 2、经过短暂的转录之后，
30、需要合成一种整合酶，、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭于是转录活性便被一种阻遏物所关闭 3 3、噬菌体的、噬菌体的DNADNA分子插入到细菌染色体基因组分子插入到细菌染色体基因组DNADNA上，变成原噬菌体上，变成原噬菌体 4 4、细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌、细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。染色体的一部分进行复制。三、单链噬菌体载体三、单链噬菌体载体iii) M13、f1、fd 噬菌体噬菌体单链环状单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：的丝状大肠杆菌噬菌体：M13 噬菌体噬菌体（2）复制型（）复制型（RF）是双
31、链环状）是双链环状DNA。1. 单链单链DNA噬菌体的特点噬菌体的特点（3）RF DNA和和ssDNA都能转染感受态都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。大肠杆菌。并产生噬菌斑。（5）可产生大量的含有外源）可产生大量的含有外源DNA插入片插入片 断的断的单链分子单链分子，便于作探针或测序。，便于作探针或测序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包装限制。）不存在包装限制。2. M13 噬菌体噬菌体RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式在寄主细胞内以高拷贝形式存在。存在。成熟的噬菌体里只包装有成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也，也容易提取。容易提取。M13噬菌体只感染噬菌体只感
32、染雄性雄性大肠杆菌。大肠杆菌。 但但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。可以转染雌性大肠杆菌。6407 bp。（2）DNA长度长度（3）DNA提纯提纯（1）寄主）寄主（4）M13的生活周期的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的长变慢，约为正常的1/21/23/43/4）M13通过雄性细菌的通过雄性细菌的F性须性须注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA转录转录mRNA、合成、合成+DNA、翻译形、翻译形成噬菌体蛋白成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞挤出寄主细胞+DNA
33、-DNAmRNAM13外壳蛋白外壳蛋白组装成子代组装成子代M13+DNA注入大肠杆菌注入大肠杆菌复制复制转录转录翻译翻译+DNA指导合成指导合成+DNA200个个 RF DNA每个细胞可以放出约每个细胞可以放出约10001000个个M13M13颗粒！颗粒！3. M13载体的构建：载体的构建：M13基因组中只有基因基因组中只有基因II与基因与基因IV之间之间存在一段存在一段507bp的基因间隔区。的基因间隔区。（1）克隆区域的选定）克隆区域的选定 基因间隔区（基因间隔区（inter genic region, IG区）区）IG区内只有一个区内只有一个 BsuI 切点。切点。其余其余9个个BsuI
34、限制性位点分布在其它部位。限制性位点分布在其它部位。 酶切位点酶切位点M13J. Messing证明，证明，IG区存在区存在M13的的复制起复制起点点，但可以插入外源，但可以插入外源DNA而不影响而不影响M13噬噬菌体的活力。菌体的活力。在在IG区内插入一个大肠杆菌的区内插入一个大肠杆菌的LacZ（ -肽序列肽序列)。 利用利用 -肽序列中的三个单一酶切位点肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和和 Pvu I）。）。（2）加入酶切位点）加入酶切位点 在在IG区内加入单一内切酶位点区内加入单一内切酶位点第一个第一个M13载体：载体：M13mp1：M13 RFBsuI不完全消化
35、不完全消化各种长度的线性片断各种长度的线性片断（其中应有只在（其中应有只在IGIG上切开的线性上切开的线性全长全长M13M13）E.coli lac基因的基因的HindII片断片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）连接连接M13mp1JM101宿主宿主只有在只有在IG区插入区插入lacZ才能存活并才能存活并在在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑上出现互补的蓝噬菌斑（3）M13载体系列载体系列加上常用的酶切位点。加上常用的酶切位点。 M13载体系列的命名载体系列的命名M13mpn n代表系列数字代表系列数字 对对M13mp1的改进的改进B. Gronenborn和和J. Messing1978
36、年把年把LacZ 5端的第端的第13个核苷酸个核苷酸G突变成突变成A，产生了一个，产生了一个EcoR I切点。切点。M13mp2：5ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用用N-甲基甲基-N-亚硝基脲亚硝基脲 把把G甲基化甲基化 5ATGACCATGATTACGGATTCA-转染转染E.coli。mG与与T配对，复制两次后配对，复制两次后 5ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切点切点用用EcoRI切切M13mp1M13mp2选择能切开的选择能切开的 线性分子线性分子再环化再环化M13mp1 对对M13mp2的进一步改进的进一步改进在在M13mp2的的LacZ的的5
37、端加上一段人工端加上一段人工合成的多克隆位点（合成的多克隆位点（MCS）。）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19对应有相同对应有相同MCS的的pUC系列载体：系列载体：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成为成为M13mp系列载体：系列载体：与与pUC18相同相同M13mp18的多克隆位点的多克隆位点4. M13系列载体的优点系列载体的优点（1）有）有MCS，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段（2） Xgal显色反应，可供直接选择显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆
38、能力大）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链）可以克隆双链DNA分子中的每一条链分子中的每一条链子代子代M13噬菌体中包含的是单连噬菌体中包含的是单连+DNA。MCS+-+-+-编码链编码链非编码链非编码链外源外源DNA不同的酶切不同的酶切不同的酶切不同的酶切插入插入M13 vectorM13 RF+-+-+-外源外源DNA转染转染E. coli成熟的子代成熟的子代M13中中+Phage M13 replication in the host cell:+RNA polDNA polIIIRFNicked by gene 2 protein+ss-Rolling circle replic
39、ation, then cut and ligateCoated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell. 插入外源插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降后，遗传稳定性显著下降 实际克隆能力小于实际克隆能力小于1500bp1500bp。虽无包装限制，虽无包装限制，并非无限包装！并非无限包装！5. M13载体的缺点载体的缺点6. 噬菌粒载体（噬菌粒载体（phagemid vectors）由由质粒载体质粒载体与与单链噬菌体
40、载体单链噬菌体载体的复制起点的复制起点结合而成的新型载体系列。结合而成的新型载体系列。MCS噬菌体噬菌体ori质粒质粒oriAmprlacZ lacI约约3000bp（比（比M13小）小）克隆能力大克隆能力大能插入能插入10kb的外源的外源DNA。两种复制形式两种复制形式分子量小分子量小（1）噬菌粒载体的特点）噬菌粒载体的特点既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。的复制起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。又能在噬菌体内进行单链复制。（2）常见的噬菌粒载体）常见的噬菌粒载体噬菌粒载
41、噬菌粒载体体质粒部分质粒部分单链噬菌单链噬菌体部分体部分辅助噬菌辅助噬菌体体大肠杆菌大肠杆菌寄主寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101 VXM13M13变异变异株株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/ pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。（3）pUC118/pUC119 构成构成1）M13的基因间隔区（的基因间隔区（IG）2）pUC18/pUC19质粒载体：质粒载体：带有带有M13复制起点。复制起点。质粒复制起点质粒复制起点 Amp
42、r lacZ MCSMCSpUC18/pUC19 oriAmprlacZ lacIM13 ori3.2kbpUC118/119 pUC118/119的复制模式的复制模式两种不同的复制模式两种不同的复制模式1）双链质粒复制模式）双链质粒复制模式受受pUC本身的复制起点（来源于本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。）的控制。每个细胞能达到每个细胞能达到500500个拷贝。个拷贝。来源于来源于M13的复制起点被的复制起点被辅助噬菌体辅助噬菌体的基因的基因II产物控制。产物控制。2）单链滚环噬菌体复制模式）单链滚环噬菌体复制模式外壳蛋白外壳蛋白复制蛋白复制蛋白辅助辅助M13包装包装当寄主细胞被当寄
43、主细胞被辅助噬菌体辅助噬菌体M13感染后。感染后。 噬菌粒载体的包装噬菌粒载体的包装1）辅助噬菌体：）辅助噬菌体：自身的自身的复制起点发生了突变复制起点发生了突变，复制效率低，复制效率低下，但感染细菌后能表达出下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复外壳蛋白和复制蛋白制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。，帮助噬菌粒载体复制。如如M13K07等。等。2）包装：）包装：辅助噬菌体辅助噬菌体外壳蛋白和外壳蛋白和 复制蛋白复制蛋白噬菌粒载体噬菌粒载体ssDNA噬菌体噬菌体（4）pBluescript 噬菌粒载体（噬菌粒载体（pBS）Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。公司发展的一类噬菌粒载体。由由pUC
44、质粒载体、质粒载体、f1噬菌体的复制起点和噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子噬菌体的启动子组成。组成。 特点特点 组成组成MCS两侧分别加上两侧分别加上T3和和T7噬菌体的噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体启动子。加入适当的噬菌体RNA聚聚合酶，就可以定向体外转录。合酶，就可以定向体外转录。1）定向体外转录）定向体外转录2）两种复制模式）两种复制模式既能以质粒的形式复制，又能以噬既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。菌体的形式复制包装。3）选择方便）选择方便有有Ampr和和lacZ，可以进行，可以进行Amp抗性抗性选择和选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。蓝白斑选择。4）插入
45、方便）插入方便18个单一酶切位点的个单一酶切位点的MCSSK：表示：表示lacZ的的转录方向转录方向是沿是沿MCS上的上的 SacI KpnI +（f1+）：单链）：单链复制起始方向复制起始方向背离背离 lacZ，能回收能回收lacZ 的编码链（的编码链（+）pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-）KS：反向（：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）相反）-（f1-）：能回收）：能回收lacZ的非编码链（的非编码链（-）1）pBluescript SK/KS（+/-）区分：）区分： 常用的常用的 pBluescript 载体载体pBS SK+pBS K
46、S-（5）PCR产物克隆载体产物克隆载体 T 载体载体pCR系列载体系列载体Invitrogen公司开发的公司开发的线性线性噬菌粒载体。噬菌粒载体。 结构结构pUC的质粒部分、的质粒部分、fi噬菌体噬菌体ori、Kanr和和Ampr抗性。抗性。MCS的中部已经切开，各有一个的中部已经切开，各有一个3端突出的端突出的T。 特点特点PCR产物往往在产物往往在3端突出一个端突出一个A，所，所以能与这个载体直接连接。以能与这个载体直接连接。pCR2.1pCR2.1的的MCS克隆的克隆的PCR产物能被两侧的产物能被两侧的EcoRI切下来回收。切下来回收。pCR2.1-topopCR1000Promega
47、 公司的公司的T载载体系列体系列pGEM-T vectorpTarget vectorG418抗性抗性可在真核生物表达可在真核生物表达外显子捕捉外显子捕捉T vector的克隆过程的克隆过程简便！简便！AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA7. 噬菌体展示载体（噬菌体展示载体（ Phage display vector）（1）噬菌体展示（）噬菌体展示（Phage display）将外源蛋白（多肽、酶、抗体、将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于成融合蛋白，表达于噬菌体的外
48、表面噬菌体的外表面。G. P. Smith1985年发明。年发明。丝状噬菌体（丝状噬菌体（M13、f1等）外壳颗粒的等）外壳颗粒的一端，有一端，有3-5个基因个基因编码的蛋白质编码的蛋白质（g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。程中起作用。M13（2）噬菌体展示载体的构建）噬菌体展示载体的构建把外源把外源DNA片断插入基因片断插入基因的序列的序列前端前端，并保持两者的阅读框正确，表达出融合并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。蛋白。启动子启动子外源外源DNAM13基因基因oriM13 display vector外源外源多肽多肽四、双链噬菌体载体四、双链噬
49、菌体载体 载体载体（1）长度为）长度为48502 bp； （2）双链线性）双链线性DNA； （3）但在两端有）但在两端有cos位点，可以环化。位点，可以环化。 DNA两端各有两端各有12bp的粘性末端，粘性末的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为端形成的双链区域称为cos位点。位点。1. DNA分子的特点分子的特点 cos位点（位点（cohensive-end site）：）： phagephage48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) 溶菌阶段溶菌阶段 ( (复制和释放复制和释放) ) 溶源阶段溶源阶段 ( (整合到寄主染色
50、体上整合到寄主染色体上) ) DNA进入细菌体内后，可形成双链环状进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（复制型（RF DNA）。）。 噬菌体和其噬菌体和其DNAlDNA上有至少上有至少61个基因，有一半是必须的，个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。与自身的活动有关，成簇排列。 其他约其他约1/3是是非必须基因（非必须基因（位于尾部合成至阻位于尾部合成至阻遏之间的区段）。遏之间的区段）。2. 噬菌体的基因组特点噬菌体的基因组特点 A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam
51、 red cIII NCOS COS 头部基因头部基因 尾部基因尾部基因 功能不明区功能不明区 溶源化溶源化 重组重组 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 溶菌溶菌生长非必须区段生长非必须区段cIcI基因：溶源过程控制基因。基因：溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA(20-23 kb) phagephage12bp genome(48502bp) 噬菌体感染细菌的早期：双链进行噬菌体感染细菌的早期：
52、双链进行 型复制。型复制。3. DNA的复制的复制 模型模型（1） 型复制型复制（2）滚环复制）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。感染的晚期：启动滚环复制机制。形成多联体形成多联体 DAN分子。分子。这种多联体分子必须在这种多联体分子必须在cos位点被切断位点被切断成单体分子才能被包装起来。成单体分子才能被包装起来。（1）构建原理：）构建原理：4. 噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建（2）构建过程）构建过程在这个非必须区内制造限制酶切点在这个非必须区内制造限制酶切点 引进某些突变表型，作为选择标记引进某些突变表型，作为选择标记 突变某些基因，使它成为安全载体突变某些基因，使它成为安全载体
53、删除删除 DNA必须区段上常用的限制酶切点必须区段上常用的限制酶切点 噬菌体噬菌体DNA上本身有上本身有5个个 EcoR I 和和7 个个Hind III切点！切点！删除删除 噬菌体的非必需区，留出插入空间。噬菌体的非必需区，留出插入空间。（3）人工构建的人工构建的 噬菌体载体有两种类型：噬菌体载体有两种类型： 插入型载体（插入型载体（insertion vectors)：如如 gt10、 gt11、 BV2、 NM540、 NM1590、 NM6071）免疫功能失活型：）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性插入位点位于载体合成活性阻遏物区阻遏物区域域（cI基因）内。基因）内。EcoR I
54、cI gt10插入导致载体不能合成阻遏物，插入导致载体不能合成阻遏物， 载体载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清清晰的噬菌斑。晰的噬菌斑。 没有外源没有外源DNA插入的插入的 载体感染受体菌形成载体感染受体菌形成混浊噬菌斑混浊噬菌斑。选择标记选择标记:如如 NM1149载体的两个克隆位点（载体的两个克隆位点（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因内部。基因内部。2） -半乳糖苷酶失活型载体：半乳糖苷酶失活型载体：在在 基因组中引入了基因组中引入了LacZ序列。（其上含有序列。（其上含有一个一个EcoR I 克隆位点）。克隆
55、位点）。感染感染LacZ突变的大肠杆菌，经突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，的诱导，利用利用Xgal的显色反应的显色反应作选择标记。作选择标记。LacZ EcoR ICharon16A选择标记选择标记: 替换型载体（替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于于 DNA的非必须区两端。的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源用同样酶切成的外源DNADNA片断置换。片断置换。可置换区可置换区MCSMCS如：如： EMBL4、Charon40等。等
56、。1） EMBL4 EMBL4的可置换片断内部还有的可置换片断内部还有Sal I酶切酶切位点。位点。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂EcoR I BamH I Sal ISal I BamH I EcoR ISal I Sal I EMBL42）Charon40Charon40的可置换片断是由的可置换片断是由DNA短片短片重复构成，片断之间有重复构成，片断之间有Hae I 切点切点。在克隆的时候，可以用在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。换片断切成小片
57、断，以防止重新与载体连接。左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂MCSMCSCharon40Hae I可取代片断中如果包含可取代片断中如果包含LacZ，可用，可用Xgal显色显色作筛选标记。作筛选标记。（4） 载体的筛选标记载体的筛选标记 插入型载体插入型载体根据插入所引起的表型突变。根据插入所引起的表型突变。 置换型载体置换型载体 Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) phagephageLytic phase (Replicate and release)Ly
58、sogenic phase (integrate into host genome) 载体克载体克隆策略隆策略置换型载体置换型载体 DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。率远比质粒低。5. 载体的体外包装载体的体外包装 在试管中与在试管中与 噬菌体的噬菌体的头部头部和和尾部尾部蛋白人蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组细菌，把重组DNA注入受体菌中。注入受体菌中。必须利用噬菌体外壳的作用！必须利用噬菌体外壳的作用！（1）体外包装：）体外包装： l 的的D基因的产物也是头部蛋白，但主基因的产物也是头部蛋白
59、，但主要与要与 DNA 进入头部和头部的成熟有进入头部和头部的成熟有关（只占关（只占20%）。）。（2）体外包装过程）体外包装过程 噬菌体外壳蛋白的合成噬菌体外壳蛋白的合成E 基因基因l的的E 基因编码头部蛋白的主要成基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的分（占头部总蛋白的70%）。）。D基因基因E基因基因突变突变只合成尾部只合成尾部蛋白和包装蛋白和包装识别蛋白识别蛋白D基因基因突变突变合成头部蛋合成头部蛋白和尾部蛋白和尾部蛋白，但不能白，但不能聚合和包装聚合和包装DNA提取尾提取尾部蛋白部蛋白提取头提取头部和尾部和尾部蛋白部蛋白重组的重组的 载体载体DNA体外包装体外包装成活性噬成活性噬
60、菌体菌体外源的重组外源的重组 DNA载体被诱发与内源载体被诱发与内源性原性原 DNA发生重组。发生重组。（3）体外包装存在的问题：）体外包装存在的问题： 包装错误：包装错误：既能包装用于生产头部蛋白的既能包装用于生产头部蛋白的内源性原内源性原 DNA，也能包装，也能包装重组的重组的 DNA载体载体。 重组：重组： 体外包装的容量限制：体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的必须在正常野生型容量的75%105% （3651kb）之间。之间。既不能超过正常野生型容量的既不能超过正常野生型容量的105%105%； 又不能低于正常野生型容量的又不能低于正常野生型容量的75%75%野生型野生型 DNA
61、的必须区是的必须区是28kb，所以，所以 载体的最大克隆容量是载体的最大克隆容量是23kb。（。（实际上实际上为为15kb）。）。比一般的质粒载体的容量大的多。比一般的质粒载体的容量大的多。 （4） DNA载体的优点载体的优点用在真核生物基因组文库的建立。用在真核生物基因组文库的建立。Sau3ABamHI噬菌体感染细菌形成的噬菌斑噬菌体感染细菌形成的噬菌斑1978年年J. Collins和和B. Hohn等人发展出等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid) DNA：46kb（1）大小）大小 （2）组成）组成 6. cosmid载体（粘粒）载体（粘
62、粒）cos序列和控制包装的的序列。序列和控制包装的的序列。pBR322：质粒的复制子质粒的复制子 抗药性基因抗药性基因 几个限制性酶的单一位点几个限制性酶的单一位点柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kbCloningbyusingcosmidvectors.(a)Inadditiontoampr,ORI,andpolylinkerasintheplasmidvector,thecosmidvectoralsocontainsaCOSsite.(b)Aftercosmidvectorsarecleavedwithrestrictionenzyme
63、,theyareligatedwithDNAfragments.Thesubsequentassemblyandtransformationstepsarethesameascloningwithlphages具有具有 噬菌体的特性：噬菌体的特性：（3）cosmid vector的特点的特点 克隆外源克隆外源DNA后可以后可以体外包装体外包装成噬菌成噬菌体颗粒。体颗粒。在寄主细胞内形成环化在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌成新的噬菌体颗粒而溶菌 ）。）。具有质粒载体的特性：具有质粒载体的特性：大多带有大多带有pMB1或或ColE1的复制子，的复制子，能象质粒一
64、样复制。能象质粒一样复制。有抗菌素抗性基因，和插入失活的有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。克隆位点。方便的选择：方便的选择：高容量的克隆能力：高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于（最少不能低于30kb）。）。51kb-5kb=45kb（4）部分）部分cosmid vectorCosmid Cosmid 载体载体载体载体复制复制复制复制子子子子大小大小大小大小（kb)kb)选择标选择标选择标选择标记记记记克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点克隆能克隆能克隆能克隆能力力力力（kb)kb)c2XBc2XBpMB1pMB16.86.8AmpAmpr r, , KanKanr r BamHI,
65、ClaI, EcoRI, HindIII, BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SmaIPstI, SmaI32453245pHC79pHC79pMB1pMB16.46.4AmpAmpr r , , TetTetr r EcoRI, HindIII, SalI, BamHI, EcoRI, HindIII, SalI, BamHI, PstI, CalIPstI, CalI29462946pHS262pHS262ColE1ColE12.82.8KanKanr r BamHI, EcoRI, HincIIBamHI, EcoRI, HincII34503450p
66、JC74pJC74ColE1ColE115.815.8AmpAmpr r EcoRI, BamHI, BglII, SalIEcoRI, BamHI, BglII, SalI21372137pJC75-pJC75-5858ColE1ColE111.411.4AmpAmpr rEcoRI, BamHI, BglIIEcoRI, BamHI, BglII16421642pJC74mpJC74mColE1ColE12121AmpAmpr r, , KanKanr rBamHIBamHI16321632pJC720pJC720ColE1ColE17.17.1Elimm, Elimm, RifRifr
67、r HindIII, XmaIHindIII, XmaI11281128Cosmid Cosmid 载体载体载体载体复制复制复制复制子子子子大小大小大小大小（kb)kb)选择选择选择选择标记标记标记标记克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点克隆能克隆能克隆能克隆能力力力力（kb)kb)pJC81pJC81pMB1pMB17.17.1AmpAmpr r, , TetTetr rKpnI,BamHI,HindIII,KpnI,BamHI,HindIII,SalISalI30463046pJB8pJB8ColE1ColE1 5.45.4AmpAmpr r BamHI,HindIII,SalIBamHI,H
68、indIII,SalI31473147MuA-3MuA-3pMB1pMB14.84.8TetTetr rPstI,EcoRI,BalI,PvuI,PstI,EcoRI,BalI,PvuI,PvuIIPvuII32483248MuA-10MuA-10pMB1pMB14.84.8TetTetr rEcoRI,BalI,PvuI,PvuEcoRI,BalI,PvuI,PvuI I32483248pTL5pTL5pMB1pMB15.65.6TetTetr rBglII,BalI,HpaIBglII,BalI,HpaI31473147pMF7pMF7pMB1 pMB1 5.45.4AmpAmpr r E
69、coRI,SalIEcoRI,SalI32483248应用应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组片端的真核基因组DNA技术，叫技术，叫“柯柯斯克隆斯克隆”（cosmid cloning）。）。（5）cosmid cloning 理论依据：理论依据：cos位点位点: 噬菌体的生命周期中，会产生数百个噬菌体的生命周期中，会产生数百个 DNA通过通过cos位点连接的位点连接的“多联体多联体”分子。分子。“多联体多联体”复制：复制：包装识别。包装识别。在包装的时候，在包装的时候， 噬菌体具有位点特异噬菌体具有位点特异的的末端酶（末端酶（terminase）体系）体
70、系（Ter体系）体系），识别，识别cos位点，把多联体切成单个位点，把多联体切成单个 DNA长度。长度。两个两个cos位点之间，必须保持位点之间，必须保持3845kb的的DNA，Ter体系才能识别。体系才能识别。Ter体系：体系：包装限制：包装限制：用特定的核酸内切酶消化真核生物用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA。（6）cosmid克隆的一般过程克隆的一般过程用同样的内切酶消化用同样的内切酶消化cosmid载体。载体。产物中将有一定比例的分子是两端各产物中将有一定比例的分子是两端各有一个有一个cos位点、长度位点、长度40kb左右的真左右的真核核DNA与载体的连接物。与载体的连接物。连接连接
71、切割切割合适长度合适长度的杂种的杂种DNA连接物，并包连接物，并包装入噬菌体头部。装入噬菌体头部。注入到细菌体内的杂种注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，分子环化，并按质粒的方式复制。并按质粒的方式复制。感染大肠杆菌感染大肠杆菌 Ter体系识别并切割体系识别并切割DigestionLigationC) Packaging and infectFormation of a cosmid clone大质粒！大质粒！载体片断自我连接。载体片断自我连接。外源外源DNA片断自我连接。片断自我连接。多个本来不在一起的外源多个本来不在一起的外源DNA片断连接片断连接起来同时插入载体。起来同时插入载体。（7）
72、cosmid载体克隆的缺点载体克隆的缺点用用碱性磷酸酶碱性磷酸酶除去线性质粒片断除去线性质粒片断5端的磷端的磷酸，可防止载体自体连接。酸，可防止载体自体连接。克服载体自体连接的改良方案：克服载体自体连接的改良方案：第三节第三节 大分子大分子DNA克隆载体克隆载体A.W.Murray 1983年形成基础理论年形成基础理论, D.T.Burke等等1987年变为现实。年变为现实。一、酵母人工染色体一、酵母人工染色体1. YAC的特点：的特点：（1）只能在酵母细胞中扩增。）只能在酵母细胞中扩增。（yeast artificial chromosome, YAC)（2）克隆容量大，为）克隆容量大，为2
73、30kb-1700kb。（3）构建原理：按染色体结构构建。）构建原理：按染色体结构构建。（1）DNA复制起始点（复制起始点（ori） 2. 染色体复制和遗传的三个基本组件：染色体复制和遗传的三个基本组件：TELTELCENORI（2）着丝粒（）着丝粒（centromere，cen）（3）两个端粒（）两个端粒（telomeres，tel）（1）着丝粒区（）着丝粒区（CEN）A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA3. YAC的组成结构的组成结构酵母染色体着丝粒区的保守序列酵母染色体着丝粒区的保守序列78-86bpIIIIII由三个区组成由三个区组成酵母第酵母第3、4、6
74、、11号染色体的着丝粒区序列：号染色体的着丝粒区序列：酵母酵母端粒保守序列端粒保守序列是是(G4T2)n 重复序列。重复序列。（3）复制起点（）复制起点（ORI）约约100bp的自主复制序列（的自主复制序列（ARS）。）。（2）端粒（）端粒（TEL）人是人是TTAGGG重复序列重复序列; 四膜虫是四膜虫是 GGGTTG重复序列。重复序列。（真核生物中只有酵母菌有（真核生物中只有酵母菌有ARS）位于位于 SUP4 基因内部。基因内部。（4）克隆位点）克隆位点插入失活选择：插入失活选择：SUP4酶失活的酵母酶失活的酵母菌落呈菌落呈红色红色； 不失活的菌落是白不失活的菌落是白色。色。TRP1、URA
75、3（分别位于两臂）。（分别位于两臂）。细菌的复制起点细菌的复制起点 ori和抗生素标记和抗生素标记Ampr （5）在酵母中的标记基因）在酵母中的标记基因（6）在细菌中操作）在细菌中操作4. YAC克隆克隆外源外源DNAURA3TRP1 CEN4（1）宿主酵母菌：）宿主酵母菌： 只有同时得到只有同时得到YAC的的两个臂两个臂，才能在基，才能在基本培养基（不加本培养基（不加TRP和和URA）上生长。）上生长。（2）选择方式）选择方式5. YAC转化过程转化过程trp- 和和 ura-cenura3trp1（1）存在插入子的稳定性问题）存在插入子的稳定性问题6. YAC的缺点：的缺点：（2）同一酵母
76、细胞内多个）同一酵母细胞内多个YAC引起交换引起交换（3）转化效率低）转化效率低（4）难以制备纯的）难以制备纯的YAC-DNAH. Shizuya等等1992年在大肠杆菌年在大肠杆菌F因子因子的基础上构建的。的基础上构建的。（2）克隆容量可达）克隆容量可达300kb。二、细菌人工染色体（二、细菌人工染色体（BAC）1. F质粒的特点：质粒的特点：每细胞只有一个拷贝，不会重组。每细胞只有一个拷贝，不会重组。（4）便于提纯。）便于提纯。像提取质粒一样直接提纯。像提取质粒一样直接提纯。（1）单拷贝复制。）单拷贝复制。（3）比较稳定。）比较稳定。（1）OriS和和repE控制控制质粒的粒的单向复制。向
77、复制。 （2）parA和和parB维持低水平持低水平质粒拷粒拷贝数。数。（3）CosN是噬菌体末端是噬菌体末端酶酶专一性切割位点。一性切割位点。 （4）loxP是是P1 Cre蛋白作用位点。蛋白作用位点。 （5）HindIII和和BamHI是插入位点。是插入位点。 （6）两）两侧的的NotI可用于切下外源可用于切下外源DNA。（7）氯霉素抗性基因霉素抗性基因CMR 2. BAC的组成结构的组成结构第四节第四节 病毒载体病毒载体一、反转录病毒载体一、反转录病毒载体1.1.反转录病毒（反转录病毒（ritrovirus）正链正链RNA病毒，显著特点是具有病毒，显著特点是具有2倍体基因组。倍体基因组。
78、 两个相同的两个相同的RNA分子在分子在5端附近经氢键连接端附近经氢键连接形成形成70S RNA，这种结构可能在逆转录过程，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。中起调节作用。反转录病毒结构反转录病毒结构类似于真核细胞类似于真核细胞mRNA2. 反转录病毒的基因组结构反转录病毒的基因组结构envpolgagU3U3U5U5cappolyA3 5 LTRLTRRR +Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV)长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链连
79、接处切开双链DNA，随，随机插入到宿主基因组里。机插入到宿主基因组里。 LTR本身还具有启动子和本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。加尾信号的功能。LTR： +：组装时必需的非编码序列：组装时必需的非编码序列。 env：外壳蛋白。：外壳蛋白。 pol：反转录酶和整合酶。：反转录酶和整合酶。 gag：核心蛋白。：核心蛋白。envpolgagU3U3U5U5cappolyA3 5 LTRLTRRR +U5、U3：5段或段或3端独特序列。端独特序列。3. 反转录病毒载体构建反转录病毒载体构建（1）删除）删除pol、env和和gag基因。基因。 5LTR +外源基因外源基因neor3LTR启动
80、子启动子（2）插入标记基因（如）插入标记基因（如neor neor）。）。（3）外源基因和启动子插入到）外源基因和启动子插入到 +下游。下游。二、二、DNA病毒载体病毒载体腺病毒（腺病毒（adenovirus）1. 腺病毒的基因组腺病毒的基因组线状双链线状双链DNA病毒，基因组中有病毒，基因组中有14个基个基因。因。 共同特点是都带有倒置的末端重复共同特点是都带有倒置的末端重复（ITR），在病毒的复制过程中起非常），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。重要的作用。（1 1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。 （2 2）宿主范围广）宿主范围广2. 腺病毒的腺病
81、毒的优点优点不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。染不能分裂的细胞（如神经细胞）。（4 4）载体中的插入片断可达）载体中的插入片断可达7.5kb 7.5kb （有包装容量限制）。（有包装容量限制）。 （5 5）腺病毒容易制备、纯化。）腺病毒容易制备、纯化。 （6 6）基因组结构和功能了解得清楚。）基因组结构和功能了解得清楚。（3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，）可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染。可以通过口服或喷雾的方式感染。3. 腺病毒载体腺病毒载体是目前最常用的基因治疗载体之一。是目前最常用的基因治疗载体之一。（
82、1）腺病毒载体的构建）腺病毒载体的构建用用同源重组同源重组的方法插入外源基因。的方法插入外源基因。删除腺病毒删除腺病毒DNA一些非必需区一些非必需区ITRE1ITRE3如如E1或或E3区，增加插入能力。区，增加插入能力。E1或或E3缺失病毒。缺失病毒。含有含有E1或或E3区区两侧的同源序列两侧的同源序列。在同源序列之间在同源序列之间插入外源基因和插入外源基因和选择标记基因。选择标记基因。构建质粒载体构建质粒载体把质粒切成线性把质粒切成线性共同转染细胞共同转染细胞在细胞中发生同源重组，把外源在细胞中发生同源重组，把外源DNADNA加到病毒加到病毒基因组中，并包装成基因组中，并包装成重组病毒颗粒重
83、组病毒颗粒。质粒与病毒质粒与病毒DNA（缺失（缺失E1或或E3）第五节第五节 基因打靶载体（基因打靶载体（Targeting vector）通过通过DNA同源重组，使细胞同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因。定的位点插入外源基因。一、基因打靶（一、基因打靶（gene targeting）基因敲出（基因敲出（knock-out）基因敲入（基因敲入（knock-in）二、基因打靶载体的要求二、基因打靶载体的要求1. 要求能整合到染色体上特定的位置。要求能整合到染色体上特定的位置。2. 整合的位置尽量选在
84、基因组内编码非必整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物的地方。需产物的地方。3. 必必须须整合在基因组中可以转录的区域。整合在基因组中可以转录的区域。定点整合定点整合1. 两段同源两段同源DNA序列（序列（HB1和和HB2）2. 目的基因目的基因三、基因打靶载体组成三、基因打靶载体组成3. 编码抗编码抗G418的基因（的基因（neor）4. 胸苷激酶基因（胸苷激酶基因（HSV-tk1和和HSV-tk2）与靶位点两端的区域同源与靶位点两端的区域同源新霉素（新霉素（neomycin）磷酸转移酶基因）磷酸转移酶基因分别来自分别来自I型和型和II型单纯疱疹病毒（型单纯疱疹病毒（HSV）。）。载体载体
85、tk1 HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2载体载体四、载体的整合方式四、载体的整合方式染色体染色体DNAHB1染色体染色体DNAHB2染色体染色体DNA载体载体tk1 HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2载体载体染色体染色体tk1 HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2染色体染色体两个两个tk基因基因至少有一个至少有一个可能整合到基因组里。可能整合到基因组里。细胞被细胞被tk基因杀死基因杀死。1. 非特异整合非特异整合非同源重组非同源重组2.2.特异位点整合特异位点整合同源重组同源重组载体载体tk1 HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2载体载体HB1 n
86、eor目的基因目的基因HB2染色体染色体DNAHB1染色体染色体DNAHB2染色体染色体DNA染色体染色体DNA染色体染色体DNA只有目的基因和只有目的基因和neor基因整合进去，基因整合进去，tk基因基因不会整合。不会整合。细胞在细胞在G418中存活中存活。五、转染细胞的选择五、转染细胞的选择正正-负选择法：负选择法：1. 正选择（正选择（positive selection）：）：用用G418进行选择。进行选择。 没有整合进没有整合进neor基因的细胞都被杀死。基因的细胞都被杀死。2. 负选择（负选择（negative selection）：）：用用9-鸟嘌呤鸟嘌呤（ganciclovir，GCV）。）。表达胸苷激酶（表达胸苷激酶（tk）的细胞都被杀死）的细胞都被杀死（Tk能把能把GCV转化成有毒的化合物转化成有毒的化合物）。）。
