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1、DEAE DEAE 纤维素梯度层析实验纤维素梯度层析实验 一一 实验原理实验原理 DEAE-DEAE-纤维素是以纤维素为母体接有二乙基氨基乙基（纤维素是以纤维素为母体接有二乙基氨基乙基（DEAEDEAE）活性基团的）活性基团的弱碱性阴离子交换剂弱碱性阴离子交换剂, ,它在离子交换层析中可用于蛋白质、核酸、激素、酶等它在离子交换层析中可用于蛋白质、核酸、激素、酶等大分子的分离与纯化。对于某些组分比较复杂或性质比较相近的蛋白质样大分子的分离与纯化。对于某些组分比较复杂或性质比较相近的蛋白质样品。在采用一般的恒溶剂系统进行离子交换柱层析时，往往不容易分离，这品。在采用一般的恒溶剂系统进行离子交换柱层
2、析时，往往不容易分离，这时可采用梯度洗提（装置见图时可采用梯度洗提（装置见图1-21-2）。即用一定的样品离子在不同的离子强度）。即用一定的样品离子在不同的离子强度（或（或pHpH）溶液中对一定的离子交换剂的平衡常数不同，在洗提过程中，通过）溶液中对一定的离子交换剂的平衡常数不同，在洗提过程中，通过不断改变洗提的离子强度不断改变洗提的离子强度pHpH不变）不变） 根据实验的具体情况，也可同时改变离子根据实验的具体情况，也可同时改变离子强度和强度和pHpH，以逐步改变样品中各组分与离子交换剂的交换能力，最后得到分，以逐步改变样品中各组分与离子交换剂的交换能力，最后得到分离，这种层析方式即称为梯度
3、洗提层析。洗提剂的梯度产生如图所示，当离，这种层析方式即称为梯度洗提层析。洗提剂的梯度产生如图所示，当A1=A2A1=A2时，产生线形梯度；当时，产生线形梯度；当A1A2A1A2时，产生凹型梯度；当时，产生凹型梯度；当A1A2A1A2时，产生凸型时，产生凸型梯度。不同的样品，应根据实验情形，选择合适的梯度洗提曲线（见附梯度。不同的样品，应根据实验情形，选择合适的梯度洗提曲线（见附1 1） 。 梯度洗脱示意图梯度洗脱示意图二二 实验目的与要求实验目的与要求 通过通过DEAE-DEAE-纤维素阴离子交换剂，采纤维素阴离子交换剂，采 用一条线型离子强度和恒定用一条线型离子强度和恒定pHpH洗提曲线，
4、洗提曲线， 对鸡蛋白蛋白（对鸡蛋白蛋白（CEACEA）粗制样品进行分级）粗制样品进行分级 分离，以了解梯度洗提的层析方法。分离，以了解梯度洗提的层析方法。三三 实验主要器材与装置实验主要器材与装置 3-13-1、实验仪器、实验仪器（1 1）、色谱工作站及装置）、色谱工作站及装置（2 2）、笔记本电脑）、笔记本电脑（3 3）、紫外检测仪）、紫外检测仪（4 4）、梯度混合仪）、梯度混合仪（5 5）、恒流泵）、恒流泵3-23-2、实验器材、实验器材（1 1）、）、 层析柱层析柱（2 2）、）、 烧烧 杯杯 （3 3）、）、 可调取液器可调取液器 （4 4）、）、 量量 筒筒（5 5）、）、 玻玻 棒
5、棒（6 6）、）、 标签纸标签纸（7 7）、）、 记号笔记号笔（8 8）、）、 洗耳球洗耳球 3-33-3、实验装置图、实验装置图 四四 试剂与配制试剂与配制 4- 1 4- 1 实验试剂实验试剂（1 1）、三羧甲基氨基甲烷（）、三羧甲基氨基甲烷（TrisTris） （2 2）、鸡蛋白蛋白（）、鸡蛋白蛋白（CEACEA） （3 3）、）、DEAE-52DEAE-52（4 4）、盐）、盐 酸酸（5 5）、氯化钠）、氯化钠4-24-2试剂配制试剂配制（1 1）、）、Buffer ABuffer A（20mM pH8.0 Tris-HCl 20mM pH8.0 Tris-HCl ）的配制：）的配制：
6、 称取称取Tris 60.7mg Tris 60.7mg ，于一烧杯中，先加少量蒸馏水溶解，于一烧杯中，先加少量蒸馏水溶解，然后用稀然后用稀 HCl HCl调至，最后加蒸馏水稀释至调至，最后加蒸馏水稀释至100100毫升，混匀即可。毫升，混匀即可。（2 2）、）、Buffer BBuffer B的配制：的配制： 取取Buffer A 50Buffer A 50毫升，加氯化钠（）克，溶解混匀即可。毫升，加氯化钠（）克，溶解混匀即可。（3 3）、）、CEACEA样液的配制：样液的配制： 20.0mg CEA+1ml Buffer A20.0mg CEA+1ml Buffer A五五 方法与步骤方法
7、与步骤 1 1 树脂的处理树脂的处理 2 2 装装 柱柱 柱柱 高高 10.0cm 10.0cm 3 3 平平 衡衡 流流 速速 0.8 ml / mi n; 30.0 min 0.8 ml / mi n; 30.0 min 4 4 上上 样样 上样体积上样体积 1.0ml 1.0ml 5 5 洗洗 涤涤 1.0ml2 1.0ml2次次; ; 再自动洗涤再自动洗涤15 min15 min 6 6 洗洗 脱脱 梯度混合仪梯度混合仪 A B A B杯杯, ,各倒入各倒入 A - BA - B溶液溶液60ml 60ml 最后一个峰已回到基线时，继续最后一个峰已回到基线时，继续洗脱洗脱1010分钟分钟 7 7 收收 集集 8 8 测测 定定思考题思考题1 1、DEAE-DEAE-纤维素最佳吸附纤维素最佳吸附PHPH范围是多少？范围是多少？2 2、DEAE-DEAE-纤维素再生最适酸、碱浓度是多少？纤维素再生最适酸、碱浓度是多少？
