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1、第二章第二章 菌种选育、保藏与复壮菌种选育、保藏与复壮l工业常用微生物及要求工业常用微生物及要求l工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育l生产菌种的改良生产菌种的改良l菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏l种子的扩大培养种子的扩大培养 第二章第二章 菌种选育、保藏与复壮菌种选育、保藏与复壮 第一节第一节 工业常用微生物及要求工业常用微生物及要求一、常见微生物一、常见微生物 （一）细菌（一）细菌（bacteriabacteria）醋酸杆菌属（醋酸杆菌属（AcetobacterAcetobacter）乳杆菌属（乳杆菌属（LactobacillusLactobacillus）芽孢杆菌属（芽
2、孢杆菌属（BacillusBacillus）短杆菌属（短杆菌属（BrevibacteriumBrevibacterium）棒杆菌属（棒杆菌属（CorynebacteriumCorynebacterium）（二）放线菌（二）放线菌（actinomycesactinomyces）最大的经济价值在于产生多种抗生素最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibioticantibiotic）链霉菌（链霉菌（StreptomycesStreptomyces）小单孢菌属（小单孢菌属（MicromonosporaMicromonospora） （三）霉菌（三）霉菌（mouldmould） 1.1.曲霉属（曲霉
3、属（AspergillusAspergillus） 黑曲霉（黑曲霉（A. nigerA. niger） 米曲霉（米曲霉（A. oryzaeA. oryzae） 黄曲霉（黄曲霉（A. flavusA. flavus） 2.2.青霉属（青霉属（PenicillumPenicillum） 桔青霉（桔青霉（P. P. citrinumcitrinum）3. 3. 根霉属（根霉属（RhizopusRhizopus ） 米根霉（米根霉（R. oryzaeR. oryzae） 华根霉（华根霉（R. chinensisR. chinensis）4. 4. 红曲霉属（红曲霉属（MonascusMonascus）
4、（四）酵母（四）酵母（yeastyeast）1.1.酵母属（酵母属（SaccharomycesSaccharomyces） 啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2. 2. 假丝酵母属（假丝酵母属（CandidaCandida） 产朊假丝酵母（产朊假丝酵母（Candida utilisCandida utilis）3. 3. 毕赤酵母属（毕赤酵母属（PichiaPichia）（五）其它微生物（五）其它微生物1.1.担子菌（担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）即菇类）即菇类（mushro
5、ommushroom）2. 2. 藻类（藻类（algaalga）几几种种菌菌落落 （六）噬菌体（六）噬菌体（phagephage） 危害以细菌和放线菌危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。为生产菌株的发酵工业。烈性噬菌体烈性噬菌体 引起寄主细胞迅速裂解。引起寄主细胞迅速裂解。 受感染的细菌称受感染的细菌称敏感性细菌敏感性细菌。温和噬菌体温和噬菌体 随寄主细胞的繁殖而繁殖。随寄主细胞的繁殖而繁殖。 含温和噬菌体的细菌称含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌溶原性细菌。 二、微生物工业对菌种的要求二、微生物工业对菌种的要求1.1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2
6、.2.易控制培养条件，发酵周期较短。易控制培养条件，发酵周期较短。3.3.抗杂菌和噬菌体的能力强。抗杂菌和噬菌体的能力强。4.4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和不易变异和退化，不产生任何有害物质和 毒素。毒素。 第二节第二节 工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育一、自然选育一、自然选育 1.1.采样采样 2.2.增殖培养增殖培养 方法：方法： （1 1）控制培养基成分）控制培养基成分 （2 2）控制培养条件）控制培养条件 （3 3）抑制不需要的菌类）抑制不需要的菌类3. 3. 纯种分离纯种分离（1 1）划线法：简单、快捷。）划线法：简单、快捷。 （2 2）稀释法：菌落单一均匀。）稀释
7、法：菌落单一均匀。是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。固体培养基四区划法接种法固体培养基四区划法接种法接种针先以火焰灭菌法灭菌接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤一轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却 步骤二以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细
8、菌。 步骤三更换一个新的无菌营养平板更换一个新的无菌营养平板 步骤四将接种针上的细菌划于一个新的营养平板将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区上。此为第一菌区 。步骤五重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六由第五步骤的第一区中划出第二由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。区，如右上图。步骤七重复第六以及第七步骤，由第七步骤的重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。第二区中划出第三区，如右上图。 步骤八重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三重复第六以及第七步骤
9、，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。的营养平板，如右上图。步骤九 在营养平板上贴好标在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及作者姓名、菌种学名以及培养基名称。培养基名称。步骤十步骤十固体培养基的稀释涂抹接种法固体培养基的稀释涂抹接种法需要使用的仪器需要使用的仪器震荡机震荡机 吸取准备好欲稀释的菌液吸取准备好欲稀释的菌液吸取充分均匀后的菌液吸取充分均匀后的菌液 取含有取含有 9mL9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做
10、记号为第一次稀释。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将将试试管管于于震震荡荡机机上上，使使菌菌液液混混合合均均匀匀 取出试管中的第一次十倍稀释菌液取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL1mL，加入另一个新的含加入另一个新的含9mL9mL无菌水的试管中。无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。 从最后稀释菌液中吸取从最后稀释菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液，置入准备好的无菌琼脂内。置入准备好的无菌琼脂内。将三角玻璃棒浸于酒精中将三角玻璃棒浸于酒精中 将三角玻璃棒在火焰上燃烧将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃
11、烧）（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧） 使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。数推算出菌液浓度。 4. 4. 生产性能的测定生产性能的测定 一般采用两步法：一般采用两步法： 初筛：以量为主初筛：以量为主 复筛：以质为主复筛：以质为主 二、诱变育种二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。因突变。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂诱变剂物理：物理
12、：紫外线紫外线，快中子，快中子化学：化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍硫酸二乙酯，亚硝基胍 诱变育种的主要环节诱变育种的主要环节（1 1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 诱变诱变（2 2）用合适的方法淘汰负效应变异株，）用合适的方法淘汰负效应变异株， 选出性能优良的正变异株选出性能优良的正变异株筛选筛选 第三节第三节 生产菌种的改良生产菌种的改良 一、原生质体融合（一、原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion） 1.1.标记菌株的筛选标记菌株的筛选 2.2.原生质体的制备原生质体的制备 3.3.原生质体的融合与再生原生质体的融合与再
13、生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脱水剂）脱水剂 助融剂助融剂 CaCa2+2+提高融合频率提高融合频率 4.4.融合子的选择融合子的选择原生质体，它是细胞进行各类原生质体，它是细胞进行各类代谢的主要场所，是细胞中重代谢的主要场所，是细胞中重要的部分。原生质体可分为质要的部分。原生质体可分为质膜、细胞器、膜、细胞器、胞基质胞基质三部分三部分 二、二、DNADNA重组技术重组技术（DNA recombination technologyDNA recombination technology）1.1.目标目标DNADNA片断的获得片断的获得2.2.与载体与载体DNADNA分子的连接分子的连接
14、3.3.重组重组DNADNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞4.4.从中选出所需重组从中选出所需重组DNADNA分子的宿主细胞分子的宿主细胞 第四节第四节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏一、菌种的衰退一、菌种的衰退 衰退的原因：衰退的原因：1.1.菌种保藏不当菌种保藏不当2.2.菌种生长条件没有得到满足菌种生长条件没有得到满足二、二、 菌种的复壮菌种的复壮 1. 1. 纯种分离纯种分离 2. 2. 通过寄主体进行复壮通过寄主体进行复壮 3. 3. 淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体三、菌种保藏三、菌种保藏 1.1.原理原理 低温、干燥、缺氧、缺营养物质低温、干燥、缺氧、缺营养物质
15、2. 2. 方法方法 （1 1）斜面保藏法）斜面保藏法 （2 2）干燥保藏法）干燥保藏法 （3 3）悬液保藏法）悬液保藏法 （4 4）冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法 （5 5）低温保藏法）低温保藏法 第五节第五节 种子的扩大培养种子的扩大培养一、微生物的培养方法一、微生物的培养方法 1.1.表面培养表面培养 2.2.固体培养固体培养 3.3.液体深层培养液体深层培养二、菌种的扩大培养二、菌种的扩大培养 菌种扩大培养的目的：菌种扩大培养的目的： 为每次发酵罐的投料提供相当数量的为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。代谢旺盛的种子。 （一）种子制备的工艺流程（一）种子制备的工艺流程 摇瓶摇
16、瓶保藏菌种保藏菌种 试管斜面活化试管斜面活化 茄瓶斜面茄瓶斜面 种子罐种子罐 固体培养基固体培养基摇瓶摇瓶种子培养种子培养发酵培养发酵培养（二）（二） 斜面菌种的培养斜面菌种的培养 1.1.不宜多次移种。不宜多次移种。 2.2.活化斜面中加活化斜面中加0.1%0.1%葡萄糖。葡萄糖。 培养基特点：原料较精细。培养基特点：原料较精细。（三）一级种子培养（摇瓶）（三）一级种子培养（摇瓶）培养基特点培养基特点： 使用的原料基本接近于发酵培养基。使用的原料基本接近于发酵培养基。（四）二级种子培养（种子罐）（四）二级种子培养（种子罐）培养基的特点培养基的特点： 和一级种子相似，其中葡萄糖用和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，水解糖代替，更接近于发酵培养基。更接近于发酵培养基。 大量地接入培养成熟菌种的优点：大量地接入培养成熟菌种的优点： 1.1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵 周期，提高了设备利用率。周期，提高了设备利用率。 2.2.节约了发酵培养的动力消耗。节约了发酵培养的动力消耗。 3.3.并有利于减少染菌机会。并有利于减少染菌机会。
