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1、第八章基因工程下游技术一、概述一、概述生物技术是利用生物的某些功能或潜能进行有效益的生产的工程技术。利用大肠杆菌、酵母等生产哺乳动物的蛋白及重要药物等都是应用生物技术的例子。目前，世界上用生物技术生产的药物及生物制品逾数千种，年产值达数百亿美元。生物技术产品中如抗生素、人生长激素、人干扰素、乙型肝炎疫苗等在我国均已投产。 生物技术通常分成发酵工程、细胞工程、酶工程、基因工程基因工程和蛋白质工程等。生物技术以生命科学为基础，以基因工程为核心以基因工程为核心，将多种基础科学联合并使之产业化。 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它利用人工
2、方法从某一种生物中取得特定的DNA片段，称目的基因目的基因。将目的基因通过基因载体运送到受体宿主活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆克隆”）和行使正常功能（称之为“表达表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适
3、当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 生物技术工业经过多年努力，创造了35种重要治疗药物，年销售额已超过70亿美元。全球已有生物技术制药公司2 000多家，其中美国有1 300家，欧洲有700家。1997年美国的生物技术研究与开发费用为76亿美元、欧洲为18亿美元。目前主要生物技术公司多分布在美国，如Amgen、Genetics institute、Genzyme、Genentech和Chiron，还有Biogen也发展较快。经上市的生物技术药物主要含3大类，即重组治疗蛋白质、重组疫苗和诊断或治疗用的单克隆抗体。 我国基因工程药物产业化的品种从无到有，已发展有10多种，它
4、们是rHUIFNlb、 rHUIFN2a、 rHUIFN2b、rHUIFN、重组乙肝疫苗等。二、基因工程产品的生产过程二、基因工程产品的生产过程原始材料原始材料上游过程上游过程发酵或生物转化发酵或生物转化下游过程下游过程产品应用产品应用原始材料原始材料 菌种、载体、工具酶、培养基等上游过程上游过程 对菌种加以改造，提高生产能力或者导入外源基因等以获得工程菌，基因工程是方法之一。发酵或生物转化发酵或生物转化 通过优化发酵条件如温度、营养、供气量等进行发酵或大规模培养，利用工程菌的生物合成、加工和修饰等获得目的产物。 储备菌种种子罐培养作为发酵的菌种发酵（涉及发酵罐、培养基优化、发酵条件优化等）。
5、 动植物的细胞培养：悬浮培养、固体培养；自动化控制。利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。就其选用的生物材料而言,前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;从发酵工艺考虑,生物工程菌的发酵生产目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的表达。外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关,因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。工程菌高密度发酵工程菌高密度发酵实现高密度培养是近几年来发酵工业的重
6、要目标与方向之一,是工程菌能否以尽可能低的成本实现规模生产的关键因素之一。高细胞密度培养可以提高目标产物的浓度,利于提取与纯化,在同样的生产量下可缩小反应器的体积。 1宿主菌的选择1.1重组菌的稳定性1.2启动子的选择与诱导 2 培养条件的选择 营养物质、溶氧 、温度 、 pH 3培养方式 分批、连续和补料分批培养下游过程下游过程 指从发酵液中分离和纯化产品的技术过程，包括固液分离技术（离心、过滤、沉淀等）、细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等）、蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等），最后还有产品的包装处理技术（真空干燥、冰冻干燥等），是运用生物化学、物理学方法
7、分离、纯化产品，最终将产品推向市场并获得社会或经济效益的过程。三、下游过程三、下游过程基因工程产业化除上游构建工程菌之外,下游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天然结构使之具有生物活性、表达产物的修饰加工等。就基因工程产业化而言,下游技术的研究与建立是十分重要的,又是十分耗时的,需要远比上游研究多得多的投资。（1）菌体的处理。微生物或动植物细胞培养的产品是细胞或培养液，均应将它们分开，分别处理。发酵过程除增殖大量菌体外还有许多残渣混在发酵液中，可通过适当加热，调整酸碱度或添加絮凝剂，使菌体与发酵液分离。悬浮液中的菌体通过过滤或离心法将之分开。除加助
8、滤剂外可用真空过滤以提高效率。离心法常用自动间歇排渣离心机或喷射型离心机。菌体分离后要经灭活处理并将菌体破碎。物理破碎可用研磨法或挤压法制成匀浆，超声波振荡法使介质引起空化而产生冲击波。酶处理可以专一地催化细胞壁水解，裸露的原生质体在低渗条件下进一步破裂而释放出细胞内含物。（2）胞外产物上清液的处理。除去菌体后的上清液可通过加热或调整pH以除去杂质蛋白，如絮凝剂萃取法分离青霉素G；用等电点法将谷氨酸(味精)沉淀；一些酶制剂可用一定浓度的硫酸铵盐析析出。色谱分离法采用不同的树脂及溶剂系统，根据产物在该系统中不同的分配而被吸附或凝聚而得以分离。其中亲和色谱法用于酶或蛋白的分离和精制效果良好。（3）
9、最后纯化产品经分装冻干，包装后即为成品。与传统方式相似,重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异,在进行任何一种蛋白质纯化工艺设计之前,都需要尽可能多地先对提纯的体系,目标蛋白和杂质的性质进行了解。如目标蛋白质的相对分子质量、等电点、疏水性、带电性、碳氢链或自由巯基存在情况等。另外还需对影响目标蛋白活性的因素有了解,如温度、H、有机溶剂、蛋白变性剂、重金属离子、机械剪切力等,以保证纯化后的蛋白活性。当前蛋白质的纯化主要是依靠层析（色谱技术）和电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在,因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出
10、来,而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序,以获得较高纯度的制品。 1. 1.粗分离粗分离1.11.1破碎细胞破碎细胞大肠杆菌：冻融、超声、溶菌酶动物，植物细胞：匀浆、研磨1.21.2抽提抽提1.pH：选择合适pH的缓冲液如Tris、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐缓冲体系等，保证待分离蛋白在此pH条件下稳定。一般缓冲液浓度为20-50 mM。2.温度：低温如4-10，蛋白酶活性较低。3.离子强度：如0.1-0.2 M NaCl或KCl.4.其他成分：还原剂如NaHSO4、维生素C；巯基保护剂DTT、巯基乙醇；金属螯合剂EDTA、EGTA；蛋白酶抑制剂PMSF等。1.
11、31.3初步分离初步分离 1.分离细胞器：离心、超离心 2.除核酸：酶法DNase、RNase；超声 3.除脂肪：丙酮、脂肪酶1.41.4粗分蛋白粗分蛋白 1.盐析：NaCl、(NH4)2SO4沉淀 2.有机溶剂抽提：甲醇、乙醇、丙酮 3.等电点沉淀：除去杂蛋白 4.热变性：除去杂蛋白1.51.5除盐除盐 1.超滤 2.凝胶过滤 3.冻干 处理介质处理介质装柱装柱平衡平衡上样上样洗涤洗涤洗脱洗脱介质再生介质再生 2. 2.细分离细分离-层析法、色谱法层析法、色谱法一般步骤：2.12.1凝胶过滤：将蛋白质按照分子量的大小分开凝胶过滤：将蛋白质按照分子量的大小分开原理原理 以分子大小和形状为分离基
12、础的。具体说就是利用不同大小分子通过凝胶滞留时间的差别来分离混合物的柱层析方法。另外一种说法是分离是以分子体积的大小为基础的,分子体积即分子溶剂化后的体积,受分子形状和相对分子质量两方面因素的影响。有时加入变性剂(尿素、盐酸胍等)以破坏蛋白质的三、四级结构,使分离主要受控于相对分子质量的大小。介质：介质： (1) Sephadex: (交联葡聚糖) G25, G50, G75, G100 Bio-gel: (聚丙烯酰胺) P-6，P-30，P-60，P-100 Sepharose: (琼脂糖) 2B, 4B, 6B (2) Sephacryl（葡聚糖-聚丙烯酰胺) : S100, S200,
13、S300 (3) Sepharose、Superose: HPLC (4) superdex (琼脂糖-葡聚糖) : HPLC2.22.2离子交换层析离子交换层析原理：原理：根据蛋白质等电点的差异将不同蛋白质分开。离子交换介质：离子交换介质： (1)离子交换树脂 (2)纤维素类：DEAE-、CM- (3)葡聚糖类Sephadex：Sephadex C-25、Sephadex C-50 (4)琼脂糖类Sepharose ：分辨率较高 (5)Mono Beads类: HPLC 阳离子：强酸型S-、SM-、SE、SP-;弱酸型C-、CM- 阴离子：强碱型TEAE-、QAE-、SE、SP-;中等碱型：
14、DEAE- 螯合型：BA、CAI-、A、SAHP离子交换层析离子交换层析是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同,用不同的pH/离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换离子交换又分为阴离子交换和阳离子交换。洗脱方式：洗脱方式：阳离子交换主要是改变pH,它主要应用于等电点大于5的蛋白质;而阴离子交换主要是改变盐浓度,适用于大部分蛋白质。离子交换层析离子交换层析处理量大,附载系数高,一步缩小样品体积很多。其去除杂质能力强,如对热原质、核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白及电荷性有差别的蛋白均可去除。离子交换层析
15、离子交换层析的洗脱一般分3种:同步洗脱、分步洗脱 、梯度洗脱。2.32.3亲和层析亲和层析原理：原理：利用蛋白质特异性进行分离。利用蛋白质特异性进行分离。介质准备：介质准备： 载体选择载体选择：Sepharose 4BSepharose 4B、Sepharose CL 4BSepharose CL 4B、Sepharose Fast Sepharose Fast FlowFlow、Sepharose High PerformanceSepharose High Performance 空间臂空间臂：偶联小分子时需要空间臂，常为双功能基团，如己二氨或偶联小分子时需要空间臂，常为双功能基团，如己二
16、氨或氨基己酸。氨基己酸。 配基选择配基选择：抗原抗原抗体、酶抗体、酶抑制剂、酶抑制剂、酶底物、激素底物、激素受体、金受体、金属结合蛋白属结合蛋白螯和剂、含巯基蛋白螯和剂、含巯基蛋白HgHg或含巯基分子凝或含巯基分子凝集素集素糖蛋白糖蛋白 偶联偶联：I I 溴化氰法：与溴化氰法：与氨基或氨基或氨基偶联。氨基偶联。 效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。 IIII环氧氯丙烷法：与环氧氯丙烷法：与NHNH2 2 、OHOH、SH SH 偶联偶联 偶联时需强烈条件，如偶联时需强烈条件，如pH11pH11，5050，适于特别稳定的蛋白，适于特别稳定的蛋白
17、亲和层析亲和层析是以蛋白质特殊结构为分离基础的。具体说就是利用蛋白质和介质特殊的生物亲和性或专一性和其他蛋白质分离的柱层析方法。如酶-底物或抑制物,抗原-抗体。亲和层析亲和层析的三个基本条件是: 偶联凝胶:起支架作用； 配体:在支持物和分离物间起联接作用,和分离物特异的亲和吸附具有专一性,并且是可逆的。 间臂:由于生物大分子空间位阻作用,需加一间臂,长度很重要,太短不起作用,太长增加非特异性吸附,降低亲和作用效率, 亲和层析亲和层析具有分离纯化目标单一,回收率很高的特点。从理论上来讲,其得到的是相当纯的物质,这种分离能力是其他任何柱层析都难以相比的,但由于亲和层析柱制作工艺复杂,同时在色谱洗脱
18、过程中配体不可避免的脱落,不但柱子的使用寿命有限,而且产品必须经特别处理才可注射或服用,因此成本比较昂贵,一般不放在纯化工艺的前面。2.42.4金属螯合层析金属螯合层析原理：原理：根据蛋白质中组氨酸等氨基酸残基和介质中特殊金属离子进行金属螯合作用,形成络合物以分离蛋白质。洗脱方式：洗脱方式：pH梯度洗脱、竞争配体洗脱、有机溶剂洗脱、螯合剂洗脱。金属螯合层析纯化蛋白质时,金属与蛋白质表面暴露的氨基酸残基作用，在分离相应的蛋白质时分离率和回收率也较高,它一般放在纯化工艺的中后期。某些蛋白质、氨基酸和一些金属离子的特异亲和力举例如下: Cu2+与含氮化合物、单核苷酸、人乳铁白; Ni+与含酪氨酸、色
19、氨酸的蛋白质或多肽; Zn2+ 与含组氨酸、半胱氨酸的蛋白质或多肽。液相层析技术是目前蛋白质分离中最常用的技术之一,在基因工程产品下游处理中占有主要的地位。比较典型的系统和介质 Amersham pharmacia biotech蛋白液相层析系统(FPLC) AKTA系统高效液相色谱2.52.5液相层析技术液相层析技术2.62.6其它下游分离技术其它下游分离技术细胞破碎的常用方法细胞破碎的常用方法 高压匀浆法 高速珠磨法 超声破碎 化学渗透（如EDTA、甲苯、Triton X-100、盐酸胍、Urea) 酶溶法蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定（1 1）浓度鉴定）浓度鉴定 紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在
20、蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 280nm 有吸收。有吸收。 Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，还原磷钼酸蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。磷钨酸试剂产生蓝色。 Bradford法：依据蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量测定。依据蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量测定。 凯氏定氮法 双缩脲法（2 2）纯度鉴定）纯度鉴定 电泳法：SDSSDSPAGEPAGE、IEFIEF 化学法：N N端测定、端测定、C C端测定端测定 仪器法：HPLCHPLC、质谱、氨基酸组成分析、质谱、氨基酸组成分析（3 3）分子量测定）分子量测定 SDSPAGE 凝胶过滤 氨基酸组成
21、分析 毛细管电泳（4 4）等电点测定）等电点测定 等电聚焦电泳（5 5）活性测定）活性测定 激酶：标记ATP 磷酸化酶：定磷 ELISA固液分离：离心沉降利用固体和液体之间的密度差膜分离技术：微孔膜过滤、超滤、反渗透、透析、电渗透冻干其他技术其他技术重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达,其表达形式一般可分为: (1)细胞外的分泌表达; (2)细胞内可溶性表达; (3)细胞内不溶性表达,即产物以包涵体的形式存在。因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同,采取不同的纯化工艺。例如,当重组蛋白以包涵体形式存在时,就需要对包涵体进行变性-复性处理。四、基因工程产品
22、的表达形式四、基因工程产品的表达形式1.1.细胞质表达细胞质表达很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素-6、人-干扰素等，不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.13.0m的固体颗粒包涵体包涵体。这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，而其立体结构是错误的，所以没有生物活性。因此，为获得天然状态的目标产物，必须在分离回收包涵体后，溶解包涵体并设法使其中的目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性。 包涵体的形成：原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达所形成的致密的不溶性颗粒。包涵体的形成与过表达蛋白的内在性质（如分子
23、量、折叠途径等）无直接关系。因为大肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，所以含有较多二硫键的蛋白较容易错误折叠形成包涵体。相比之下，周质空间有利于二硫键的形成，但是包涵体的形成也会发生。包含体的产生有利有弊。包涵体的性质：致密（几乎全部是过表达蛋白，杂质主要是细菌外膜蛋白，离心时一起沉降）；通常对蛋白酶降解不敏感（发酵升温至42可促进包涵体形成并进一步抑制蛋白酶）。 分离包涵体并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从破碎细胞开始，然后将细胞匀浆离心，回收包涵体后，加入变性剂溶解包涵体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。包涵体的分离、溶解和复性包涵体的分离、溶解和复性溶菌酶
24、处理溶菌酶处理高压匀浆（细胞破碎效率较重要）高压匀浆（细胞破碎效率较重要） 离心（固离心（固-液相分离）液相分离）去污剂或去污剂或/和低浓度尿素或盐酸胍洗涤，去可溶性蛋白和和低浓度尿素或盐酸胍洗涤，去可溶性蛋白和膜蛋白膜蛋白高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体，可添加高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体，可添加DTT打开二硫键打开二硫键逐步透析或稀释去除变性剂逐步透析或稀释去除变性剂2 2细胞外周质表达细胞外周质表达在细胞外周质进行蛋白质表达有许多优越之处。（1）在外周质只有4%的总细胞蛋白，这显然有利于目的蛋白的纯化（2）外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在转移到外周质的过程中，信号肽在细胞内剪切更有
25、可能产生目的蛋白的天然N-末端。（3）此外，外周质中的蛋白质降解也少得多。但是，蛋白质转运到细菌外周质是一个特别复杂和尚未完全明了的过程，信号肽的存在并不总能保证蛋白质有效地通过内膜。 3. 3. 细胞外分泌表达细胞外分泌表达 将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的降解。 4. 4. 融合蛋白表达融合蛋白表达在E.coli中表达外源蛋白，尤其是真核蛋白时，蛋白质的稳定性是经常遇到的问题。最近几年，众多巧妙的蛋白质融合系统的发展，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。融合表达具有多方面的优点：融合表达具有多方面的优点
26、：防止包涵体的形成促进蛋白质的正确折叠限制蛋白酶解和利于纯化 融合表达体系融合表达体系谷胱甘肽S转移酶（GST）麦芽糖结合蛋白（MBP）硫氧还蛋白（Trx）融合蛋白中目的蛋白的回收融合蛋白中目的蛋白的回收位点特异性裂解的方法：溴化氰(Met)、 羟胺(AsnGly)等试剂或低pH(AspPro)来进行融合蛋白的化学裂解。酶解：反应条件较温和，所用蛋白酶具有高度的特异性，如凝血酶、肠激酶、凝乳酶和胶原酶等。所有这些酶都具有较长的底物识别序列，从而降低了蛋白质中其他无关部位发生断裂的可能性。五、实例：粒细胞五、实例：粒细胞巨噬细胞集落刺激巨噬细胞集落刺激因子因子(GM-CSF)下游生产工艺流程下游
27、生产工艺流程菌种划板及扩菌菌种划板及扩菌75L发酵罐扩菌诱导发酵罐扩菌诱导,流加补料流加补料离心收集菌体离心收集菌体 高压匀浆破菌，洗涤提取包涵体高压匀浆破菌，洗涤提取包涵体溶解包涵体，溶解包涵体，Sephacryl S-200分子筛柱层析分子筛柱层析复性复性超滤浓缩，超滤浓缩，Q Sepharose Fast Flow离子交换柱层析离子交换柱层析Superdex 75 Prep Grade分子筛柱层析分子筛柱层析分装、冻干分装、冻干六、外源基因表达产物的质量检测六、外源基因表达产物的质量检测六、外源基因表达产物的质量检测六、外源基因表达产物的质量检测 工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控
28、制才能成工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制指标包括：为产品。重组蛋白的质量控制指标包括：重组蛋白的鉴别（序列）重组蛋白的鉴别（序列）重组蛋白的鉴别（序列）重组蛋白的鉴别（序列）重组蛋白的纯度（杂质的类型）重组蛋白的纯度（杂质的类型）重组蛋白的纯度（杂质的类型）重组蛋白的纯度（杂质的类型）重组蛋白的活性（检测方法）重组蛋白的活性（检测方法）重组蛋白的活性（检测方法）重组蛋白的活性（检测方法）重组蛋白的安全性重组蛋白的安全性重组蛋白的安全性重组蛋白的安全性重组蛋白的稳定性重组蛋白的稳定性重组蛋白的稳定性重组蛋白的稳定性重组蛋白的一致性（构象与构型）重组蛋白的
29、一致性（构象与构型）重组蛋白的一致性（构象与构型）重组蛋白的一致性（构象与构型）重组蛋白产物的质量检测项目与方法重组蛋白产物的质量检测项目与方法检测项目检测项目检测方法检测方法产品是否含内毒素产品是否含内毒素家兔热原法家兔热原法蛋白质是否变异蛋白质是否变异肽谱、肽谱、HPLCHPLC、等电聚焦、毛细管电泳等电聚焦、毛细管电泳甲硫氨酸是否被甲酰化甲硫氨酸是否被甲酰化肽谱、质谱、肽谱、质谱、HPLCHPLC、EdmanEdman分析分析蛋白质是否变性、聚合、脱氨基蛋白质是否变性、聚合、脱氨基SDS-PAGESDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质凝胶层析、等电聚焦、质配体是否脱落配体是否脱落SDS-PAGESDS-PAGE、免疫分析免疫分析氨基酸是否发生取代氨基酸是否发生取代氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳产品是否被细菌、病毒、支原体等污染产品是否被细菌、病毒、支原体等污染微生物学检测微生物学检测谱、谱、HPLCHPLC、毛细管电泳、毛细管电泳、EdmanEdman分析分析
