《模块七典型产》PPT课件

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1、模块七模块七 典型产品典型产品基因工程制药基因工程制药概概 况况基因工程产品约有基因工程产品约有2/3用于人类疾病治疗和预防性用药，用于人类疾病治疗和预防性用药，它给制药工业带来了革命性的变化。它给制药工业带来了革命性的变化。据估计，人用蛋白药物的全球市场，每年可达据估计，人用蛋白药物的全球市场，每年可达200亿美元，亿美元，在这种巨大利益驱使下，世界各大制药公司在这种巨大利益驱使下，世界各大制药公司相继投入巨资用于这些重组蛋白药物的研究开发。相继投入巨资用于这些重组蛋白药物的研究开发。l基因工程产品生产流程基因工程产品生产流程工程菌选择工程菌选择设计发酵反应器设计发酵反应器选择培养方式选择培

2、养方式确定发酵培养基组分确定发酵培养基组分工艺优化与参数监控工艺优化与参数监控计算机的应用计算机的应用生物催化剂的使用生物催化剂的使用产品分离、纯化产品分离、纯化基因工程药物的质控基因工程药物的质控工程菌选工程菌选择择能用一般基因重组技术获得；能用一般基因重组技术获得；有高产潜力；有高产潜力；能以工业原料（碳源）为培养基；能以工业原料（碳源）为培养基；生产工艺能用一般工业生产经验；生产工艺能用一般工业生产经验；能产生、分泌蛋白质；能产生、分泌蛋白质；不致病、无毒性；不致病、无毒性；生产安全，符合国家卫生部门规定；生产安全，符合国家卫生部门规定；代谢能控制；代谢能控制；产品有特异性；产品有特异性

3、；发酵液黏度小；发酵液黏度小；u甲醇营养型巴斯德毕赤酵母表达系统甲醇营养型巴斯德毕赤酵母表达系统l具有甲醇精确诱导调控的醇氧化酶（具有甲醇精确诱导调控的醇氧化酶（AOXAOX）启动子）启动子PAOXPAOX；u以甲醇作为唯一碳源和能源是其主要特征；以甲醇作为唯一碳源和能源是其主要特征；三个阶段非常明显：生长期（不流加）三个阶段非常明显：生长期（不流加） 、分批、分批- -补料培养、补料培养、 诱导表达。诱导表达。p表达产物的糖基化（糖蛋白，修饰加工，对重组蛋白的稳表达产物的糖基化（糖蛋白，修饰加工，对重组蛋白的稳 定性定性，免疫原性免疫原性，生物活性均有影响）生物活性均有影响） ；有有50%7

4、0%的把握在毕赤酵母系统表达绝大部分蛋白，的把握在毕赤酵母系统表达绝大部分蛋白， 且达到相当水平，其中大部分可成为医药制品。且达到相当水平，其中大部分可成为医药制品。选择培养方式选择培养方式（1 1）补料分批培养：注意溶氧、流加补料；）补料分批培养：注意溶氧、流加补料；（2）连续培养：两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、稀释率、）连续培养：两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。通过去除培养液中的

5、代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性。）固定化培养：维持质粒稳定性。与基因工程菌培养有关的几个问题与基因工程菌培养有关的几个问题一一 、基因工程菌生长代谢的特点、基因工程菌生长代谢的特点（1 1）菌体生长速率反映蛋白质的合成速度；）菌体生长速率反映蛋白质的合成速度；（2）控制菌体生长可提高质粒稳定性，减少代谢副产物的积累）控制菌体生长可提高质粒稳定性，减少代谢副产物的积累 和提高外源性蛋白产率；和提高外源性蛋白产率；（3）能量的供应决定菌体的最大比生长速率；）能量的供应决定菌体的最大比生长速率；（4）小分子前体和催化组分的限制决定菌体的最大比生长速率。）小分子前体

6、和催化组分的限制决定菌体的最大比生长速率。二、菌体生长与能量（碳源）的关系二、菌体生长与能量（碳源）的关系（1）菌体生长最大比生长速率由呼吸控制；）菌体生长最大比生长速率由呼吸控制；（2）菌体生长所需能量大于有氧代谢所能提供的能量时，代谢副产物乙酸）菌体生长所需能量大于有氧代谢所能提供的能量时，代谢副产物乙酸 能抑制菌体的生长，尤其在高密度培养时；能抑制菌体的生长，尤其在高密度培养时；（3）分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中）分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中 控制稀释速率等；控制稀释速率等；通过降低供能速度和前体供应速度来控制菌体的糖酵解速

7、度，使之低于通过降低供能速度和前体供应速度来控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，避免三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，避免乙酰辅酶乙酰辅酶A A的积累，的积累，减少乙减少乙酸产生和抑制；酸产生和抑制；在一定范围能控制菌体生长，实现高密度培养和提高产物的表达水平。在一定范围能控制菌体生长，实现高密度培养和提高产物的表达水平。三、高密度细胞培养策略三、高密度细胞培养策略（1）使用最低合成培养基；）使用最低合成培养基；（2）控制比生长速率）控制比生长速率 减少乙酸和乙醇等抑制性产物的积累，减少乙酸和乙醇等抑制性产物的积累， 使碳源能更多地用于异源蛋白的表达使碳源能更多地用

8、于异源蛋白的表达；对分批对分批-补料培养补料培养， 控制补料流速控制补料流速；对连续培养对连续培养，则控制稀释率则控制稀释率D；（3）用碳源做限制性基质）用碳源做限制性基质 。四、菌体生长与前体的关系四、菌体生长与前体的关系（1）培养基中加入）培养基中加入氨基酸氨基酸能提高菌体比生长速率，使蛋白合成能提高菌体比生长速率，使蛋白合成 增加。增加。（2）由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞）由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞 竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足；竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足；（3）在中等拷贝质粒

9、（）在中等拷贝质粒（56）工程菌中，外源基因的复制、转录、翻译引起）工程菌中，外源基因的复制、转录、翻译引起 菌体内前体浓度的降低，可诱导与前体合成有关的酶相对水平增加（与菌体内前体浓度的降低，可诱导与前体合成有关的酶相对水平增加（与 宿主细胞比）。宿主细胞比）。（4）在高拷贝质粒（）在高拷贝质粒（240）工程菌中，前体大量被利用而引起不足，产生）工程菌中，前体大量被利用而引起不足，产生 “严紧反应严紧反应”（ppGpp），核糖体及有关酶水平比宿主细胞低。），核糖体及有关酶水平比宿主细胞低。同样的培养基，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，同样的培养基，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，

10、特别是工程菌诱导基因表达后，由于外源基因的大量表达，特别是工程菌诱导基因表达后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。基因工程药物的基因工程药物的产品产品分离、纯化分离、纯化（1）目的产物在初始物料中含量较低；）目的产物在初始物料中含量较低；（2）含目的产物的初始物料组成复杂；）含目的产物的初始物料组成复杂；（3）目的产物的稳定性差，易失活）目的产物的稳定性差，易失活/变性；变性；（4）生物活性物质种类繁多；）生物活性物质种类繁多；（5）应用面广，对质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等；）应用面广，对质量、纯度要求高，甚至要求无

11、菌、无热原等；u 因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。技术产品的分离纯化工艺。分离纯化的基本过程分离纯化的基本过程分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过45个个步骤，包括步骤，包括:细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离浓缩与初步纯化浓缩与初步纯化高度纯化直至得到纯品高度纯化直至得到纯品成品加工成品加工发发酵酵液液细细胞胞分分离离胞胞内内产产物物胞胞外外产产物物细细胞胞破破碎碎固固液液分分离离细胞分离碎片细胞分离

12、碎片包包含含体体变变性性复复性性浓浓缩缩初初步步分分离离高高度度纯纯化化制制剂剂产产品品基因工程药物的质基因工程药物的质控控原材料的质量控制原材料的质量控制原材料的质量控制是要确保编码药品的原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。目的基因、表达载体、宿主细胞目的基因、表达载体、宿主细胞培养过程的质量控制培养过程的质量控制（4）始终能排除外源微生物污染。）始终能排除外源微生物污染。（1 1）在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆

13、纯而稳定；）在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；（2 2）在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；）在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；（3 3）在重复发酵中，工程菌表达稳定；）在重复发酵中，工程菌表达稳定；纯化工艺过程的质量控制纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；外源性蛋白质、外源性蛋白质、 DNADNA与热原都控制在规定限度下。与热原都控制在规定限度下。 目标产品的质量控制目标产品的质量控制（1）产品鉴别）产品鉴别 肽图分析：肽图分析是用酶法或

14、化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进 行分离分析。行分离分析。 肽图分析结果与氨基酸成分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。肽图分析结果与氨基酸成分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。 氨基酸成分分析：对目的产物的纯度仍可以提供重要信息。氨基酸成分分析：对目的产物的纯度仍可以提供重要信息。 部分氨基酸序列分析：可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。部分氨基酸序列分析：可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。（2）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定 浓度测定方法主要有：凯氏定氮法

15、、双缩脲法、染料结合比色法、福林浓度测定方法主要有：凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林 酚法和紫外光谱法等。酚法和紫外光谱法等。 相对分子质量测定最常用的方法有：凝胶过滤法和相对分子质量测定最常用的方法有：凝胶过滤法和SDSPAGE法。法。凝胶过滤法是测定完整的蛋白质相对分子质量；凝胶过滤法是测定完整的蛋白质相对分子质量；蛋白质亚基的相对分子质量测定采用蛋白质亚基的相对分子质量测定采用 SDSPAGE法。法。（3 3）纯度分析）纯度分析纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，包括：目的蛋白质含量纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，包括：目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的

16、内容。测定和杂质限量分析两个方面的内容。目的蛋白质含量测定：还原性及非还原性目的蛋白质含量测定：还原性及非还原性SDSPAGE法、等电点聚焦、法、等电点聚焦、 各种各种 HLPC、毛细管电泳（、毛细管电泳（CE）等。）等。 杂质：蛋白质、非蛋白质。杂质：蛋白质、非蛋白质。A 蛋白类杂质：蛋白类杂质： 主要的是纯化过程中残余的宿主细蛋白。主要的是纯化过程中残余的宿主细蛋白。它的测定基本上是采用免疫分析的方法，其灵敏度可达百万分之一。同时它的测定基本上是采用免疫分析的方法，其灵敏度可达百万分之一。同时需辅以电泳等其他检测手段对其加以补充和验证。需辅以电泳等其他检测手段对其加以补充和验证。B 非蛋白

17、质类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原、热原质、内毒素、非蛋白质类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原、热原质、内毒素、致敏原及致敏原及DNA。（4 4）生物活性测定）生物活性测定 需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。（5 5）稳定性考察）稳定性考察（6）产品一致性保证）产品一致性保证产品保存的质量控制产品保存的质量控制l 液态：低温、稳定液态：低温、稳定pH、高浓度、加保护剂；、高浓度、加保护剂；l 固态固态p具体产品介绍具体产品介绍 人胰岛素人胰岛素(Insulin)(Insulin)： 国外人胰岛素的基因工程生产一般采

18、用两种方式：国外人胰岛素的基因工程生产一般采用两种方式：（1）分别在大肠杆菌中合成）分别在大肠杆菌中合成A链和链和B链，再在体外用化学方法连接两条链，再在体外用化学方法连接两条 肽链组成胰岛素。肽链组成胰岛素。 （2）另一种方法是用分泌性载体表达胰岛素原。如丹麦）另一种方法是用分泌性载体表达胰岛素原。如丹麦Novo用重组酵母用重组酵母 分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。人生长激素（人生长激素（Human growth hormone，hGH） 人生长激素是人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一

19、种非糖基化多肽激素。它有多种生物功能，主要是刺激身体生长。它有多种生物功能，主要是刺激身体生长。 瑞典瑞典Kabivitrum公司和美国公司和美国Genentech公司采用重组大肠杆菌共同公司采用重组大肠杆菌共同 投资研究开发了投资研究开发了重组重组hGH，商品名为，商品名为Protropin。 干扰素（干扰素（InterferonInterferon，IFNIFN）干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。和蛋白质的合成。

20、干扰素是一种类似多肽激素的细胞功能调节物质，是干扰素是一种类似多肽激素的细胞功能调节物质，是种细胞素。可采用种细胞素。可采用重组大肠杆菌生产。重组大肠杆菌生产。抗生素抗生素概况概况p 根据抗生素的化学结构分类根据抗生素的化学结构分类化学结构决定抗生素的理化性质、作用机制和疗效。化学结构决定抗生素的理化性质、作用机制和疗效。（1）-内酰胺类；内酰胺类；（2）氨基糖苷类；）氨基糖苷类；（3）大环内酯类；）大环内酯类；（4）四环类；）四环类；（5）多肽类。）多肽类。p 根据抗生素的生物合成途径分类根据抗生素的生物合成途径分类（1） 氨基酸肽类衍生物；氨基酸肽类衍生物；（2）糖类衍生物；）糖类衍生物；

21、（3）以乙酸、丙酸为单位的衍生物。）以乙酸、丙酸为单位的衍生物。据统计据统计，至至2000年年，全球抗生素年总产值达全球抗生素年总产值达250多亿美元，多亿美元，其中头孢菌素类最多，约为其中头孢菌素类最多，约为150亿美元；青霉素亿美元；青霉素55亿美元；亿美元；其余其余50亿美元。亿美元。p具体产品介绍具体产品介绍 青霉素和头孢菌素青霉素和头孢菌素C C青霉素和头孢菌素青霉素和头孢菌素C都属于都属于-内酰胺类抗生素，特别是内酰胺类抗生素，特别是头孢菌头孢菌素素C C是近年来国内外发展最迅速、新品种最多的一类抗生素。是近年来国内外发展最迅速、新品种最多的一类抗生素。生物合成机制生物合成机制头孢

22、菌素头孢菌素C和青霉素结构非常近似，见下图。和青霉素结构非常近似，见下图。异青霉素异青霉素 N N 的形成的形成p青霉素的合成青霉素的合成青霉素是含有青霉素母核（青霉素是含有青霉素母核（6 6APAAPA）的一类化合物的总称。）的一类化合物的总称。青霉素分子由两部分组成；一部分是酰基侧链；另一部分是母核。青霉素分子由两部分组成；一部分是酰基侧链；另一部分是母核。不同类型的青霉素的不同类型的青霉素的内酰胺环基上连接的侧链不同，抗菌能力也有内酰胺环基上连接的侧链不同，抗菌能力也有差异。侧链是由差异。侧链是由氨基己二酸构成的。氨基己二酸构成的。母核由母核由内酰胺环（内酰胺环（B B环）和噻唑环（环）

23、和噻唑环（A A环）组成，称为环）组成，称为6 6氨基青霉氨基青霉烷酸。其前体物质是烷酸。其前体物质是 L L半胱氨酸和半胱氨酸和 L L缬氨酸。缬氨酸。 1 1、前体、二肽及三肽的合成、前体、二肽及三肽的合成缬氨酸、半胱氨酸和缬氨酸、半胱氨酸和氨基己二酸的合成：以葡萄糖为原料，经氨基己二酸的合成：以葡萄糖为原料，经EMP途径途径产生丙酮酸。产生丙酮酸。两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶催化下，转变成乙酰乳酸，再经异构、两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶催化下，转变成乙酰乳酸，再经异构、 还原和转氨等反应，形成还原和转氨等反应，形成 L缬氨酸。缬氨酸。丙酮酸进入丙酮酸进入TCA循环，产生异柠檬酸，在异柠檬

24、酸裂解酶催化下产生循环，产生异柠檬酸，在异柠檬酸裂解酶催化下产生 乙醛酸，再经还原、氨基化、巯基化反应最后形成乙醛酸，再经还原、氨基化、巯基化反应最后形成 L半胱氨酸。半胱氨酸。氨基己二酸是由氨基己二酸是由酮戊二酸与乙酰酮戊二酸与乙酰CoA的二碳单位缩合生成高的二碳单位缩合生成高 柠檬酸，再经脱羧、氨基化反应最后生成柠檬酸，再经脱羧、氨基化反应最后生成 L氨基己二酸。氨基己二酸。L氨基己二酸首先与氨基己二酸首先与L半胱氨酸缩合形成二肽，然后半胱氨酸缩合形成二肽，然后L缬氨酸缬氨酸 的氨基与的氨基与L半胱氨酸的羧基缩合形成三肽。半胱氨酸的羧基缩合形成三肽。 L缬氨酸在形成三肽的缬氨酸在形成三肽的

25、 过程中，改变构型成过程中，改变构型成D型。型。 2、 内酰胺环的形成内酰胺环的形成在环化酶的催化下，三肽中的酰胺在环化酶的催化下，三肽中的酰胺N原子与原子与S原子相邻的原子相邻的C原子连接原子连接 进行环化，形成进行环化，形成内酰胺环。内酰胺环。 3、 噻唑环的形成噻唑环的形成噻唑环的形成过程还不甚清楚，过去认为是由缬氨酸上的噻唑环的形成过程还不甚清楚，过去认为是由缬氨酸上的, ,碳原子碳原子 脱氢形成双键，然后与脱氢形成双键，然后与半胱氨酸的巯基部分发生加成反应形成噻唑环。半胱氨酸的巯基部分发生加成反应形成噻唑环。但现在用同位素试验证实缬氨酸的异丙基完整的掺入了青霉素，否定但现在用同位素试

26、验证实缬氨酸的异丙基完整的掺入了青霉素，否定 了上述结论。了上述结论。 2、青霉素、青霉素G、 6APA 的形成的形成三肽化合物闭环以后，形成异青霉素三肽化合物闭环以后，形成异青霉素 N，它是合成各种青霉素的前体，它是合成各种青霉素的前体， 其中的侧链是其中的侧链是氨基己二酸。氨基己二酸。侧链侧链氨基己二酸可以被酰基转移酶催化转换为其它侧链。如：在发氨基己二酸可以被酰基转移酶催化转换为其它侧链。如：在发 酵液中加入苯乙酸，与酵液中加入苯乙酸，与氨基己二酸进行交换后，带上苯乙酸侧链就氨基己二酸进行交换后，带上苯乙酸侧链就 是青霉素是青霉素 G。 异青霉素异青霉素 N被青霉素酰化酶催化，使侧链裂解

27、生成被青霉素酰化酶催化，使侧链裂解生成6APA，它是合成各，它是合成各 种半合成青霉素的主要原料。，种半合成青霉素的主要原料。， p头孢菌素头孢菌素C的合成的合成头孢菌素头孢菌素C与与青霉素具有相同的前体物质。当三肽化合物闭环以后，与与青霉素具有相同的前体物质。当三肽化合物闭环以后， 形成异青霉素形成异青霉素 N，其中的侧链，其中的侧链L氨基己二酸异构为氨基己二酸异构为D型后，转变型后，转变 成青霉素成青霉素 N。头孢菌素头孢菌素C（即先锋霉素）由头孢菌产生，其结构与青霉素相似，是由（即先锋霉素）由头孢菌产生，其结构与青霉素相似，是由 酰基侧链和母核酰基侧链和母核氨基头孢霉烷酸组成，氨基头孢霉

28、烷酸组成，7CAC结构中含有一个双氢噻结构中含有一个双氢噻 唑环（唑环（A环）和一个环）和一个内酰胺环（内酰胺环（B环）。环）。青霉素青霉素 N在扩环化酶（即脱乙酰氧头孢菌素在扩环化酶（即脱乙酰氧头孢菌素C合成酶）的催化下，使硫原合成酶）的催化下，使硫原 子和缬氨酸的一个甲基之间脱氢，形成双氢噻唑环，生成脱乙酰氧头孢子和缬氨酸的一个甲基之间脱氢，形成双氢噻唑环，生成脱乙酰氧头孢 菌素菌素C，在加氧酶、乙酰转移酶作用下，最后合成头孢菌素，在加氧酶、乙酰转移酶作用下，最后合成头孢菌素C。氨基酸氨基酸p氨基酸发酵机理和菌种选育氨基酸发酵机理和菌种选育几乎所有的微生物都能在其代谢途径中合成氨基酸以满足

29、细胞生长的需几乎所有的微生物都能在其代谢途径中合成氨基酸以满足细胞生长的需 要，但是由于受到产物的反馈调节，细胞内各种氨基酸的浓度只能维持要，但是由于受到产物的反馈调节，细胞内各种氨基酸的浓度只能维持 在生理浓度范围内，不会产生过量的积累。在生理浓度范围内，不会产生过量的积累。当以葡萄糖为碳源时，细胞内各种氨基酸代谢途径如下图所示。当以葡萄糖为碳源时，细胞内各种氨基酸代谢途径如下图所示。从图中可得出氨基酸合成的如下特点从图中可得出氨基酸合成的如下特点：某一类氨基酸往往有一个共同的前体（如芳香族氨基酸的共同的前体某一类氨基酸往往有一个共同的前体（如芳香族氨基酸的共同的前体 莽草酸）；莽草酸）；

30、氨基酸生物合成与氨基酸生物合成与EMP途径途径TCA循环关系密切；循环关系密切；一种氨基酸可能是另一种氨基酸的前体；一种氨基酸可能是另一种氨基酸的前体；根据以上特点要大量地积累氨基酸应该做到以下几点：根据以上特点要大量地积累氨基酸应该做到以下几点：必须解除代谢途径中存在的产物反馈调节；必须解除代谢途径中存在的产物反馈调节；防止合成的目标氨基酸降解或用于合成其它细胞组分；防止合成的目标氨基酸降解或用于合成其它细胞组分；若几种氨基酸有一个共同的前体应切断其它氨基酸的合成途径；若几种氨基酸有一个共同的前体应切断其它氨基酸的合成途径；应增加细胞膜的通透性。应增加细胞膜的通透性。氨基酸生物合成的基本调节

31、机制有两种：反馈控制和在合成氨基酸生物合成的基本调节机制有两种：反馈控制和在合成 途径分支点处的优先合成。途径分支点处的优先合成。 氨基酸生产菌种的改造方法：诱变育种，基因工程。氨基酸生产菌种的改造方法：诱变育种，基因工程。 根据已掌握的微生物中氨基酸生物合成的代谢途径和调控机制，发酵法生根据已掌握的微生物中氨基酸生物合成的代谢途径和调控机制，发酵法生 产氨基酸的菌种选育主要有：营养缺陷型、代谢调节突变株及基因工程菌。产氨基酸的菌种选育主要有：营养缺陷型、代谢调节突变株及基因工程菌。 营养缺陷型菌种：营养缺陷型菌种： 积累直线型代谢途径中间产物氨基酸；如积累直线型代谢途径中间产物氨基酸；如 L

32、-鸟氨酸的生产，鸟氨酸的生产， 积累积累分支代谢途径末端的氨基酸；如赖氨酸的生产。分支代谢途径末端的氨基酸；如赖氨酸的生产。 其实质是降低反馈作用物的浓度，必须严格控制缺陷营养物其实质是降低反馈作用物的浓度，必须严格控制缺陷营养物质在亚适量水平质在亚适量水平 ，否则生产不稳定，因为此种微生物体内酶的，否则生产不稳定，因为此种微生物体内酶的代谢调节机制并未被解除。代谢调节机制并未被解除。代谢调节突变株：代谢调节突变株：营养缺陷型菌种不能用于积累直线型代谢途径末端氨基酸，只有选育营养缺陷型菌种不能用于积累直线型代谢途径末端氨基酸，只有选育代谢调节突变株才能达到目的。代谢调节突变株才能达到目的。一是

33、抗氨基酸结构类似物的突变株；一是抗氨基酸结构类似物的突变株；二是从营养缺陷型进一步得到某种调节酶缺失的回复突变株（营养缺陷和二是从营养缺陷型进一步得到某种调节酶缺失的回复突变株（营养缺陷和调节突变结合型）调节突变结合型） 。 基因工程菌：基因工程菌：生产生产 L-色氨酸（大肠杆菌）、色氨酸（大肠杆菌）、L-苏氨酸（苏氨酸（55 g/L） 。p谷氨酸代谢调控机制谷氨酸代谢调控机制 谷氨酸产生菌可以从自然界筛选得到（谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌）。谷氨酸产生菌可以从自然界筛选得到（谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌）。最初筛选得到的菌种积累谷氨酸不超过最初筛选得到的菌种积累谷氨酸不超过30 g/L，通过不断的诱

34、变育种，目前，通过不断的诱变育种，目前生产谷氨酸的工业菌种产谷氨酸能力超过生产谷氨酸的工业菌种产谷氨酸能力超过100 g/L，甚至达到甚至达到150 g/L。 但是，从自然界筛选其他氨基酸生产菌种并不容易，这是由这些氨基酸但是，从自然界筛选其他氨基酸生产菌种并不容易，这是由这些氨基酸 在细胞内的代谢机理所决定的。在细胞内的代谢机理所决定的。 其他氨基酸生产菌几乎都是从谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌通过诱变育种或其他氨基酸生产菌几乎都是从谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌通过诱变育种或 基因工程技术获得的，这是氨基酸发酵菌种的一大特点。基因工程技术获得的，这是氨基酸发酵菌种的一大特点。 谷氨酸生物合成途径谷氨酸

35、生物合成途径EMP 途径途径 ；HMP 途径；途径；TCA 循环；循环；DCA 循环；循环； CO2 固定固定由由葡葡萄萄糖糖生生物物合合成成谷谷氨氨酸酸的的代代谢谢途途径径 研究证明：研究证明： 谷氨酸生产菌种存在谷氨酸生产菌种存在EMPEMP途径的全部酶和途径的全部酶和HMPHMP途径有关的酶；途径有关的酶； 谷氨酸菌存在谷氨酸菌存在COCO2 2固定生成草酰乙酸的固定生成草酰乙酸的PEPPEP羧化酶和苹果酸酶，羧化酶和苹果酸酶， 与谷氨酸得率正相关；与谷氨酸得率正相关； TCATCA循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生成谷氨循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生成谷氨 酸，

36、其相应的酶与谷氨酸合成有关；酸，其相应的酶与谷氨酸合成有关； 以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，DCADCA循环是循环是CC4 4二羧二羧 酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷氨酸生成酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷氨酸生成 期此循环应关闭。期此循环应关闭。谷氨酸谷氨酸代谢调控机制代谢调控机制谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 -酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶在黄色短杆菌中谷氨酸、天冬氨酸生物合成的调节机制在黄色短杆菌中谷氨酸、天冬氨酸生物合成的调节机制NH4+ 在微生物的代谢中，在微

37、生物的代谢中，Glu比比Asp优先合成；合成过量时则优先合成；合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp；Asp过量时反过量时反馈抑制馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。 NH4+的导入不仅证明的导入不仅证明Glu是氮素同化发酵，而且它还会抑制是氮素同化发酵，而且它还会抑制 Glu生成的逆反应，因此当生成的逆反应，因此当NH4+存在时，葡萄糖的消耗速度存在时，葡萄糖的消耗速度 很快，很快， Glu的生成很高；但是当生物素充足时，的生成很高；但是当生物素充足时，NH4+几乎几乎 不影响糖代谢。不影响糖代谢。Glu生产

38、菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适 量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失 调使调使Glu得以积累。得以积累。 生物素贫乏时，细胞内的生物素贫乏时，细胞内的GluGlu含量少而且容易析出，而培养含量少而且容易析出，而培养 基中积累大量的基中积累大量的GluGlu；生物素丰富时，培养基中几乎不积生物素丰富时，培养基中几乎不积 累累GluGlu，而细胞内却含有大量的而细胞内却含有大量的GluGlu，且不易被析出。且不易被析出。 这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。这说明生物素对细胞

39、膜通透性有重要影响。谷氨酸高产菌模型特征谷氨酸高产菌模型特征 丧失或有微弱的丧失或有微弱的 -酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶活力，使活力，使 -酮戊二酸不能继续氧化脱羧酮戊二酸不能继续氧化脱羧 生成琥珀酰生成琥珀酰CoA和琥珀酸和琥珀酸 （琥珀酸（琥珀酸 延胡索酸延胡索酸 苹果酸苹果酸 草酰乙酸）；草酰乙酸）； CO2固定能力强，使四碳二羧酸全部由固定能力强，使四碳二羧酸全部由CO2固定反应提供，而不走乙醛酸固定反应提供，而不走乙醛酸 循环；循环； 谷氨酸脱氢酶的活力很强谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和 反馈阻遏，同时，反馈阻

40、遏，同时，NADPH2再氧化能力弱，这会使再氧化能力弱，这会使 -酮戊二酸到琥珀酸酮戊二酸到琥珀酸 的过程受阻；的过程受阻； 有过量的有过量的NH4+ 存在，存在， -酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成 谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外；谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外； 同时，谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。同时，谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。核苷酸核苷酸p代谢调控机制代谢调控机制一、核苷酸的生物合成途径一、核苷酸的生物合成途径1. 嘌呤核苷酸的全合成途径（嘌呤核苷酸的全合成途径（

41、“从无到有从无到有”途径）途径）IMPIMP肌苷酸肌苷酸（次黄嘌呤核苷一磷酸）（次黄嘌呤核苷一磷酸）SAICAR 5-SAICAR 5-氨基氨基-(N-(N-琥珀基琥珀基) )代氨甲酰咪唑核苷酸代氨甲酰咪唑核苷酸AMPAMP腺苷酸腺苷酸（腺嘌呤核苷一磷酸）（腺嘌呤核苷一磷酸）GMP GMP 鸟苷酸鸟苷酸AICAR 5-AICAR 5-氨基氨基-4-4-氨甲酰咪唑核苷酸氨甲酰咪唑核苷酸XMP XMP 黄苷酸黄苷酸（黄嘌呤核苷一磷酸）（黄嘌呤核苷一磷酸）PRPP PRPP 磷酸核糖焦磷酸磷酸核糖焦磷酸SAMP SAMP 腺苷琥珀酸腺苷琥珀酸PRA 5-PRA 5-磷酸核糖胺磷酸核糖胺嘌呤核苷酸的全

42、合成途径嘌呤核苷酸的全合成途径(1) 5 -IMP的生成（的生成（“从无到从无到有有”）嘌呤核苷酸的全合成途径嘌呤核苷酸的全合成途径(2) AMP和和GMP的互变的互变（枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌）各种微生物合成各种微生物合成 IMP 的途径是一样的，但是从的途径是一样的，但是从IMP分别生成分别生成AMP和和GMP的途径是不同的。的途径是不同的。从从IMP开始，开始， 枯草杆菌枯草杆菌以以IMP为中心分出两条环形路线，由此为中心分出两条环形路线，由此AMP与与GMP可以互相转换；可以互相转换； 产黄短杆菌产黄短杆菌分出的两条路线不是环形，而是单项分支的，分出的两条路线不是环形，而是单项分支的，

43、AMP与与GMP不能互相转换。不能互相转换。枯草杆菌的嘌呤核苷酸生物合成途径枯草杆菌的嘌呤核苷酸生物合成途径琥珀酰腺苷酸琥珀酰腺苷酸黄苷酸黄苷酸肌苷酸肌苷酸腺苷酸腺苷酸鸟苷酸鸟苷酸（5-胺基胺基-4-氨甲酰咪唑核苷酸）氨甲酰咪唑核苷酸）（5-胺基胺基-4-（N-琥珀基）琥珀基）- 代氨甲酰咪唑核苷酸）代氨甲酰咪唑核苷酸）（5-磷酸核糖胺）磷酸核糖胺）（磷酸核糖焦磷酸）（磷酸核糖焦磷酸）葡萄糖葡萄糖 5-磷酸核糖磷酸核糖产黄短杆菌的嘌呤核苷酸生物合成途径产黄短杆菌的嘌呤核苷酸生物合成途径2. 嘧啶核苷酸的全合成途径（略）嘧啶核苷酸的全合成途径（略）3. 核苷酸生物合成的补救途径核苷酸生物合成的补

44、救途径当全合成受阻时，微生物可从培养基中取得完整的嘌呤或嘧啶，和戊糖、磷酸当全合成受阻时，微生物可从培养基中取得完整的嘌呤或嘧啶，和戊糖、磷酸通过酶的作用直接合成单核苷酸，称为通过酶的作用直接合成单核苷酸，称为“补救途径补救途径”。嘌呤碱基、核苷和核苷酸之间能通过分段合成互相转变嘌呤碱基、核苷和核苷酸之间能通过分段合成互相转变其中最重要的反应是：其中最重要的反应是： 碱基碱基 + PRPP 5- 核苷酸核苷酸 + PPi核苷酸焦磷酸化酶核苷酸焦磷酸化酶嘌呤核苷酸的补救合成途径嘌呤核苷酸的补救合成途径 嘌呤碱基、核苷和核苷酸的相互转换嘌呤碱基、核苷和核苷酸的相互转换二、嘌呤核苷酸的代谢调节机制二

45、、嘌呤核苷酸的代谢调节机制（枯草杆菌型）（枯草杆菌型）AMP脱氨酶脱氨酶SAMP裂解酶裂解酶SAMP合成酶合成酶GMP还原酶还原酶XMP氨化酶氨化酶IMP脱氢酶脱氢酶IMP合成系的代谢控制及嘌呤核苷酸互变的代谢控制合成系的代谢控制及嘌呤核苷酸互变的代谢控制如果同时添加这两类嘌呤核苷酸（如果同时添加这两类嘌呤核苷酸（GMP+AMP 或或IMP+ADP），），抑制作用就会相乘的提高，这种现象叫抑制作用就会相乘的提高，这种现象叫做做“合作终产物抑制合作终产物抑制”。 嘌呤核苷酸可以分为嘌呤核苷酸可以分为GMPGMP、IMPIMP等等6-6-羟基嘌呤核苷酸与羟基嘌呤核苷酸与ADPADP、AMPAMP等

46、的等的6-6-氨基嘌呤核苷酸两类。氨基嘌呤核苷酸两类。以以IMP为中心的两个循环，各个反应是不可逆的。为中心的两个循环，各个反应是不可逆的。 IMP脱氢酶受脱氢酶受GMP的反馈抑制，也被的反馈抑制，也被GMP阻遏；阻遏；GMP还原酶受还原酶受ATP的反馈抑制；的反馈抑制； 同样的，同样的，AMP抑制抑制SAMP合成酶，合成酶，GTP抑制抑制AMP脱氨酶。脱氨酶。 SAMPAMP反应的供能体为反应的供能体为GTP，XMPGMP反应的反应的供能体为供能体为ATP。根据上述调节机制，当细胞中的根据上述调节机制，当细胞中的GMP水平提高到一定程度水平提高到一定程度时，从时，从IMP的代谢流就自动地转向

47、的代谢流就自动地转向AMP方面；反之，当细方面；反之，当细胞的胞的AMP水平高到一定程度时，从水平高到一定程度时，从IMP的代谢流就自动地的代谢流就自动地转向转向GMP方面。方面。另一方面，核苷酸的代谢也与组氨酸的生物合成有关：另一方面，核苷酸的代谢也与组氨酸的生物合成有关：AICARIMPAMPATPPR-ATPAICAR形成一个形成一个循环，由循环，由PRATP经咪唑甘油磷酸生成组氨酸。假如组氨酸过经咪唑甘油磷酸生成组氨酸。假如组氨酸过剩，则不走此途径。剩，则不走此途径。三、肌苷和肌苷酸高产菌的选育模型三、肌苷和肌苷酸高产菌的选育模型1）切断两条支路代谢，选育腺嘌呤缺陷型（）切断两条支路代

48、谢，选育腺嘌呤缺陷型（Ade）和黄和黄 嘌呤缺陷型（嘌呤缺陷型（Xan）的双重缺陷型突变株；的双重缺陷型突变株；2）通过限量腺嘌呤和鸟嘌呤来解除腺嘌呤系和鸟嘌呤系化合物对）通过限量腺嘌呤和鸟嘌呤来解除腺嘌呤系和鸟嘌呤系化合物对 IMP 生物生物合成的酶的反馈抑制；合成的酶的反馈抑制；3）进一步选育抗腺嘌呤、鸟嘌呤类似物和（或）抗磺胺剂突变株，从遗传上）进一步选育抗腺嘌呤、鸟嘌呤类似物和（或）抗磺胺剂突变株，从遗传上解除正常代谢控制；解除正常代谢控制；（选育抗性突变株时，应采用丧失腺嘌呤脱氢酶（选育抗性突变株时，应采用丧失腺嘌呤脱氢酶的菌株为出发菌株）的菌株为出发菌株） 模型：模型：AdeAde

49、+ Xa+ Xa+ dea+ dea+ GMPred+ GMPred + 8AGr+ 8AGr（或（或8AXr8AXr、ARrARr）+ SGr + NP+ SGr + NP + + ARr + Smr ARr + Smr （符号见（符号见微生物工程工艺原理微生物工程工艺原理p.116p.116）4 4）选育）选育MnMn2+2+脱敏突变株（脱敏突变株（MnINSMnINS），或控制培养基中），或控制培养基中MnMn2+2+的浓度，解除细胞膜的浓度，解除细胞膜渗透型障碍。渗透型障碍。5 5）生产肌苷时，肌苷酸酶活性要强，而肌苷酸化酶要越弱越好，以使生成的）生产肌苷时，肌苷酸酶活性要强，而肌苷酸

50、化酶要越弱越好，以使生成的肌苷不再分解。肌苷不再分解。q 肌苷酸发酵机制肌苷酸发酵机制5-IMP发酵应具备的条件：发酵应具备的条件：选择肌苷酸酶弱或丧失的出发菌株；选择肌苷酸酶弱或丧失的出发菌株；切断切断IMP向下的两条支路，使向下的两条支路，使IMP大量生成和积累；大量生成和积累；选育结构类似物双重抗性突变株；选育结构类似物双重抗性突变株；限量添加限量添加Mn2+，解除细胞膜渗透型障碍。解除细胞膜渗透型障碍。q鸟苷酸发酵机制鸟苷酸发酵机制(讨论讨论)柠檬酸柠檬酸：1978年产量年产量0.35万吨，万吨，1996年为年为18.25万吨，产量增长万吨，产量增长51倍，倍，产产值增加值增加11.1

51、3亿元亿元。2002年全国柠檬酸总产量突破年全国柠檬酸总产量突破40万吨。万吨。 柠檬酸柠檬酸20022002年年，柠柠檬檬酸酸出出口口量量为为2626万万吨吨，柠柠檬檬酸酸钠钠出出口口量量为为2 2 .58.58万万吨吨，其其中中柠柠檬檬酸酸及及盐盐创创汇汇约约1352113521万万美美 元元，成成为为我我国国食食品品行行业业中中新新兴兴的的创创汇汇超超亿亿美美元的单项产品。元的单项产品。p 柠檬酸发酵柠檬酸发酵1. 1. 柠檬酸的生物合成途径柠檬酸的生物合成途径生产菌种：黑曲霉生产菌种：黑曲霉代谢途径：代谢途径：EMPEMP、HMPHMP、TCATCA循环、循环、DCADCA循环循环黑曲

52、霉存在以上代谢途径的酶系，柠檬酸的生物合成途径如下图所示。黑曲霉存在以上代谢途径的酶系，柠檬酸的生物合成途径如下图所示。u研究表明研究表明u 黑曲霉在生长期和产酸期都存在黑曲霉在生长期和产酸期都存在EMP和和HMP代谢，说明代谢，说明 葡萄糖的降解是通过两条途径共同完成的。葡萄糖的降解是通过两条途径共同完成的。u 生长期：生长期：EMPHMP为为 21u 产酸期：产酸期： EMPHMP为为 41u 生长期还需要生长期还需要 HMP途径提供合成核酸等所需前体物质途径提供合成核酸等所需前体物质u 产酸期葡萄糖主要通过产酸期葡萄糖主要通过EMP途径降解，能获得较高的糖酸转化率途径降解，能获得较高的糖

53、酸转化率u 产酸阶段产酸阶段，TCA循环和循环和DCA循环均被阻断或减弱。因此，循环均被阻断或减弱。因此， 合成柠檬酸所需的草酰乙酸必须由三碳羧酸合成柠檬酸所需的草酰乙酸必须由三碳羧酸(丙酮酸丙酮酸)来提供来提供2. 黑曲霉合成柠檬酸的代谢调控黑曲霉合成柠檬酸的代谢调控柠檬酸是柠檬酸是TCATCA循环中的一员，又是糖代谢的一个重要调节因子，它是循环中的一员，又是糖代谢的一个重要调节因子，它是EMPEMP途径中第一个调节酶磷酸果糖激酶途径中第一个调节酶磷酸果糖激酶 (PFK) (PFK) 的抑制物。的抑制物。在正常细胞内，一般不会积累柠檬酸，只有柠檬酸产生菌才能积累大在正常细胞内，一般不会积累柠

54、檬酸，只有柠檬酸产生菌才能积累大量柠檬酸。量柠檬酸。PFKPFK的抑制和激活的抑制和激活柠檬酸柠檬酸ATPATPPFKPFKNHNH4 4+ +2 2，6-6-二磷酸果糖二磷酸果糖PiPi，AMPAMP3. 柠檬酸高产菌模型特征柠檬酸高产菌模型特征（1 1）设法消除对）设法消除对PFKPFK的抑制作用，确保的抑制作用，确保EMPEMP途径的畅通。途径的畅通。（2 2）TCATCA循环中与柠檬酸合成关系密切的酶有：循环中与柠檬酸合成关系密切的酶有：丙丙酮酮酸酸既既能能脱脱羧羧形形成成乙乙酰酰-CoA-CoA，又又能能在在丙丙酮酮酸酸羧羧化化酶酶催催化化下下固固定定CO2CO2生生成成草酰乙酸，因

55、此保持丙酮酸两个反应平衡，才能获得柠檬酸的高产。草酰乙酸，因此保持丙酮酸两个反应平衡，才能获得柠檬酸的高产。柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶顺乌头酸水合酶顺乌头酸水合酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺顺乌乌头头酸酸水水合合酶酶和和异异柠柠檬檬酸酸脱脱氢氢酶酶能能使使柠柠檬檬酸酸进进一一步步代代谢谢而而分分解解，而而这这两两种种酶酶在在pH2.0pH2.0时均失活。时均失活。顺顺乌乌头头酸酸水水合合酶酶受受Fe Fe 2+2+的的激激活活，因因此此当当环环境境缺缺乏乏Fe Fe 2+2+和和柠柠檬檬酸酸积积累累 （pHpH下下降降) ) ，柠檬酸沿，柠檬酸沿TCATCA代谢的通道被阻断。代谢的通道被阻断。

56、因为因为Mn 2+为催化核酸合成的酶所必需，其不足会影响某些蛋白质和核酸的为催化核酸合成的酶所必需，其不足会影响某些蛋白质和核酸的合成，从而使合成，从而使 NH 4+浓度上升，解除柠檬酸对浓度上升，解除柠檬酸对 PFK 的抑制。的抑制。（3 3）Mn Mn 2+2+对对柠柠檬檬酸酸合合成成有有重重要要影影响响，Mn Mn 2+2+缺缺乏乏可可导导致致胞胞内内NH NH 4 4+ +浓浓度度增增高高，并出现某些氨基酸的积累。并出现某些氨基酸的积累。 （4 4）柠柠檬檬酸酸产产生生菌菌黑黑曲曲霉霉中中存存在在一一旁旁系系呼呼吸吸链链，该该旁旁系系呼呼吸吸链链在在氧氧化化过过程程中不产生中不产生AT

57、PATP，通过旁系呼吸链可减少，通过旁系呼吸链可减少ATPATP对对PFKPFK的抑制。的抑制。（5 5）柠柠檬檬酸酸合合成成场场所所在在线线粒粒体体，合合成成后后则则分分泌泌到到胞胞外外。但但合合成成过过程程中中有有些些酶酶却却在在细细胞胞质质内内，因因此此合合成成过过程程的的中中间间物物和和终终产产物物在在线线粒粒体体，细细胞胞质质和和细细胞胞外的输送转移及其调控等也十分重要。外的输送转移及其调控等也十分重要。微生物酶制剂微生物酶制剂酶制剂酶制剂：1978年产量为年产量为0.45万吨，万吨，1997年为年为18.4万吨，产量万吨，产量增长增长39倍，产值增加倍，产值增加3.5亿元亿元。pp

58、 酶的生产菌种酶的生产菌种酶的生产菌种酶的生产菌种1 1酶发酵生产的细胞必需具备如下条件酶发酵生产的细胞必需具备如下条件酶的产量高；酶的产量高；产酶稳定性好；产酶稳定性好；容易培养和管理：发酵周期短，营养需求简单；容易培养和管理：发酵周期短，营养需求简单；产物杂质少，利于酶的分离纯化；产物杂质少，利于酶的分离纯化；安全可靠，非致病性。安全可靠，非致病性。2. 常见酶发酵生产用微生物常见酶发酵生产用微生物酶的生产菌种酶的生产菌种酶的生产菌种酶的生产菌种Bacillus subtilisBacillus subtilis： - -淀粉酶，中性蛋白酶。淀粉酶，中性蛋白酶。Esherichia col

59、i（胞内酶）：（胞内酶）： 半乳糖苷酶，谷氨酸脱羧酶，天门冬酸酶，苄半乳糖苷酶，谷氨酸脱羧酶，天门冬酸酶，苄青霉素酰化酶，限制性核酸内切酶，青霉素酰化酶，限制性核酸内切酶，DNA聚合酶，聚合酶，DNA连接酶，核酸外切酶。连接酶，核酸外切酶。Aspergillus niger：糖化酶，果胶酶，纤维素酶，半纤维素酶，葡萄糖，：糖化酶，果胶酶，纤维素酶，半纤维素酶，葡萄糖，氧化酶，酸性蛋白酶，柚苷酶。氧化酶，酸性蛋白酶，柚苷酶。Aspergillus oryzae：淀粉酶，中性蛋白酶，果胶酶，氨基酰化酶、脂肪酶：淀粉酶，中性蛋白酶，果胶酶，氨基酰化酶、脂肪酶，磷酸二酯酶。，磷酸二酯酶。Rhizopu

60、s（根霉属）：糖化酶，转化酶，脂肪酶，酸性蛋白酶，半纤维素酶。（根霉属）：糖化酶，转化酶，脂肪酶，酸性蛋白酶，半纤维素酶。Mucor（毛霉属）：蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，凝乳酶。（毛霉属）：蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，凝乳酶。Penicillium（产黄青霉）：葡萄糖氧化酶，青霉素酰化酶，果胶酶，纤维素酶（产黄青霉）：葡萄糖氧化酶，青霉素酰化酶，果胶酶，纤维素酶，桔青霉，桔青霉，5磷酸二酯酶，脂肪酶，葡萄糖氧化酶，核酶酶，凝乳蛋白酶。磷酸二酯酶，脂肪酶，葡萄糖氧化酶，核酶酶，凝乳蛋白酶。TrichodermaTrichoderma（木霉属）：纤维素酶，（木霉属）：纤维素酶，1717 - -羟化酶。羟

61、化酶。StreptomycesStreptomyces（链霉菌）：葡萄糖异构酶，中性蛋白酶，几丁质酶。（链霉菌）：葡萄糖异构酶，中性蛋白酶，几丁质酶。Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae（啤酒酵母）：转化酶（啤酒酵母）：转化酶CandidaCandida（假丝酵母属）：脂肪酶，转化酶，尿酶，乳糖酶。假丝酵母属）：脂肪酶，转化酶，尿酶，乳糖酶。脆壁酵母：乳糖酶脆壁酵母：乳糖酶3. 工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源 酶酶 产产 酶酶 微微 生生 物物 用用 途途-淀粉淀粉酶酶枯草芽枯草芽孢孢杆菌

62、杆菌 地衣芽地衣芽孢孢杆菌杆菌米曲霉米曲霉淀粉液化，淀粉液化，织织物退物退浆浆，消化助消化助剂剂，加，加酶酶洗洗涤剂涤剂葡萄糖淀粉葡萄糖淀粉酶酶米曲霉，黑曲霉，米根霉米曲霉，黑曲霉，米根霉制造葡萄糖，制造葡萄糖，发发酵、酵、酿酿酒等工酒等工业业的淀粉水解糖的淀粉水解糖中性蛋白中性蛋白酶酶枯草芽枯草芽孢孢杆菌，米曲霉杆菌，米曲霉皮革、毛皮加工，食品皮革、毛皮加工，食品加工，加工，调调味品制造、助味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清消化、消炎、啤酒澄清碱性蛋白碱性蛋白酶酶地衣芽地衣芽孢孢杆菌杆菌 加加酶酶洗洗涤剂涤剂植酸植酸酶酶黑曲霉，黑曲霉，毕毕赤酵母工程菌株赤酵母工程菌株 饲饲料添加料添加剂剂3.

63、 工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源 酶酶 产产 酶酶 微微 生生 物物 用用 途途纤维纤维素素酶酶里氏木霉、黑曲霉里氏木霉、黑曲霉水洗布生水洗布生产产，饲饲料添加料添加剂剂，消化植物消化植物细细胞壁胞壁半半纤维纤维素素酶酶木霉、曲霉、根霉木霉、曲霉、根霉饲饲料添加料添加剂剂，消化植物，消化植物细细胞胞壁，低聚木糖生壁，低聚木糖生产产葡聚糖葡聚糖酶酶枯草芽枯草芽孢孢杆菌，黑曲霉，杆菌，黑曲霉，Penicillium emersoni啤酒啤酒酿酿造，造，饲饲料添加料添加剂剂异淀粉异淀粉酶酶产产气克雷伯氏菌，芽气克雷伯氏菌，芽孢孢杆菌杆菌淀粉加工淀粉加工乳

64、糖乳糖酶酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉米根霉乳品工乳品工业业（处处理牛乳和乳清）理牛乳和乳清）果胶果胶酶酶曲霉、欧文氏菌曲霉、欧文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，水果加工，果汁、果酒澄清，麻麻类纤维类纤维脱胶脱胶3. 工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源 酶酶 产产 酶酶 微微 生生 物物 用用 途途转转化化酶酶啤酒酵母、假啤酒酵母、假丝丝酵母酵母制造制造转转化糖化糖凝乳凝乳酶酶米赫毛霉米赫毛霉,大大肠肠杆菌和真菌生杆菌和真菌生产产的重的重组组酶酶制造乳酪制造乳酪脂肪脂肪酶酶曲霉、根霉、酵母等曲霉、根霉、酵母等加加酶酶洗洗涤剂

65、涤剂，油脂加工，生，油脂加工，生物化工物化工葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶酶青霉、曲霉青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，食品去氧、除葡萄糖，测测定定葡萄糖葡萄糖葡萄糖异构葡萄糖异构酶酶凝凝结结芽胞杆菌，白色芽胞杆菌，白色链链霉菌霉菌生生产产果葡糖果葡糖浆浆青霉素青霉素酰酰化化酶酶细细菌、霉菌、放菌、霉菌、放线线菌菌制造制造6-氨基青霉氨基青霉烷烷酸酸p 酶生物合成调节的基本理论酶生物合成调节的基本理论 酶的生物合成：酶在生物体内产生的过程。酶的生物合成：酶在生物体内产生的过程。 酶的发酵生产：酶的发酵生产： 通通过过人人工工操操作作控控制制，利利用用细细胞胞（包包括括微微生生物物细细胞胞、植植物物细细胞和

66、动物细胞）的生命活动，产生人们所需要酶的过程。胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要酶的过程。1 1 1 1、酶合成转录水平上的调节、酶合成转录水平上的调节、酶合成转录水平上的调节、酶合成转录水平上的调节 底物和代谢产物对基因活性的调节（诱导、阻遏）。底物和代谢产物对基因活性的调节（诱导、阻遏）。 编码蛋白质和淀粉等编码蛋白质和淀粉等分解酶分解酶的基因。的基因。 合合成成各各种种细细胞胞代代谢谢过过程程中中所所必必需需的的小小分分子子物物质质（如如氨氨基基酸酸、嘌呤和嘧啶）的酶的基因。（嘌呤和嘧啶）的酶的基因。（合成酶）合成酶）诱导：乳糖操纵子诱导：乳糖操纵子 阻遏：未端产物（辅阻遏物）关闭

67、转录。阻遏：未端产物（辅阻遏物）关闭转录。 分解代谢物阻遏：分解代谢物阻遏：分解代谢物阻遏：分解代谢物阻遏：容易利用的碳源；容易利用的碳源；中间产物；诱导酶中间产物；诱导酶中间产物；诱导酶中间产物；诱导酶 葡萄糖阻遏葡萄糖阻遏 半乳糖苷酶的生物合成机理：半乳糖苷酶的生物合成机理：l 葡萄糖的大量存在，降低了胞内葡萄糖的大量存在，降低了胞内 cAMP cAMP 浓度：浓度：葡萄糖抑制腺苷酸环化酶活性，降低葡萄糖抑制腺苷酸环化酶活性，降低 cAMP cAMP 生成：生成： ATPcAMP+PiiATPcAMP+Pii；l 葡萄糖存在引起葡萄糖存在引起ATPATP浓度上升，消耗胞内浓度上升，消耗胞内

68、cAMPcAMP： cAMP+H2OADPATPcAMP+H2OADPATP 结结果果，启启动动子子上上没没有有cAMPcAMPCRPCRP复复合合物物结结合合，使使得得RNARNA聚聚合合酶酶也无法结合到启动子的位点上，结构基因不能转录和表达。也无法结合到启动子的位点上，结构基因不能转录和表达。 弱化子或衰减子（弱化子或衰减子（attenuator)对基因活性的调节（转录弱化作用）对基因活性的调节（转录弱化作用） 这这一一调调控控作作用用是是通通过过操操纵纵子子的的引引导导区区内内类类似似于于终终止止子子结结构构的的一一段段DNADNA序序列列实现的，这段序列被称为弱化子或衰减子实现的，这段

69、序列被称为弱化子或衰减子。 弱弱化化子子或或衰衰减减子子能能够够使使结结构构基基因因（编编码码酶酶）的的起起始始密密码码前前的的mRNAmRNA片片断断（前前导导区区）通通过过自自我我配配对对形形成成奇奇特特的的二二级级结结构构- -茎茎环环结结构构（终终止止信信号号），使使已已开开始始的转录不能继续下去，使正在翻译表达中的的转录不能继续下去，使正在翻译表达中的mRNAmRNA部分中途停止。部分中途停止。 弱化子或衰减子受弱化子或衰减子受氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA的浓度影响：的浓度影响：当细胞内某种氨基酰当细胞内某种氨基酰-tRNA -tRNA 缺乏时，该弱化子不表现为终止子功能。缺乏时

70、，该弱化子不表现为终止子功能。当细胞内某种氨基酰当细胞内某种氨基酰-tRNA -tRNA 充足时，该弱化子表现为终止子功能。充足时，该弱化子表现为终止子功能。 该片断的缺失会提高酶的表达量；该片断的缺失会提高酶的表达量； 阻遏控制转录的起始；阻遏控制转录的起始； 弱化子控制转录起始后能否继续下去。弱化子控制转录起始后能否继续下去。细菌的应急反应（严紧控制）细菌的应急反应（严紧控制） 当氨基酸全面匮乏时，细菌产生应急反应，包括生产各种当氨基酸全面匮乏时，细菌产生应急反应，包括生产各种RNARNA、糖、脂肪和、糖、脂肪和 蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。蛋白质在内的几乎全部生物化学反

71、应过程均被停止。 信号是鸟苷四磷酸（信号是鸟苷四磷酸（ppGppppGpp）和鸟苷五磷酸（）和鸟苷五磷酸（pppGpppppGpp）。）。产生这两种物质的诱导物是产生这两种物质的诱导物是空载空载tRNAtRNA。当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNAtRNA，这种空载的，这种空载的 tRNAtRNA会激活焦磷酸转移酶，使会激活焦磷酸转移酶，使ppGppppGpp大量合成，其浓度可增加大量合成，其浓度可增加1010倍以上。倍以上。ppGppppGpp的出现关闭许多基因，打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种的出现关闭许多基因，打开一些合

72、成氨基酸的基因，以应付这种 紧急状况。紧急状况。p 微生物发酵产酶方式微生物发酵产酶方式1. 1. 固体培养固体培养定定义义：利利用用麸麸皮皮和和米米糠糠为为主主要要原原料料，添添加加谷谷壳壳，豆豆饼饼等等，加加水水拌拌成成半半固固体体状状态，供微生物生长和产酶用。态，供微生物生长和产酶用。 浅盘法、浅盘法、转桶法转桶法、厚层通气法、厚层通气法 浅盘法：将固态培养基平铺在浅盘（多为木盘或竹匾）内，厚约浅盘法：将固态培养基平铺在浅盘（多为木盘或竹匾）内，厚约3-53-5厘厘 米，在能够控制湿度、温度的曲房里进行发酵。米，在能够控制湿度、温度的曲房里进行发酵。 转桶法：将固态培养基接入菌种后，放在

73、可旋转的转桶内，当桶慢慢转转桶法：将固态培养基接入菌种后，放在可旋转的转桶内，当桶慢慢转 动时，培养基即在转桶内翻动，通气及温湿度调节较为均匀，有利于微动时，培养基即在转桶内翻动，通气及温湿度调节较为均匀，有利于微 生物的生长和产酶。生物的生长和产酶。 厚层通气法：将固体培养基接入菌种后，平铺在具有多孔的大池内，厚厚层通气法：将固体培养基接入菌种后，平铺在具有多孔的大池内，厚 度可达度可达20-3020-30厘米；待微生物已开始生长，即从池底通入一定温度和相对厘米；待微生物已开始生长，即从池底通入一定温度和相对 湿度的空气，使微生物比较均匀适宜地生长繁殖和产酶。湿度的空气，使微生物比较均匀适宜

74、地生长繁殖和产酶。优点：优点：设备简单，投资较少。设备简单，投资较少。环境污染少；环境污染少；特别适用于霉菌的培养特别适用于霉菌的培养和发酵产酶。和发酵产酶。缺点缺点 ：劳动强度大；劳动强度大；原料利用率低；原料利用率低；产酶纯度较差；提取精制较难；产酶纯度较差；提取精制较难；传传质传热效率低，发酵条件不易控制均匀，产酶不稳定；质传热效率低，发酵条件不易控制均匀，产酶不稳定；不宜胞内酶生产不宜胞内酶生产（菌体分离难度大）。（菌体分离难度大）。2. 2. 液体深层发酵液体深层发酵液体表面发酵，目前已不采用。液体表面发酵，目前已不采用。液体深层通风发酵液体深层通风发酵优点：优点：产酶纯度高，质量稳

75、定；产酶纯度高，质量稳定；较易控制发酵条件，有利于自动化较易控制发酵条件，有利于自动化控制；控制；机械化程度高，劳动强度小；设备利用率高。机械化程度高，劳动强度小；设备利用率高。缺点：设备投资较大。缺点：设备投资较大。3. 固定化细胞发酵固定化细胞发酵优点：优点：固定化细胞的密度大，反应器生产强度大；固定化细胞的密度大，反应器生产强度大；发酵稳定性好，可以连续发酵稳定性好，可以连续使用较长时间，易于连续化，自动化生产；使用较长时间，易于连续化，自动化生产；可在高稀释率的条件下连续可在高稀释率的条件下连续发酵（发酵（Dm），提高设备利用率；），提高设备利用率；发酵液含菌体较少，利于产品分离。发酵

76、液含菌体较少，利于产品分离。缺点：缺点：不能强烈搅拌；不能强烈搅拌； 技术要求高，传质传热效果差（氧气供给，温度控制。技术要求高，传质传热效果差（氧气供给，温度控制。培养基成分的控制）；理论研究阶段；培养基成分的控制）；理论研究阶段； 只适用于胞外酶的生产。只适用于胞外酶的生产。p酶发酵动力学酶发酵动力学 研究发酵过程中速率及其影响因素的科学。研究发酵过程中速率及其影响因素的科学。 包括包括细胞生长动力学细胞生长动力学、反应基质消耗动力学反应基质消耗动力学和和酶生成动力学酶生成动力学等等。1 1 1 1、同步合成型、同步合成型、同步合成型、同步合成型酶的合成与生长同步酶的合成与生长同步进行。酶

77、的生物合成进行。酶的生物合成可以诱导，但不受分可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应解代谢物阻遏和反应产物阻遏。这类酶所产物阻遏。这类酶所对应的对应的mRNAmRNA很不稳定。很不稳定。2、延续合成型、延续合成型酶的合成伴随着细胞的生长而开始，酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后，酶还但在细胞生长进入稳定期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。可以延续合成较长的一段时间。果胶酶：果胶诱导果胶酶：果胶诱导酶的生物合成，可以诱酶的生物合成，可以诱导，但不受分解代谢物导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。阻遏和反应产物阻遏。这类酶所对应的这类酶所对应的mRNAmRNA相相当稳定，在

78、生长稳定期当稳定，在生长稳定期以后相当长的一段时间以后相当长的一段时间内继续用于酶的合成内继续用于酶的合成。3、中期合成型、中期合成型酶酶合合成成在在细细胞胞生生长长一一段段时时间间以以后后才才开开始始，而而在在细细胞胞进进入入稳稳定定期期后后，酶酶的的合合成成也也随随着着停止。停止。枯草杆菌枯草杆菌 碱性磷酸碱性磷酸酶，无机磷反馈阻遏酶，无机磷反馈阻遏酶的生物合成受到反酶的生物合成受到反馈阻遏，而且其所对馈阻遏，而且其所对应的应的mRNAmRNA不稳定。不稳定。4、滞后合成型、滞后合成型只只有有当当细细胞胞生生长长进进入入稳稳定定期期后后，酶酶开开始始合合成成并并大大量积累。量积累。许多水解

79、酶：许多水解酶：酶的生物合成酶的生物合成受分解代谢物受分解代谢物阻遏作用，这阻遏作用，这类酶所对应的类酶所对应的mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。理论的应用理论的应用目的：提高产酶率和缩短发酵周期。目的：提高产酶率和缩短发酵周期。最理想的合成模式：延续合成型。最理想的合成模式：延续合成型。 降低产酶温度。降低产酶温度。 策略措施：策略措施： 菌种选育：提高菌种选育：提高mRNAmRNA的稳定性，解除分解代谢物阻遏和反馈的稳定性，解除分解代谢物阻遏和反馈 阻遏。阻遏。 发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除反馈阻遏和分解代发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除反馈阻遏和分解代 谢物阻遏（难利用的碳

80、氮源的使用，补料发酵）。谢物阻遏（难利用的碳氮源的使用，补料发酵）。 酱酱 油油国内酱油生产和消费现状国内酱油生产和消费现状酱油酱油生产工艺及生产工艺及技术现状技术现状酿造酱油：原料酿造酱油：原料蒸料蒸料制曲制曲发酵发酵淋油淋油灭菌灭菌灌装灌装 配制酱油配制酱油: 酿造酱油酿造酱油+酸水解植物蛋白调味液酸水解植物蛋白调味液调配调配灭菌灭菌灌装灌装工艺要求高工艺要求高品质高，风味好品质高，风味好品质差品质差低盐固态发酵工艺酱油低盐固态发酵工艺酱油 高盐稀态发酵工艺酱油高盐稀态发酵工艺酱油 两类酱油酿造技术的比较发酵期发酵期46月月发酵期发酵期1个月个月工艺要求低工艺要求低产量大产量大产量较小产量

81、较小国际国际日本的酱油酿造技术处于国日本的酱油酿造技术处于国际领先的地位。广泛采用的际领先的地位。广泛采用的是高盐稀态发酵工艺。除日是高盐稀态发酵工艺。除日本外，在东南亚还有台湾、本外，在东南亚还有台湾、韩国等国家和地区的酱油酿韩国等国家和地区的酱油酿造技术也比较先进。造技术也比较先进。国内国内低品质的低盐固态发酵工艺低品质的低盐固态发酵工艺酱油占产量比为酱油占产量比为90%，而高，而高质的仅占我国酱油总产量的质的仅占我国酱油总产量的10%为主，总的来讲，我国为主，总的来讲，我国酱油的酿造技术和产品质量酱油的酿造技术和产品质量与日本及其它酱油酿造技术与日本及其它酱油酿造技术发达的国家相差较远。

82、发达的国家相差较远。目前我国酱油制作技术存在原材料利用率低（国内目前我国酱油制作技术存在原材料利用率低（国内80%80%），氨基酸生成率低等问题！），氨基酸生成率低等问题！白白 酒酒概概 述述一、白酒及其种类一、白酒及其种类 1. 按用曲种类分按用曲种类分 大曲酒大曲酒 定义：以大曲为糖化发酵剂、进行多次发酵，然后蒸馏、勾兑、贮存定义：以大曲为糖化发酵剂、进行多次发酵，然后蒸馏、勾兑、贮存 而成的酒。而成的酒。 特点：周期长（特点：周期长（15120d或更长），贮酒期为或更长），贮酒期为3个月至个月至3年。年。 质量较好，质量较好， 但淀粉出酒率较低，成本高。产量约为全国白酒总产量的但淀粉出酒

83、率较低，成本高。产量约为全国白酒总产量的20%。 小曲酒小曲酒 定义：以小曲为糖化发酵剂，进行多次发酵，然后进行定义：以小曲为糖化发酵剂，进行多次发酵，然后进行 蒸馏、蒸馏、 勾兑、贮存而成的酒。勾兑、贮存而成的酒。 特点：用曲量少（特点：用曲量少（3%），大多采用半固态发酵法，淀粉出酒率较），大多采用半固态发酵法，淀粉出酒率较 高（高（60%80% ） 。 麸曲白酒麸曲白酒 定义：以纯粹培养的曲霉菌及酵母制成的散麸曲和酒母为糖化发酵定义：以纯粹培养的曲霉菌及酵母制成的散麸曲和酒母为糖化发酵 剂，进行多次发酵，然后进行蒸馏、勾兑、贮存而成的酒。剂，进行多次发酵，然后进行蒸馏、勾兑、贮存而成的酒

84、。 特点：发酵期短（特点：发酵期短（ 39d），），淀粉出酒率高（淀粉出酒率高（ 70% ）。这类酒产量最大。）。这类酒产量最大。 2. 按香型分类按香型分类 酱香型：采用高温制曲、晾堂堆积、清蒸回酒等工艺，用酱香型：采用高温制曲、晾堂堆积、清蒸回酒等工艺，用 石壁泥底窖石壁泥底窖 发酵，酱香柔润为其特点。以茅台酒为代表。发酵，酱香柔润为其特点。以茅台酒为代表。 浓香型：采用混蒸续渣等工艺，利用陈年老窖或人工老窖发酵。以浓香甘爽浓香型：采用混蒸续渣等工艺，利用陈年老窖或人工老窖发酵。以浓香甘爽 为特点。为特点。 以泸州特曲酒为代表。以泸州特曲酒为代表。 清香型：清香型： 采用清蒸清渣等工艺及地

85、缸发酵。具有清香纯正的特点。采用清蒸清渣等工艺及地缸发酵。具有清香纯正的特点。 以汾酒为代表。以汾酒为代表。 米香型：米香型： 以大米为原料，小曲为糖化发酵剂。米香纯正为其特点，如桂以大米为原料，小曲为糖化发酵剂。米香纯正为其特点，如桂 林三花酒等。林三花酒等。 兼香型：采用上述某些白酒生产工艺或其它特殊工艺酿制成的、具有混兼香型：采用上述某些白酒生产工艺或其它特殊工艺酿制成的、具有混 合香型或特殊香型的白酒。例如，西凤酒、董酒等。合香型或特殊香型的白酒。例如，西凤酒、董酒等。3. 按生产方法分类按生产方法分类 固态发酵法白酒：酒醅含水固态发酵法白酒：酒醅含水60%左右左右,发酵物料处于固体状

86、态发酵物料处于固体状态. 例如例如,大曲酒、麸曲酒及部分小曲酒。大曲酒、麸曲酒及部分小曲酒。 半固态发酵法白酒：有先固态糖化后液态发酵和先液态糖化后半固态发酵法白酒：有先固态糖化后液态发酵和先液态糖化后 固态发酵两种。大部分小曲酒属于此类。固态发酵两种。大部分小曲酒属于此类。 二二 固态法白酒生产特点固态法白酒生产特点 1、低温双边发酵、低温双边发酵 采用较低的温度，让糖化作用和发酵作用同时进行，采用较低的温度，让糖化作用和发酵作用同时进行， 即采用边糖化边发酵工艺（双边）即采用边糖化边发酵工艺（双边） 。 优点：优点：可防止发酵过程中的酸败；可防止发酵过程中的酸败；防止酶在高温下钝化；防止酶

87、在高温下钝化；有利于酒香味的保存和甜味物质的增加。有利于酒香味的保存和甜味物质的增加。 3、多菌种混合发酵、多菌种混合发酵 2、配醅蓄桨发酵、配醅蓄桨发酵 减少一部分酒糟，增加一部分新料，配醅蓄桨继续发酵，减少一部分酒糟，增加一部分新料，配醅蓄桨继续发酵，反复多次。一般新料与醅的比例为反复多次。一般新料与醅的比例为1：34.5。 作用：既可使淀粉得到充分利用，又能调节淀粉和酸的浓度，作用：既可使淀粉得到充分利用，又能调节淀粉和酸的浓度，还可以增加微生物营养和风味物质。还可以增加微生物营养和风味物质。 固态法白酒在整个生产中都是敞口操作，空气、水、工具、固态法白酒在整个生产中都是敞口操作，空气、

88、水、工具、窖地等各种渠道都能将大量的、多种多样的微生物带入到醅中，窖地等各种渠道都能将大量的、多种多样的微生物带入到醅中，它们将与曲中的有益微生物协同作用，产生出丰富的香味物质。它们将与曲中的有益微生物协同作用，产生出丰富的香味物质。 4、固态蒸馏、固态蒸馏 固态法白酒的蒸馏是将发酵后的固态酒醅装入传统固态法白酒的蒸馏是将发酵后的固态酒醅装入传统 的蒸馏备的蒸馏备 甑，进行蒸馏。甑，进行蒸馏。 由于具有雾沫夹带作用，蒸出的白酒质量较好。由于具有雾沫夹带作用，蒸出的白酒质量较好。 这种蒸馏方式不仅是浓缩分离酒精的过程，而且也是香味这种蒸馏方式不仅是浓缩分离酒精的过程，而且也是香味 物的提取和重新组合的过程。物的提取和重新组合的过程。 5、界面效应、界面效应 在固态法白酒的生产过程中，窖内同时存在气相、液相、在固态法白酒的生产过程中，窖内同时存在气相、液相、固相三种状态，这种状态有利于微生物的繁殖与代谢，从而形固相三种状态，这种状态有利于微生物的繁殖与代谢，从而形成白酒特有的芳香。成白酒特有的芳香。 定义：同一微生物在同一相中的生长代谢与在不同界面上的定义：同一微生物在同一相中的生长代谢与在不同界面上的 代谢不同。代谢不同。 三三 大曲生产大曲生产