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1、实验实验三三质粒提取与电泳【实验目的实验目的】 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法。【实验原理实验原理】 碱碱裂裂解解法法提提取取质质粒粒是是根根据据共共价价闭闭合合环环状状质质粒粒DNADNA与与线线性性染染色色体体DNADNA在在拓拓扑扑学学上上的的差差异异来来分分离离它它们们。在在pHpH值值介介于于12.0-12.512.0-12.5这这个个狭狭窄窄的的范范围围内内，线线性性的的DNADNA双双螺螺旋旋结结构构解解开开而而被被变变性性，尽尽管管在在这这样样的的条条件件下下，共共价价闭闭环环质质粒粒DNADNA的的氢氢键键会会被被断断裂裂，但但两两条条互互补补链链彼彼此此相相互互
2、盘盘绕绕，仍仍会会紧紧密密地地结结合合在在一一起起。当当加加入入pHpH值值4.84.8的的乙乙酸酸钾钾高高盐盐缓缓冲冲液液恢恢复复pHpH至至中中性性时时，共共价价闭闭合合环环状状的的质质粒粒DNADNA的的两两条条互互补补链链仍仍保保持持在在一一起起，因因此此，复复性性迅迅速速而而准准确确，而而线线性性的的染染色色体体DNADNA的的两两条条互互补补链链彼彼此此己己完完全全分分开开，复复性性就就不不会会那那么么迅迅速速而而准准确确，它它们们缠缠绕绕形形成成网网状状结结构构，通通过过离离心心，染染色色体体DNADNA分分子子与与不不稳稳定定的的大大分分子子RNARNA，蛋蛋白白质质-SDS-
3、SDS复复合合物物等等一起沉淀下来而被除去。一起沉淀下来而被除去。【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】( (一一一一) ) 仪器仪器仪器仪器1.1.恒温培养箱恒温培养箱2.2.恒温摇床恒温摇床3.3.台式离心机台式离心机4.4.高压灭菌锅高压灭菌锅5.5.电泳仪、电泳槽电泳仪、电泳槽6.6.分光光度仪分光光度仪7.7.凝胶成像系统凝胶成像系统( (二二二二) ) 材料材料材料材料1.1.葡萄糖葡萄糖2.2.三羟甲基氨基甲烷（三羟甲基氨基甲烷（TrisTris）3.3.乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸(EDTA)(EDTA)4.4.氢氧化钠氢氧化钠5.5.十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)
4、6.6.乙酸钾乙酸钾7.7.冰乙酸冰乙酸8.8.氯仿氯仿9. 乙醇10胰RNA酶11氨苄青霉素12蔗糖13溴酚蓝14酚15. 含pUC19质粒的大肠杆菌16吸头、小指管( (三三三三) ) 试剂试剂试剂试剂1. 1. 溶液溶液I I 50 mmol/L 50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（三羟甲基氨基甲烷（TrisTris）TrisHCl (pH8.0)TrisHCl (pH8.0) 10 mmol/L 10 mmol/L 乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8.0)(EDTA) (pH8.0)2. 2. 溶液溶液II II 0.
5、4 mol/L NaOH, 2% SDS, 0.4 mol/L NaOH, 2% SDS, 用前等体积混合用前等体积混合3. 3. 溶液溶液III III 5mol/L 5mol/L 乙酸钾乙酸钾 60 mL60 mL 冰乙酸冰乙酸 11.5 mL11.5 mL 水水 28.5 mL28.5 mL4. TE4. TE缓冲液缓冲液 10 mmoL/L TrisHCl (pH8.0)10 mmoL/L TrisHCl (pH8.0) 1 mmoL/L EDTA (pH8.0) 1 mmoL/L EDTA (pH8.0)5. 70%5. 70%乙醇乙醇 ( (放放-20-20冰箱中冰箱中, ,用后即
6、放回用后即放回) )6. 6. 胰胰RNARNA酶酶 将将RNARNA酶溶于酶溶于10mmoL/L TrisHCl(pH7.5)10mmoL/L TrisHCl(pH7.5)、15mmoL/L 15mmoL/L NaCl NaCl中中, , 配成配成10mg/mL10mg/mL的浓度的浓度, , 于于100100加热加热15min, 15min, 缓缓 慢冷却至室温慢冷却至室温, ,保存于保存于-20-20。7. 7. 凝胶加样缓冲液（凝胶加样缓冲液（6X6X）：）：40%40%蔗糖、蔗糖、0.25%0.25%溴酚兰。溴酚兰。【实验步骤实验步骤】1. 1. 将将2 2 mlml含含相相应应抗抗
7、生生素素（AmpAmp：50g/mL50g/mL）的的LBLB液液体体培培养养基基加加入入到到试试管管中中，接接入入上上述述的的含含pUC19pUC19质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌，3737振荡培养过夜。振荡培养过夜。2. 2. 取取1.5 mL1.5 mL培养物倒入微量离心管中，培养物倒入微量离心管中，4000 r/min4000 r/min离心离心2min2min。3. 3. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4. 4. 将将细细菌菌沉沉淀淀悬悬浮浮于于100L100L溶溶液液中中 ( (此此处处可可加加5L 5L 浓浓度度为为10g/L 10g/L RN
8、ase RNase A A处处 理理 RNARNA， 在在 后后 面面 TETE中中 就就 不不 必必 加加RNase A), RNase A), 充分混匀，室温放置充分混匀，室温放置10 min10 min。5. 5. 加加200L200L溶溶液液（新新鲜鲜配配制制），盖盖紧紧管管盖盖，混混匀匀内溶物，将离心管放冰上内溶物，将离心管放冰上5 min5 min。6. 6. 加加入入150L150L溶溶液液（冰冰上上预预冷冷），盖盖紧紧管管口口，颠颠倒数次使混匀，冰上放置倒数次使混匀，冰上放置15 min15 min。7. 7. 12000 12000 r/minr/min离离心心15min15
9、min，将将上上清清转转至至另另一一离离心心管管中。中。8. 8. 向向上上清清中中加加入入等等体体积积酚酚: :氯氯仿仿（1:11:1）或或氯氯仿仿: :异异戊戊醇醇(24:1)(24:1)（去去蛋蛋白白），反反复复混混匀匀，12000 12000 r/minr/min离离心心5 min5 min，将上清转移到另一离心管中。，将上清转移到另一离心管中。9. 9. 向向上上清清中中加加入入2 2倍倍体体积积无无水水乙乙醇醇，混混匀匀后后，室室温温放放置置5 510 10 minmin。12000 12000 r/minr/min离离心心5 5 minmin。倒倒去去上上清清液液，把把离离心心管
10、管倒倒扣在吸水纸上，吸干液体。扣在吸水纸上，吸干液体。10. 10. 用用1 1 mL mL 7070乙乙醇醇洗洗涤涤质质粒粒DNADNA沉沉淀淀，振振荡荡并并离离心心，倒倒去去上清液，真空抽干或空气中干燥。上清液，真空抽干或空气中干燥。11. 11. 加加50L 50L TETE缓缓冲冲液液，( (其其中中含含有有20g/mL20g/mL的的胰胰RNARNA酶酶) )，使使DNADNA完全溶解，完全溶解，-20-20保存。保存。12. 12. 紫紫外外分分光光光光度度计计测测定定DNADNA样样品品浓浓度度(1L (1L DNA DNA + + 49L 49L H2O)H2O)。13. 13. 电电泳泳检检测测DNADNA样样品品(1-2L (1-2L DNA DNA + + 1L 1L loading loading buffer buffer + + 3-3-4L H2O)4L H2O)【实验结果实验结果】1. 根据测定的样品在260 的OD值，计算样品DNA浓度，2. 在紫外光下观察到在凝胶上约2.7 kb处有条带，即pUC19质粒。【实验安排实验安排】本实验在一天内完成。
