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1、大连理工大学 环境与生命学院1.1.实验目的实验目的掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法。及线粒体的方法。掌握细胞核及线粒体的活体鉴定方法。掌握细胞核及线粒体的活体鉴定方法。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院2.2.实验原理实验原理1 1 1 1）分级差速离心）分级差速离心）分级差速离心）分级差速离心 在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的
2、沉降速度在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，
3、就能够使同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。 细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、
4、核细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。糖体和大分子。糖体和大分子。糖体和大分子。 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液。悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液。悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液。悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院2.2.实验原理实验原理2 2 2 2）染色原理）染色原理）染色原理）染色原理 詹纳斯绿可专一性地对对线粒体进行活染詹纳斯绿可专一性地对对线粒体进行活染詹纳斯绿可专一性地对对线粒体进行活染詹纳斯绿可专一性地对对线粒体进行活染, , , ,这是
5、由于线这是由于线这是由于线这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态状态状态状态( ( ( (即有色状态即有色状态即有色状态即有色状态),),),),呈蓝绿色。呈蓝绿色。呈蓝绿色。呈蓝绿色。 GimesaGimesaGimesaGimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液
6、中电离为带正电和负电的染料离子。物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院3.3.实验材料、用品实验材料、用品 实验材料：实验材料：实验材料：实验材料：鼠肝脏鼠肝脏鼠肝脏鼠肝脏,猪肝脏猪肝脏猪肝脏猪肝脏 实验用品：实验用品：实验用品：实验用品：试剂：试剂：试剂：试剂：(1(1(1(1）0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖-0.01mol/L-0.
7、01mol/L-0.01mol/L-0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷(Tris)-(Tris)-(Tris)-(Tris)-盐酸缓冲液盐酸缓冲液盐酸缓冲液盐酸缓冲液(pH7.4) (2)0.34mol/L(pH7.4) (2)0.34mol/L(pH7.4) (2)0.34mol/L(pH7.4) (2)0.34mol/L蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖-0.01mol/LTris-0.01mol/LTris-0.01mol/LTris-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（盐酸缓冲液（盐酸缓冲液（盐酸缓冲液（pH7.4pH7.4pH7.4pH7.4）。）。
8、）。）。(3)1%(3)1%(3)1%(3)1%詹纳斯绿詹纳斯绿詹纳斯绿詹纳斯绿B(Janus green B)B(Janus green B)B(Janus green B)B(Janus green B)染液染液染液染液, , , ,称取称取称取称取50mg50mg50mg50mg（pH7.4pH7.4pH7.4pH7.4）, , , ,詹纳斯绿詹纳斯绿詹纳斯绿詹纳斯绿B B B B溶溶溶溶于于于于5ml5ml5ml5ml生理盐水中生理盐水中生理盐水中生理盐水中, , , ,稍微加热使之溶解后稍微加热使之溶解后稍微加热使之溶解后稍微加热使之溶解后, , , ,过滤过滤过滤过滤, , , ,
9、即为即为即为即为1%1%1%1%原液。原液。原液。原液。(4)(4)(4)(4)姬姆萨染姬姆萨染姬姆萨染姬姆萨染液（液（液（液（GiemsaGiemsaGiemsaGiemsa）。）。）。）。 (5)1/15 mol/L (5)1/15 mol/L (5)1/15 mol/L (5)1/15 mol/L磷酸缓冲液。（磷酸缓冲液。（磷酸缓冲液。（磷酸缓冲液。（pH6.8pH6.8pH6.8pH6.8）(6)(6)(6)(6)卡诺卡诺卡诺卡诺（CornayCornayCornayCornay）固定液：无水乙醇）固定液：无水乙醇）固定液：无水乙醇）固定液：无水乙醇6 ml6 ml6 ml6 ml冰醋
10、酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸1 ml1 ml1 ml1 ml氯仿氯仿氯仿氯仿3 ml (7)3 ml (7)3 ml (7)3 ml (7)生理盐水。生理盐水。生理盐水。生理盐水。仪器及用具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，仪器及用具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，仪器及用具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，仪器及用具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，显微镜，显微镜，显微镜，牙签，冷冻高速离心机。牙签，冷冻高速离心机。牙签，冷冻高速离心机。牙签，冷冻高速离心机。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物
11、科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院4.4.实验步骤实验步骤 4.1 4.1 4.1 4.1 制备肝细胞匀浆：制备肝细胞匀浆：制备肝细胞匀浆：制备肝细胞匀浆： 实验前将鼠空腹实验前将鼠空腹实验前将鼠空腹实验前将鼠空腹12121212小时，击头处死，剖腹小时，击头处死，剖腹小时，击头处死，剖腹小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织水，称取肝组织水，称取肝组织水，称取肝组织1 g1 g1 g1 g，剪碎；用预冷，剪碎
12、；用预冷，剪碎；用预冷，剪碎；用预冷0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加9 ml9 ml9 ml9 ml预冷预冷预冷预冷的的的的0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在液，在液，在液，在04040404冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀冰浴中用玻璃匀浆器将
13、肝制成匀冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，肝匀浆用双层纱布过滤浆，肝匀浆用双层纱布过滤浆，肝匀浆用双层纱布过滤浆，肝匀浆用双层纱布过滤( ( ( (滤液制一张涂片滤液制一张涂片滤液制一张涂片滤液制一张涂片,自然干燥自然干燥自然干燥自然干燥).).).).生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院4.2 4.2 4.2 4.2 分离细胞核分离细胞核分离细胞核分离细胞核 鼠肝鼠肝鼠肝鼠肝1 1 1 1克匀浆克匀浆克匀浆克匀浆 匀浆过滤匀浆过滤匀浆过滤匀浆过滤 滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张） 将滤液将
14、滤液将滤液将滤液4.5mL4.5mL4.5mL4.5mL覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的0.34mol/L0.34mol/L0.34mol/L0.34mol/L蔗糖溶液上蔗糖溶液上蔗糖溶液上蔗糖溶液上 700g 700g 700g 700g离心离心离心离心10min 10min 10min 10min 沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片） 上清液上清液上清液上清液1(1(1(1(制一张涂片制一张涂片制一张涂片制一张涂片,自然干燥自然干燥自然干燥自然干燥) ) ) ) 洗涤（洗涤（洗涤（洗涤（0.25mol/L0.25m
15、ol/L0.25mol/L0.25mol/L预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液5mL5mL5mL5mL洗涤两次）每次洗涤两次）每次洗涤两次）每次洗涤两次）每次1000g1000g1000g1000g离心离心离心离心15min 15min 15min 15min 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）沉淀（细胞核） 上清液上清液上清液上清液2(2(2(2(与上清液与上清液与上清液与上清液1 1 1 1合并合并合并合并) 鼠肝鼠肝鼠肝鼠肝1 1 1 1克匀浆克匀浆克匀浆克匀浆 匀浆过滤匀浆过滤匀浆过滤匀浆过滤 滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张） 将
16、滤液将滤液将滤液将滤液4.5mL4.5mL4.5mL4.5mL覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的0.34mol/L0.34mol/L0.34mol/L0.34mol/L蔗糖溶液上蔗糖溶液上蔗糖溶液上蔗糖溶液上 700g 700g 700g 700g离心离心离心离心10min 10min 10min 10min 沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片） 上清液上清液上清液上清液1(1(1(1(制一张涂片制一张涂片制一张涂片制一张涂片,自然干燥自然干燥自然干燥自然干燥) ) ) ) 洗涤（洗涤（洗涤（洗涤（0.25mol/L0.
17、25mol/L0.25mol/L0.25mol/L预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液5mL5mL5mL5mL洗涤两次）每次洗涤两次）每次洗涤两次）每次洗涤两次）每次1000g1000g1000g1000g离心离心离心离心15min 15min 15min 15min 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）沉淀（细胞核） 上清液上清液上清液上清液2(2(2(2(与上清液与上清液与上清液与上清液1 1 1 1合并合并合并合并) 鼠肝鼠肝鼠肝鼠肝1 1 1 1克匀浆克匀浆克匀浆克匀浆 匀浆过滤匀浆过滤匀浆过滤匀浆过滤 滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张
18、） 将滤液将滤液将滤液将滤液4.5mL4.5mL4.5mL4.5mL覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的0.34mol/L0.34mol/L0.34mol/L0.34mol/L蔗糖溶液上蔗糖溶液上蔗糖溶液上蔗糖溶液上 700g 700g 700g 700g离心离心离心离心10min 10min 10min 10min 沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片） 上清液上清液上清液上清液1(1(1(1(制一张涂片制一张涂片制一张涂片制一张涂片,自然干燥自然干燥自然干燥自然干燥) ) ) ) 洗涤（洗涤（洗涤（洗涤（0.25mol/
19、L0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液5mL5mL5mL5mL洗涤两次）每次洗涤两次）每次洗涤两次）每次洗涤两次）每次1000g1000g1000g1000g离心离心离心离心15min 15min 15min 15min 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）沉淀（细胞核） 上清液上清液上清液上清液2(2(2(2(与上清液与上清液与上清液与上清液1 1 1 1合并合并合并合并) 鼠肝鼠肝鼠肝鼠肝1 1 1 1克匀浆克匀浆克匀浆克匀浆 匀浆过滤匀浆过滤匀浆过滤匀浆过滤 滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张滤液（制涂片一张滤液（制涂
20、片一张） 将滤液将滤液将滤液将滤液4.5mL4.5mL4.5mL4.5mL覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的覆盖于相同容积的0.34mol/L0.34mol/L0.34mol/L0.34mol/L蔗糖溶液上蔗糖溶液上蔗糖溶液上蔗糖溶液上 700g 700g 700g 700g离心离心离心离心10min 10min 10min 10min 沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片）沉淀（细胞核及碎片） 上清液上清液上清液上清液1(1(1(1(制一张涂片制一张涂片制一张涂片制一张涂片,自然干燥自然干燥自然干燥自然干燥) ) ) ) 洗涤（洗涤（洗涤（洗涤（0.25m
21、ol/L0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液5mL5mL5mL5mL洗涤两次）每次洗涤两次）每次洗涤两次）每次洗涤两次）每次1000g1000g1000g1000g离心离心离心离心15min 15min 15min 15min 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）沉淀（细胞核） 上清液上清液上清液上清液2(2(2(2(与上清液与上清液与上清液与上清液1 1 1 1合并合并合并合并)生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院4.3 4.3 4.3 4.3 分离
22、线粒体分离线粒体分离线粒体分离线粒体 混合上清液混合上清液混合上清液混合上清液10000g10000g10000g10000g离心离心离心离心10min10min10min10min 沉淀（线粒体）沉淀（线粒体）沉淀（线粒体）沉淀（线粒体） 上清液（弃上清液（弃上清液（弃上清液（弃去）去）去）去） 洗涤，加洗涤，加洗涤，加洗涤，加 0.25mol/L 0.25mol/L 0.25mol/L 0.25mol/L预蔗糖溶预蔗糖溶预蔗糖溶预蔗糖溶10mL ,10000g10mL ,10000g10mL ,10000g10mL ,10000g离心离心离心离心10min,10min,10min,10mi
23、n, 重复洗涤两次重复洗涤两次重复洗涤两次重复洗涤两次 沉淀（线粒体）沉淀（线粒体）沉淀（线粒体）沉淀（线粒体） 上清液（制一张涂片上清液（制一张涂片上清液（制一张涂片上清液（制一张涂片后弃去）后弃去）后弃去）后弃去）生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室涂片方法示意图涂片方法示意图涂片方法示意图涂片方法示意图 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院4.4 4.4 分离物鉴定分离物鉴定细细细细胞胞胞胞核核核核：将将将将干干干干燥燥燥燥后后后后的的的的三三三三张张张张涂涂涂涂片片片片加
24、加加加入入入入CarnoyCarnoyCarnoyCarnoy固固固固定定定定液液液液15min15min15min15min，晾晾晾晾干干干干。GiemsaGiemsaGiemsaGiemsa染染染染液液液液染染染染10min,10min,10min,10min,蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水漂漂漂漂洗洗洗洗数数数数秒秒秒秒，用用用用滤滤滤滤纸纸纸纸吸吸吸吸干干干干水水水水，用用用用显显显显微微微微镜镜镜镜（40404040）检检检检查。查。查。查。线线线线粒粒粒粒体体体体：取取取取线线线线粒粒粒粒体体体体沉沉沉沉淀淀淀淀滴滴滴滴在在在在载载载载玻玻玻玻片片片片上上上上，勿勿勿勿太太太太密密密密。
25、滴滴滴滴加加加加 1%1%1%1%詹詹詹詹纳纳纳纳斯斯斯斯绿绿绿绿溶溶溶溶液液液液染染染染色色色色，10101010分分分分钟钟钟钟后后后后用用用用光光光光学学学学显显显显微镜观察。微镜观察。微镜观察。微镜观察。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院4.5 4.5 线粒体的超活染色与观察线粒体的超活染色与观察 口口口口腔腔腔腔上上上上皮皮皮皮细细细细胞胞胞胞线线线线粒粒粒粒体体体体的的的的超超超超活活活活染染染染色色色色：1/50001/50001/50001/5000詹詹詹詹纳纳纳纳斯斯斯斯绿绿绿绿B1-2B1-2B1-2
26、B1-2滴滴滴滴，口口口口腔腔腔腔上上上上皮皮皮皮细细细细胞胞胞胞（牙牙牙牙签签签签刮刮刮刮取取取取），载载载载玻玻玻玻片片片片于于于于37373737恒恒恒恒温温温温染染染染色色色色10-15min10-15min10-15min10-15min，显微镜下观察。，显微镜下观察。，显微镜下观察。，显微镜下观察。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院5.5.实验结果实验结果细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。碎片。线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。 生物科
27、学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院口腔上皮细胞的线粒体分布口腔上皮细胞的线粒体分布口腔上皮细胞的线粒体分布口腔上皮细胞的线粒体分布生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院6.6.注意事项注意事项分离全过程要在分离全过程要在0 044进行，如果使用非进行，如果使用非冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织，缩短匀浆时间。整个分能充分破碎组织，缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。离过程不宜过长。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院7.7.思考题思考题要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
