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1、微生物反应动力学主主讲：罗剑飞 学学时：8微生物反应动力学l概论l细胞反应过程计量学l分批培养动力学1.细胞生长动力学2.基质消耗动力学3.产物生成动力学l连续培养动力学1、概论1.1微生物的分类微生物（Microorganism）是对所有形体微小的单细胞，或细胞结构较为简单的多细胞，或没有细胞结构的低等生物的通称。不具细胞结构：病毒、类病毒、朊病毒原核微生物：细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、蓝细菌等；真核微生物：酵母菌、霉菌、担子菌、藻类等.Eubacteria（真细菌界）Archaebacteria（古细菌界）Eukarya（真核生物界）CarlWoese利用rRNA建立分子进化
2、树分类单元及其等级界（Kingdom）门（Phylum）纲（Class）目（Order）科（Family）属（Genus）种（Species）根据CarlWoese的理论，现在还在界之上使用域(domain)域（Domain）把全部生物先分为古生菌域、细菌域和真核生物域；只有真核生物域下再分为原生生物界、真菌界、动物界和植物界。1.2微生物的化学组成微生物菌体的80%左右是水分。湿菌体（wetcellmass）所含水分是指菌体在100前后干燥直到恒重时减少的量。除去水分的菌体称为干菌体（drycellmass）。微生物菌体中除水分外，其余为蛋白质、碳水化合物、脂肪、核酸、维生素和无机物等化学物
3、质。细胞中某些元素（除碳、氧、氮和氢外）的含量，一般以磷、钾为多，其次是钙、镁、硫、钠、氯、铁、锌、硅等。另外，还含有微量的铝、铜、锰、钴等。1.3微生物的生长特性由于微生物种类各异，不同微生物的生长特性亦有很大差别。细菌以分裂方式进行的繁殖。在适宜的生长条件下，某些细菌的世代时间可达1020min。然而，比较典型的世代时间为4060min。当细菌分裂为二分裂时，世代时间等于倍增时间（菌体量增加一倍所需时间）。酵母菌的生长方式有出芽繁殖、裂殖和芽裂（如同菌丝生长）三种。在最适条件下，酵母在45min内就可以分裂，比较典型的分裂时间为90120min。霉菌的生长特性是菌丝伸长和分枝。从菌丝体（顶
4、端生长）的顶端细胞间形成隔膜进行生长，一旦形成一个细胞，它就保持其完整性。霉菌的倍增时间可短至6090min，但典型的霉菌倍增时间为48h。微生物的特点：个体小，比表面积大个体小，比表面积大吸收多，转化快吸收多，转化快生长旺，繁殖快生长旺，繁殖快适应强，变异快适应强，变异快分布广，种类多分布广，种类多1.4微生物与发酵工业u发酵过程利用微生物作为动力，生产某种特定产物的生物化学过程。u发酵产品酿造食品，酒精饮料，有机酸，核苷酸，氨基酸类物质，酶制剂，抗生素，有机溶剂其它化工产品，营养和生长必需物质，生物制药。1.5微生物反应的主要特征反应主体是活的细胞，能调节自己以适应环境变化（有氧和无氧）细
5、胞反应过程的本质是复杂的酶催化反应体系细胞反应与酶催化反应有明显的不同，细胞反应可再生，细胞不同生长阶段有不同的催化活性，等对细胞反应过程的量化分析，必须解决反应过程中涉及的各种物料和能量的数量比例关系及反应过程速率问题，前一个涉及的是反应计量学，后一个则是反应过程动力学。1.6微生物反应动力学研究目的微生物工程的基本任务是高效地利用微生物所具有的内在生产力，以较低的能耗和物耗最大限度地生产生物产品，因此必须对微生物反应的整个过程实现有效的控制。微生物动力学为这一目的提供了部分理论依据。1.7微生物反应动力学研究内容微生物反应动力学是研究生物反应速度的规律，即细胞生长速率、基质利用速率和产物生
6、成速率的变化规律。基质（碳源）细胞产物1.8微生物反应动力学研究方法用数学模型定量地描述生物反应过程中细胞生长速率、基质利用速率和产物生成速率等因素变化，达到对反应过程有效控制。微生物反应动力学l概论l细胞反应过程计量学l分批培养动力学1.细胞生长动力学2.基质消耗动力学3.产物生成动力学l连续培养动力学2、细胞反应过程计量学反应计量学是对反应物的组成和反应转化速度的数量化研究，它与反应热力学和动力学一起构成反应工程学的理论基础。根据反应计量学，可知反应过程中各反应组分组成的变化规律以及各反应之间的数量关系。2.1研究计量学的目的及计量学特点碳源能源、细胞材料中间产物丙酮酸构成细胞材料氨基酸、
7、核苷酸等细胞ADPATPATPADPATPADP代谢产物乙醇、CO2最低培养基时微生物对碳源的利用异化（H）H2O厌氧好氧细胞材料氨基酸等中间产物丙酮酸细胞ATPADP代谢产物乙醇、CO2完全培养基时微生物对碳源的利用碳源能源ATPADP异化异化C2O计量的不确定性反应物生成物(碳、氮、磷、(生物量、产物、硫等营养源及前体)副产物、能量)反应主体是活的生命，能调节自己以适应环境变化（有氧和无氧）代谢网络中包含上千个反应，机理复杂，常采用经验模型速率间不象酶反应存在简单关系，因此须研究反应计量学。（常用速率：细胞生长、底物（氧消耗、产物（CO2）生成反应物的不确定性、细胞的不确定性、生成物的不确
8、定性.2.2细胞生长的测定和计量微生物生长的测定，通常是测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量或大小。细胞生长的方法，可测定细胞数、细胞重量、细胞内含物等。2.2.1直接计数法培养计数法：在合适的培养基上用Petridishes培养，数菌落数。时间要2030小时，计数为活细胞。CFU(Colonyformingunit)膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。2.2.1直接计数法显微计数法：在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长。2.
9、2.1直接计数法细胞干重：(g/L)，DCW(Drycellweight)，离心烘干恒重；80，24小时；110，8小时。2.2.1直接计数法浊度法：常用波长500700nm，线性区为0.31吸光率单位。例如：某细菌悬浮液在520nm测得光密度和干菌重的关系为：1.75OD相当于1mg/mL菌量。2.2.2间接方法细胞堆积容积测量法：用锥形刻度管测量经离心的细胞沉淀物的容积，由此间接表示细胞重量的生长细胞组成分析法：测定一种大分子的细胞组成(蛋白质、RNA、DNA等)，间接地算出细胞重量的生长qPCR荧光原位杂交法FISH：2.3细胞反应的计量式和元素平衡System:FixedAmounto
10、fCellMaterialSubstratesProductsCells维持生成产物x1-xx变化则计量系数改变，在发酵过程更常用得率概念。微生物反应过程中的质量衡算:碳源氮源氧菌体有机产物CO2H2O为了表示出微生物反应过程中各物质和各组分之间的数量关系，最常用的方法是对各元素进行原子衡算。如果碳源由C、H、O组成，氮源为NH3，细胞的分子式定义为CHxOyNz，忽略其他微量元素P,S和灰分等，此时用碳的定量关系式表示微生物反应的计量关系是可行的。基于元素平衡分析速率间关系C: 1=c+d+fH: m+3b=c+xd+2eO: n+2a=c+yd+e+2fN: b=c+zd6个待定计量系数，
11、4个方程，自由度为2，已知2计量系数即可求出其它系数。若无产物，则由两个速率即可确定其它速率，但不是任意的两个速率（可观测性）。由c可确定a和f的值从而可得出呼吸熵与细胞得率的关系，对发酵过程状态检测很有意义。碳源氮源氧菌体有机产物CO2H2O菌体的元素分析-酵母干物质中的元素百分组成C3.92H6O2.03N0.61近似为C4H6O2N0.6微生物细胞的元素组成可通过元素分析方法测定例：葡萄糖为基质进行面包酵母(S.cerevisiae)培养，培养的反应式可用下式表达，求计量关系中的系数a,b,c,d.2.4细胞反应过程中的得率系数细胞反应过程中两种速率之比，得率系数可用于对细胞反应过程中碳
12、源等物质生成细胞或其它产物的潜力进行定量评价，最常用的得率系数有对底物的细胞得率Yx/s，对碳的细胞得率Yc，对氧的细胞得率系数Yx/O等。对底物的细胞得率Yx/s消耗1g基质生成细胞的克数称为细胞得率或称生长得率(cellyield或growthyield)。同一菌种，同一培养基，好氧培养的Yx/s比厌氧培养的大得多。另外同一菌株在基本、合成和复合培养基中培养所得Yx/s大小顺序为复合培养基合成培养基基本培养基。对碳的细胞得率YC当基质为碳源，无论是好氧培养还是厌氧培养，碳源的一部分被同化为细胞的组成成分，其余部分被异化分解为CO2和代谢产物。理论得率：仅考虑细胞生长所消耗的基质例：葡萄糖为
13、碳源，NH3为氮源，进行某种细菌的好氧培养，消耗的葡萄糖中有2/3的碳源转化为细胞中的碳。反应式为：计算上述反应中的得率系数Yx/s和Yx/o对能量的细胞得率YATP细胞异化代谢过程中每生成1molATP所增加的细胞量。大量研究发现，厌氧培养时，YATP与细胞、底物的种类无关，基本上为常数10.同化：SX异化：SATPYATPYATP/s对氧的细胞得率YX/O对底物的产物得率YP/S此外，微生物反应动力学l概论l细胞反应过程计量学l分批培养动力学1.细胞生长动力学2.基质消耗动力学3.产物生成动力学l连续培养动力学3、分批培养动力学细胞反应过程包括细胞的生长、底物的消耗和代谢产物的生成，要定量
14、描述细胞反应过程的速率，细胞生长动力学是其核心。System:FixedAmountofCellMaterialSubstratesProductsCells45非生命体系非生命体系生命体系生命体系培养环境培养环境l多组分多组分l液相反应液相反应l酸碱平衡酸碱平衡lpH, T等变化等变化l液体流变学变化液体流变学变化l多相多相 (气、固、液气、固、液)l空间的非均一性空间的非均一性细胞体细胞体l多组分多组分l细胞异质性细胞异质性l多反应体系多反应体系l受基因调控受基因调控l自适应自适应l随机性随机性l遗传不稳定性遗传不稳定性营养成分营养成分 底物底物产物产物热量热量机械机械相互作用相互作用u细
15、胞消耗营养成分，将培养环境中的细胞消耗营养成分，将培养环境中的底物底物转化为转化为产物产物。u细胞在生命活动中产生细胞在生命活动中产生热量热量，与此同时，通过设置培养环境的温，与此同时，通过设置培养环境的温度控制细胞的生长或产物合成。度控制细胞的生长或产物合成。u细胞生长、增殖和代谢产物的积累，使培养环境的流变学性质细胞生长、增殖和代谢产物的积累，使培养环境的流变学性质(固固含量、粘度含量、粘度)发生改变，细胞与培养环境之间的机械相互作用趋于发生改变，细胞与培养环境之间的机械相互作用趋于明显，对于动物细胞培养过程的影响尤为显著。明显，对于动物细胞培养过程的影响尤为显著。细胞的生长是一个复杂的生
16、物化学过程（胞内胞外的物质交换、多相的反应体系、多种营养成分、多种代谢产物等），对这样一个复杂的体系进行精确地描述是不可能的，为了工程上的应用，首先要进行合理的简化，在简化的基础上建立过程的物理模型，再据此推出其数学模型。简化的内容主要有：动力学是对细胞群体行为的描述，而不是对单一细胞；不考虑细胞之间的差别，建立的模型为确定论模型，考虑细胞间的差别，建立的模型为概率论模型；考虑细胞内部结构，建立的模型为结构模型，不考虑细胞内部结构，建立的模型为非结构模型；细胞与培养液分离，建立的模型为分离化模型，细胞与培养液均一，建立的模型为均一化模型。3.1细胞反应动力学分类细胞生长实际情况，复杂，应用困难
17、不考虑细胞差异，简化物质传递，是最理想的模型Monod方程包括分室模型、代谢模型和基因重组细胞生长模型应用很少3.2细胞反应过程中的速率和比速率速率(rate)：单位时间内浓度、质量等的变化量rS、rP、rX比速率(specificrate)：单位质量细胞所引起的速率变化。、qS、qO2比生长速率是菌体繁殖速率与培养基中菌体浓度之比，它与微生物的生命活动有联系速率(rate)、比速率(specificrate)和细胞浓度(concentration)的关系细胞生长比速率底物消耗比速率氧气消耗比速率CO2生成比速率反应热生成比速率3.3细胞生长动力学1）初始期（t=0tL)3）对数/指数生长期（
18、t=tLtC)4）减速期（t=tCtD)5）稳定期（t=tDtF)6）衰亡期（t=tFte)分批培养：在封闭培养系统中，一次投料、一次接种、一次收获的间歇培养方式。延滞期接种后，细胞的生长进入延滞期。这个期间是细胞的适应调整期，细胞在一个新的环境中生存，需要根据新环境的营养特点重新调整细胞体内的酶系及代谢过程，以使自身能适应新的环境并开始生长和繁殖。延滞期长的危害生长缓慢，合成代谢产物时间长染菌风险如何缩短延滞期种子活化接种对数期的种子适当加大接种量优化培养基组成加入生长因子（微量元素、维生素）当培养基中含有多种碳源时，可能会有多个延滞期的出现。当一种碳源被利用完后，细胞还需重新调整细胞体内的
19、酶系和代谢途径以适应另一种碳源的利用，这需要一个调整的过程。二次生长二次生长现象：大肠杆菌在含乳糖和葡萄糖的培养基中，优先利用葡萄糖，并只有当葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就形成了在两个对数生长期中间的第二个生长停滞期。腺苷酸环化酶腺苷酸环化酶乳糖操纵子模型解释分解代谢物的阻遏机制 对/指数期细胞数目和细胞内物质以相同速度增加，期间每个细胞的组成基本保持一致。可以通过测定细胞数量或细胞质量测定细胞的比生长速率。倍增时间(td)：细胞量增大一倍所需要的时间 代时一些细菌的代时菌名菌名培养基培养基培养温度培养温度 代时代时E. coli（大肠杆菌）（大肠杆菌） 肉汤肉汤 3717minE. col
20、i 牛奶牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）（产气肠细菌）肉汤或牛奶肉汤或牛奶 371618E. aerogenes 组合组合 372944B. Cereus（蜡状芽孢杆菌）（蜡状芽孢杆菌）肉汤肉汤3018B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌）（嗜热芽孢杆菌）肉汤肉汤5518.3Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）（嗜酸乳杆菌）牛奶牛奶376687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）（乳酸链球菌）牛奶牛奶3726S. lactis乳糖肉汤乳糖肉汤3748Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）
21、（伤寒沙门氏菌）肉汤肉汤3723.5Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）（褐球固氮菌）葡萄糖葡萄糖2534446Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合（结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）（活跃硝化杆菌）组合组合271200温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli在不同温度下的代时温度（）代时（分）温度（）代时（分）10860352215120371720904017.525404520302947.577例:以乙醇为唯一碳源进行产气气杆菌培养，菌体初始浓度X0=0.1Kg/m3，培养至
22、3.2h，菌体浓度为8.44Kg/m3，如果不考虑延迟期，比生长速率一定，求倍增时间td.减速期无抑制经过对数生长期细胞的大量繁殖，培养基中营养物质迅速消耗，有害物质逐渐积累，细胞的比生长速率逐渐下降，进入减速期。当培养基中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的比生长速率和限制性基质的浓度间的关系用Monod方程表示为：式中式中: S 限制性限制性基质浓度基质浓度; Km饱饱和常数和常数KS：monod饱和常数，物理意义为当比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性营养物质浓度，它的大小表示了微生物对营养物质的吸收亲和力大小。KS越大，表示微生物对营养物质的吸收亲和力越小，反之越大。Monod方程是
23、典型的均衡生长模型，其基本假设如下：u细胞的生长为均衡式生长，描述细胞生长的唯一变量是细胞浓度；u培养基中只有一种基质是生长限制性基质，其它组分过量，不影响细胞生长；u细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率为一常数。a:营养物质浓度很低，即SKS营养物质浓度很高。比生长速率与基质之间关系与S无关，零级反应。一些微生物的最大比生长速率和一些微生物的最大比生长速率和Monod饱和常数饱和常数Monod方程表述简单，它不足以完整地说明复杂的生化反应过程，并且已发现它在某些情况与实验结果不符，因此人们又提出了另外一些方程,归纳于下表：上述各方程，讨论的都是单一底物限制下细胞生长速率与底物浓度之间的关系
24、，但是实际反应中底物不止一种，而是多种，则动力学方程为：累加动力学相互影响动力学Monod方程与米氏方程的区别与联系Monod方程是对实验现象的总结：是经验方程米氏方程是根据酶反应动力推导得出：是机理方程Monod方程与米氏方程的相似性双倒数法求解参数双倒数求解双倒数求解例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l)63364153221(h-1)0.060.240.430.660.70求在该培养条件下，求大肠杆菌的max，KS和td?解：将数据整理得：S/100137.5148.8231.8311.3S63364153221由斜率为1/max，纵轴截距为KS/max可以求得：max
25、1.1(h-1);KS99mg/L，tdln2/max0.63SS/ 斜率为斜率为0.95截距为截距为90减速期有抑制底物抑制底物抑制K底物抑制常数减速期有抑制产物抑制产物抑制常见的代谢产物，乙醇、乳酸等都会抑制细胞的生长，此类抑制动力学的描述常在monod方程上加修饰因子，常见的产物抑制动力学表达式：稳定期在稳定期时,细胞的净生长速率为0,即生长速率=死亡速率但是在稳定期时，细胞仍保持着代谢活力并合成次级代谢产物,（非偶联型代谢产物）衰亡期在稳定期结束时，随着营养物耗竭，或者是有害代谢副产物的积累，导致细胞的生长进入死亡期。77细胞的死亡速率一般遵循一级反应动力学积分得到,式中，式中，CX活
26、细胞浓度活细胞浓度Kd 细胞死亡速率常数细胞死亡速率常数CS是稳定期时的细胞浓度是稳定期时的细胞浓度环境条件对细胞生长的影响温度TpH溶解氧DO微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用：一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响，另一方面，微生物生长繁殖也会影响和改变环境。研究环境因素与微生物之间的关系，可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面，同时防止它有害的一面。温度T影响酶活性和酶促反应速率。影响细胞膜的流动性，影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。生命存在的温度区间：-30300pHBacteria:38;Yeast36;mold37
27、微生物微生物 pH值值 最低最低 最适最适 最高最高Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌氧化硫硫杆菌 0.5 2.03.5 6.0Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌嗜酸乳杆菌 4.04.6 5.86.6 6.8Rhizobium japonicum 大豆根瘤菌大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11.0Azotobacter chroococcum 圆褐固氮圆褐固氮 4.5 7.47.6 9.0Nitrosomonas sp. 硝化单胞菌硝化单胞菌 7.0 7.88.6 9.4Acetobacter aceti 醋化醋杆菌醋化醋杆菌 4.04
28、.5 5.46.3 7.08.0Staphylococcus aureus 金黄葡球菌金黄葡球菌 4.2 7.07.5 9.3Chlorobium limicola 泥生绿菌泥生绿菌 6.0 6.8 7.0Thurmus aquaticus 水生栖热菌水生栖热菌 6.0 7.57.8 9.5Aspergillus niger 黑曲霉黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0一般放线菌一般放线菌 5.0 7.08.0 10.0一般酵母菌一般酵母菌 3.0 5.06.0 8.0不同微生物的生长pH值范围同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤
29、其重要。例：Aspergillusniger在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。环境pH影响细胞生长的机理：影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在pH6.5以上产甘油、酸。环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变：有机物分解：分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降；分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升
30、无机盐选择性吸收：铵盐吸收（(NH4)2SO4H2SO4），pH硝酸盐吸收(NaNO3NaOH)，pHNH4+被吸收被吸收NO3+被吸收被吸收DO微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌专性好氧菌: : 好氧菌好氧菌 微好氧菌：微好氧菌： 兼性厌氧菌兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌：耐氧厌氧菌： 厌氧菌厌氧菌 ( (专性专性) )厌氧菌：厌氧菌：3.4基质消耗动力学对基质的细胞得率Yx/s对氧的细胞得率Yx/o对基质的产物得率Yp/s细胞生长比速率基质消耗比速率产物生成比速率SS1菌体S2产物S3维持S（底物）X（菌体）P（产物）+维持物料
31、守恒如果限制性基质是碳源，所消耗掉的碳源中一部分形成细胞物质，一部分产生能量，一部分形成产物，则式中：YG细胞生长得率系数(g/mol)；(只用于细胞生长所消耗基质）m细胞的维持系数(mol/g.h)；YP产物得率系数(mol/mol)。(只用于产物生成所消耗基质）维持系数m是微生物菌株的一种特征值。对于特定的菌株、特定的基质和特定的环境因素（如温度、PH值等）是一个常数，故又称维持常数。维持系数越低，菌体的能量代谢效率越高。理论得率：YG-细胞的理论得率：基质完全转化为细胞时的细胞得率(g/g)，底物（基质）不提供能源，只用于菌体生长，例如无机盐、维生素等。YP-产物的理论得率：基质完全转化
32、为产物时的产物得率(g/g)，底物（基质）不提供能源，不维持细胞生长代谢，只用于产物合成。理论得率m:维持系数基质消耗动力学模型若生长阶段产物生成可以忽略，即若产物积累阶段菌体生长可以忽略，即t(h)S(kg/m3)X(kg/m3)040.000.11139.930.134239.830.18339.700.241439.500.323539.300.433639.100.581738.500.778837.801.04937.201.41035.401.871134.802.51232.903.351329.504.491427.206.001521.808.001617.1010.7179
33、.6014.1181.1117.919018.3例图示为微生物分批培养数据，求解微生物生长monod方程、细胞维持常数m，理论产率系数YG0246810121416182002468101214161820时间（h）细胞干重（ kg/m3 ）生长曲线t(h)S(kg/m3)X(kg/m3)040.000.10139.930.134239.830.18339.700.241439.500.323539.300.433639.100.581738.500.778837.801.04937.201.41035.401.871134.802.51232.903.351329.504.491427.20
34、6.001521.808.001617.1010.7179.6014.1181.1117.919018.30.0400.0540.0720.0960.1290.1730.2300.3110.4150.5500.7400.9951.3251.7552.3503.0503.6000.2990.2970.2970.2970.2980.2970.2950.2990.2960.2940.2960.2970.2950.2930.2940.2850.2553.3503.3643.3713.3653.3573.3683.3903.3443.3733.4003.3783.3673.3893.4193.4043.
35、5083.9170.0250.0250.0250.0250.0250.0260.0260.0260.0270.0280.0290.0300.0340.0370.0460.0580.104rx=dx/dtu=r/X1/u1/S双倒数求解双倒数求解Y=a+bXR2 = 0.941700.020.040.060.080.10.123.143.243.343.443.543.643.743.843.944.04t(h)S(kg/m3)X(kg/m3)040.000.11139.930.134239.830.18339.700.241439.500.323539.300.433639.100.58173
36、8.500.778837.801.04937.201.41035.401.871134.802.51232.903.351329.504.491427.206.001521.808.001617.1010.7179.6014.1181.1117.919018.30.0850.1150.1650.2000.2000.4000.6500.6501.2001.2001.2502.6502.8503.8505.0506.1007.9951/u2.1252.1302.2922.0831.5502.3122.8262.0902.8922.1821.6892.6632.1512.1942.1492.0002
37、.221rS=-dS/dt0.0400.0540.0720.0960.1290.1730.2300.3110.4150.5500.7400.9951.3251.7552.3503.0503.600rx=dx/dt3.3503.3643.3713.3653.3573.3683.3903.3443.3733.4003.3783.3673.3893.4193.4043.5083.917生长阶段产物生成可以忽略，即Y=a+bXR2 = 0.00003.143.243.343.443.543.643.743.843.944.0400.511.522.533.53.5产物生成动力学根据发酵过程分析，微生物
38、生长与产物合成存在以下三种关系：l与生长相关生长偶联型l与生长部分相关生长部分偶联型l与生长不相关无偶联型生长偶联型：产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果，菌体生长速率的变化与产物生成速率的变化相平行。乙醇发酵：葡萄糖乙醇部分生长偶联型：产物间接由能量代谢生成，不是底物的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物。柠檬酸发酵：无偶联型：产物生成与能量代谢不直接相关，通过细胞进行的独特的生物合成反应而生成。抗生素发酵：稳定期Pirt方程qa=0、b0：表示偶联型发酵qa0、b0：表示部分偶联型发酵qa0、b=0：表示非偶联型发酵a+b其它发酵动力学细胞死亡动力学氧消耗动力学CO2生成
39、动力学产物降解动力学代谢热生成动力学以上各方面不是孤立的，而是既相互依赖又相互制约，构成错综复杂、丰富多彩的发酵动力学体系。微生物反应动力学l概论l细胞反应过程计量学l分批培养动力学1.细胞生长动力学2.基质消耗动力学3.产物生成动力学l连续培养动力学4、连续培养动力学连续培养：指在培养过程中，连续地向发酵罐中加入培养基，同时以相同流速相同体积从发酵罐排出含有产品的培养液。为何设计连续培养？维持稳定期收获发酵产物连续发酵优点：1.提高设备利用率和单位时间产量，只保持一个稳定状态。2.发酵中各参数趋于稳定，便于自动控制。3.易于分期控制。可以在不同的罐中控制不同的条件。连续发酵缺点：1.菌种易退
40、化；2.易污染；3.营养物利用率低连续培养方式：恒成分培养；恒浓度培养、循环式、非循环式、单级和多级连续培养等。恒浊器与恒化器装置控制对象培养基培养基流速恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定连续培养方式：恒成分培养；恒浓度培养、循环式、非循环式、单级和多级连续培养等。单级培养方式：整个培养过程是在一个培养罐中完成的连续装置，单罐连续培养。多级培养方式：将多个搅拌罐反应器串联起来，前一反应器的出料作为后一反应器的进料，即成为多级连续培养系统，多罐连续培养。在进行任何连续培养的开始，都要先进行分批培养，让微生物在接种后生长繁殖达到一定细胞浓度，并
41、进入产物合成时期，然后才开始以恒定的流量向发酵罐加入培养液，同时以同样的流量排放出培养液，使发酵罐内培养液的体积保持恒定，微生物能持续生长并合成产物。4.1单级连续培养F,SF,S0 0,X,X0 0V,S,X,PV,S,X,PF,S,X,PF,S,X,P对细胞的计量流入的细胞流出的细胞+生长的细胞死去的细胞=积累的细胞F,SF,S0 0,X,X0 0V,S,X,PV,S,X,PF,S,X,PF,S,X,P对发酵反应器来说，细胞的物料平衡可表示为：F:液体流量m3/s；V:发酵罐培养液体积m3；X0:流入发酵罐的细胞浓度g/L；X:流出发酵罐的细胞浓度g/L；:比死亡速率h-1F,SF,S0
42、0,X,X0 0V,S,X,PV,S,X,PF,S,X,PF,S,X,P加入的培养基是新鲜的，无细胞，即X0=0；且在大多数培养中（或忽略细胞死亡），则：式中流量F与培养液体积V比称为稀释率，用D表示其含义是单位时间内加入的培养基体积占发酵罐内培养基体积的分率开始连续培养一段时间，进入稳态。培养液中的细胞、基质和产物浓度保持恒定，不再随时间变化。是一个表示M性质的参数；D是一个物性参数；单级连续培养有利于研究细胞在一定比生长速率下的特性。在一定范围内连续培养的比生长速率可通过稀释率来控制D:则，培养罐内细胞浓度不断增加，营养物质浓度随之减少D：则，罐内细胞浓度不断减少，最后导致X=0=D：则，
43、细胞浓度不随时间而变化，即培养达到稳定状态对限制性基质的物料平衡F,SF,S0 0,X,X0 0V,S,X,PV,S,X,PF,S,X,PF,S,X,P对发酵反应器来说，基质的物料平衡可表示为：流入的营养物流出的营养物生长消耗的营养物维持生命需要的营养物形成产物消耗的营养物=积累的营养物S0:流入发酵罐的营养物的浓度g/L；S:流出发酵灌的营养物的浓度g/L;：细胞比生长速率；qp：产物比生成速率；m：维持系数YX/S：细胞得率系数；YP/S：产物得率系数；当反应器中限制性基质的浓度保持恒定时，即恒化培养时，dS/dt=0，mXKS时，定义：细胞产率DX，则，连续培养过程中细胞生产速率若DX有
44、最大值，则需连续培养过程中所能得到的最大细胞产率为当S0KS时对产物的物料平衡F,SF,S0 0,X,X0 0V,S,X,PV,S,X,PF,S,X,PF,S,X,P对发酵反应器来说，产物的物料平衡可表示为：细胞合成产物+流入的产物流出的产物=积累的产物当连续发酵处于稳态，且流加的培养液中不含产物，则把多个发酵罐串联起来，各级反应器中进出口流量相等并恒定；各级反应器中的液体体积相等并恒定。(1)流入液瞬间混合均匀；(2)微生物细胞无死亡；(3)第一只罐中流加新鲜培养基；4.2多级串联连续培养F,SF,Sn n,X,Xn nV,S,X,PV,S,X,PF,S(n+1F,S(n+1),X(n+1)
45、,X(n+1),P(n+1),P(n+1) )F,SF,S1 1,X,X1 1V,S,X,PV,S,X,PF,S2,X2,F,S2,X2,P2P2F,SF,S0 0,X,X0 0V,S,X,PV,S,X,PF,S1,X1,F,S1,X1,P1P1发酵罐细胞物料平衡基质物料平衡产物物料平衡12n4.3细胞回流的单级连续培养F FF FcXcX，S S，P P(1+(1+)F)FX X浓缩的细胞浓缩的细胞F,SF,S0 0连续离心机连续离心机V,X,S,PV,X,S,PF,1-F,1-(c-1)X,S,P(c-1)X,S,P（:回流比；c:分离器中细胞的浓缩倍数）细胞的物料平衡：基质的物料平衡：若
46、令(1+-c)=K，则：这时，临界稀释率DC细胞产率DX的变化可以看出，进行回流时，临界稀释率增大，发酵罐可在高于细胞比生长速率的稀释率下操作，从而提高了细胞的生产速率，同时也加快了基质消耗率。在废水处理中常被采用。4.4连续培养的应用（1）确定微生物最佳培养条件连续培养恒化器中菌体浓度、比生长速率、限制性底物浓度和产物浓度等均恒定不变，所培养的微生物始终处于一种恒定的物理、化学环境中，为研究微生物对环境因子的响应以及确定微生物生长代谢的最佳环境条件提供了极为有效的工具。如何获得最大的生成强度；在怎样的环境条件下，可得到最高的转化率；如何控制限制性底物，减少副产物形成。以葡萄糖为底物培养面包酵
47、母D=0.1-0.25时得到最高转化率，YX/S=0.5g/g,这时，对应的葡萄糖浓度0.12g/l，乙醇的产率为0.最佳条件：S=0.12g/l，D=0.25，RQ=1（2）富集、选育特殊性状的菌种功能微生物筛选只有具有某特定功能的微生物菌株才能生长，才能不被选择过滤；高活性微生物筛选留下的是比生长速率最大的菌株；（3）微生物生理特性和动力学研究微生物生理活性棕色固氮菌在不同稀释率时单个细胞中的核酸含量（3）微生物生理特性和动力学研究微生物动力学参数测定1/S1/D1/m斜率=KS/m作图法求算m和KS（4）工业化生产中的应用连续培养的优点：速度容易控制、设备生产率高、劳动强度低等。酵母、细菌等单细胞蛋白产品20世纪20年代开始生产饲料酵母;用造纸厂亚硫酸盐废液连续培养生产饲料酵母。20世纪50年代以糖蜜为原料开始生产药用酵母和面包酵母。酒精、啤酒、醋酸等一次代谢产物始于20世纪50年代；50年代末实现糖蜜制酒精；60年代初能用淀粉质原料制造酒精。污水的生化处理多数采用浓缩细胞部分回流的方法。
