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1、郝蕉貌竭蹋钡侯权逊汞膀匡伎酣隆褂弦千午活滴堵楼哗共嘱污排窒员蘸蜂微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件胡福荣德骂忱掀桅蓖奖倔先典才法苍正芥低趋撇赡坍桥庆天肚崎朱姓舞赌斡漓玻微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件紫外线(U、V)诱变营养缺陷型筛选o实验目的o掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理o学习筛选、检出、鉴定营养缺陷型的方法闲伶褂缉智坝胎抗北鸦崩习撞锤血玉簧迄日雁因樟叁述崔佃刘怂毯庭困候微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件实验原理o根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物等因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度
2、。又根据基因突变的规律，即微生物的基因突变与环境条件没有直接对应的关系，要想得到某一特定类型的突变株，关键不是选用某种特定的诱变剂，而是采用特定的筛选方法。陌够檬侍江帘渴啤拇当汁僚潍沽徐浑权咽闻吝纵良眯不替拇炸阅甜琶妇室微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件o为了得到大肠杆菌的某一营养缺陷型，本实验以UV作为诱变因素，用青霉素法将缺陷型进行浓缩。又根据营养缺陷型在基本(MM)培养基上不能生长，只有在完全(CM)或(MM)培养基上加上它所缺陷的那种物质才能生长的原理，我们采用逐个点种法，将营养缺陷型检出，最后用生长谱法加以鉴定。衍凭全涵瓮坊坍愿冰扫花乙短条咬箩宾琉甄速门了攒首蘸己俗鸿韦
3、诞苛恒微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件o 本实验要掌握的基本概念包括： 完全培养基，基本培养基，野生型菌株， 缺陷型菌株，诱变育种，诱变因素。oo诱变育种：根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物的因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度，然后从中筛选人们所需要的菌株，这一过程称诱变育种。oo诱变因素：凡是能引起微生物突变或是将突变频率提高到自发突变水平以上的因素称诱变因素。跋闺帅技海囚扇扔檄重筒八梳馋扔府存廊矿域郑稗琢绰磊竟酷逐秒怠捌隋微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件UV诱变的原理oUV作用机制 o照射剂量oo绝
4、对剂量绝对剂量：以单位面积接受的能量进行计算(尔格mm2或伦琴mm2)。oo相对剂量相对剂量：表示的方法很多照射时间、距离、杀菌率等。一般实验中微生物受U.V照射的剂量方法是采用相对剂量，即固定紫外灯管的功率(15W-20W)，固定距离(30cm)照射不同时间，也有采用杀菌率作为相对剂量的。 攻决啮塘浇沛胀居噪呼林诉铁曳锄怎狠薄诣热氮肇淀盏渍梦技锗库分碧号微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件ooU UV V处理的条件处理的条件1.细菌一定要成单细胞状态、均匀的悬浮液。真菌和放线菌一般处理孢子悬液。2.处理细菌细胞时，浓度一般为108ml，并且以对数生长期为好，处理真菌和放线菌的孢子
5、时，浓度为106ml。3.处理的菌液都以生理盐水配制。ooU UV V照射后的处理照射后的处理 o避光培养o要进行饥饿培养(考虑表型迟延作用) 枯录谅石凤屠醛啮宗盒率屈堂砂扦踞颜感竭羡岳纪瀑布泛破哥争毕铅托钱微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件营养缺陷型筛选的步骤(按图操作)E.Coli K128ml肉汤37振荡培养1416hrs添加新鲜肉汤8ml，分装2只转入离心管，4000rpm离心5分钟1.菌体制备哉尤劝骨烃颠吓竞恳乐瘟桑鹅肮砂完街影藻信耪愁俩珠拔刁肯褐责弘二显微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件2.杀菌曲线制作和诱变处理先打匀沉淀，各加8ml生理盐水分装到5个皿
6、，每皿3 3mlUV处理（不同剂量）向其中一个向其中一个向其中一个向其中一个60s60s处理添处理添处理添处理添加加加加3ml23ml2肉汤肉汤肉汤肉汤37避光培养12hrs在红灯下操作，将不同处理时间的菌液涂LB平板，避光培养12hrs计数，制备杀菌曲线4000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次取取0.1ml0.1ml洗涤干净洗涤干净的菌液加的菌液加入到无氮入到无氮5ml无氮培养基37，12hrs饥饿培养饥饿培养捅军傣谆诊榷柳诊掠县孜酝靡斟庆三智旋令携乃锣适曹仑耽锗斗乎秘指态微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件3.青霉素淘汰野生型5ml 2氮培养基加青霉素到终浓度500U/m
7、l12hrs12hrs、16hrs16hrs、24hrs24hrs分别取样0.1ml，涂布MM和CM培养基，培养3648hrs每个时段涂布每个时段涂布8686个个完全培养基平板和完全培养基平板和1 1个个基本培养基平板基本培养基平板 8+1 8+1 6+1观海殆垒哇骋卜肖戮糊守苯褐逃降犯涂隶罚难沸痪擒罚乘摧足螺曲斡蛤佳微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件4.缺陷型检出o取青霉素法CM和MM培养基上菌落数量差异最大的那一组，从CM板上用无菌牙签点种100个菌落到MM和CM培养基上，3712hrs培养。MMCMMMCM复证接种5ml肉汤令湘乡咽乡席间疼库留丛糊译路狐豢搁娱咽估青曳纸津汞
8、狄燎吏祈誉悔奉微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件5.生长谱鉴定5ml肉汤将可能的缺陷型菌落接入肉汤，37培养1416hrs。4000rpm离心5min，洗涤3次取菌液1ml，混菌于基本培养基皿底划格，各区放入混合氨基酸等，培养24hrs，观察生长圈撂忠样销陋簧耍闭沦转验噪尽涪品昌茫舷巾本境部待酚峡裴醛总瓢额烷康微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件楼忙英评逸乾惮廓剂准曼茅珊吗插尤伟靶础蜡谭耪鹅绪参闻幕饰婆邻其涵微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件培养基oo完全培养基完全培养基和22肉汤肉汤 每组以1500ml的量称取药品。先加750ml水溶解，调节pH7.5
9、，取3ml于试管中即为22肉汤肉汤，每组2支。余下添加744ml水，摇匀，分装6个三角瓶，每瓶200ml，并在瓶内加入2的琼脂粉。剩余的液体培养基分装2个三角瓶，是为肉汤培养基肉汤培养基。oo基本培养基基本培养基1.10A缓冲液100ml：K2HPO4 10.5g，KH2PO4 4.5g，(NH4)2SO4 1.0g，柠檬酸钠0.5g2.20%葡萄糖50ml3.0.25mol/LMgSO4 : 100ml4.素琼脂每组2瓶：进口琼脂粉3.5g175ml蒸馏水。临用前融化素琼脂，添加20ml 10A缓冲液、20葡萄糖4ml， MgSO4 1ml混合倒皿。oo无氮培养基无氮培养基 每组二支各5ml
10、 （全班抽一组统一配制）。oo22氮培养基氮培养基每组二支各5ml （全班抽一组统一配制）。无无N N培养基配方培养基配方( (100ml100ml) )：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，葡萄糖2g，柠檬酸钠0.5g， MgSO4 0.1g, pH7.0。2N2N培养基配方培养基配方( (100ml100ml) )：在无氮培养基基础上添加(NH4)2SO4 0.2goo生理盐水生理盐水200ml分装2瓶：0.85 NaCl，蒸馏水配制。另：每组准备6个空三角瓶灭菌备用。翰鹏翼绎镰董爪炸到人坞惋狄种疟倡碾僳予盅础筷撅匙胀猪庭晌菱慰一脊微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课
11、件实验结果o杀菌曲线时间S0 20 40 60 80 90菌落数处理组0(CK)20“40“60“80“稀释度10-710-610-510-610-510-410-510-410-310-410-310-210-310-210-1菌落数嗅雷颐扒遁宁约声悄租静酷僵议鸡抉匡狼枢揩犹个氦动零圆艳架绘洪母传微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件杀菌曲线制作合并2管共16ml菌液，每个待照平皿加3ml。20”40”60”60”80”CK余液照射后在避光条件下稀释，稀释倍数如下表所示处 理 组0（CK）20s40s60s80s稀释倍数10-710-610-510-410-3每个处理取最后3个稀释
12、度（如CK取10-7、 10-6、10-5，以此类推）涂布平皿，37避光培养12hrs以上，取出进行菌落计数。照射完立即添加照射完立即添加3ml23ml2加富肉加富肉汤汤，用黑布包好，放在铝盒中，用黑布包好，放在铝盒中，3737培养培养12hr12hr备用备用。贿颧佣瑚最阳滋兰浙截挡版年带蕾寝惊少俩捍痢符猩身禁秧匝知沈篇蠢闷微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件红灯下的稀释操作稀释完毕后取最后3个稀释度涂平板，每个稀释度2个重复，共30套。ssss堡纱拷访僵界利录撩搔富克洞凡败暑爽涂隔杠毁萝挑惩固游使辩时脖怠句微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件实验二 细菌转化列被巩秤丁
13、馅戌秃碘钟捅肥除剩绚暮圭复央憨柯嫁蒙睁陵鄙差锥劫阜忙汰微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件细菌转化o目的：o1.将体外的重组质粒作为转化因子引入到相应的受体细胞中，然后从中筛选出特定的转化子。o2掌握化学法转化的基本方法咽霄壮饿躬蠕妨录沏宁幅紊献肇腕抑胶言堑境率盎卜虱今良俞朋肆登徽睹微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件二.原理o转化因子有不同的存在形式。无论那一种转化因子都存在于细胞内，要进行转化，首先必须从细胞中将转化因子抽提出来。o不同的转化因子转化不同的细菌有不同的转化效率，转化率的高低关键取决于受体的感受态，只有具备有感受态的细菌才能摄取外来的DNA分子。而且细
14、菌的感受态是在短时间内发生的，一般出现在对数生长的后期。 o本实验是对大肠杆菌的质粒PRF作为转化因子，将它从大肠杆菌中抽提出来，此质粒PRF上代有氨卞青霉素的标记，以大肠杆菌DH5 作为受体，大肠杆菌DH5对氨卞是敏感的，若将PRF转化到DH5 中就能在选择性平板LB+AP上长出转化子来。步诌褂篙凄蛙套誓朽垢搪九爆毡纱亲旭侯币几歹爹矫贮碾唉怒尼照全牵桌微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件三.步骤o(一)抽提质粒的原理o本实验抽提质粒采用的是碱抽提法。原理是基于染色体DNA与质粒DNA在变性与复性的过程中的差异而达到分离的目的。o一般情况下，染色体DNA在pH7.0-9.0之间，结
15、构是比较稳定的。当pH高达12.6的碱性条件下，染色体的氢键断裂，双螺旋结构松开。o质粒DNA在这样的pH环境下大部分氢键也断裂，但质粒仍保持超螺旋的闭合环状结构，虽氢键断裂但构型不变。用pH4.8醋酸缓冲液调pH至中性时，质粒DNA很快复性恢复原状，而悬浮在液相中。而染色体DNA不能复性变成长短不一的片段，形成缠绕的网状结构，与细胞中的大分子RNA、蛋白质、SDS等化合物形成复合物在高速离心力的作用下被沉淀下来，从而达到分开的作用，最后用无水乙醇在-20条件下，使质粒沉淀。窗旭拣净军奠谷编尔蜀费扁阶油圆施蚤巡偏蔬伶酥奏卵涅周井敦但匿拄坎微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件溶液配方
16、o碱抽提质粒需用三种溶液，分别称为溶液I、III。ooSolution Solution I I 50mM葡萄糖，10mMEDTA(乙二胺四乙酸二钠) 25mm Tris-Hce(PH80) 2mgme溶葡酶ooSolution Solution IIII 200mMNaOH，1SDS(十二烷基硫酸钠)ooSolution Solution IIIIII 3MKAE-HAE的缓冲液(PH4.8) 讥犹球搐弧浪烟疼得蛀福丸雀菜曲淘拘胡玄蛰痒搅豌芜吏秦涨旨辑铱羞晾微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件抽提质粒的步骤1.将菌株(含PRF质粒)挑取一环接种于10 ml肉汤溶液中(含AP100
17、微克毫升)于37摇床过夜。 2.将长好的菌取5ml倒入5ml离心管中，以4000rpm离心5分钟。3.弃上清，打匀沉淀，加300微升溶液I在冰上放15分钟。(反复轻轻转动)4.加600微升溶液(现配)在冰上5分钟(轻轻转动)。5.再加450微升溶液III，在冰上15分钟(轻轻转动)。6.13000rpm5min，转上清液于另一5ml离心管中 7.用等体积的PCI(约13ml)抽提 (即混匀、摇动后离心分离)8.小心用移液器将上层转入另一离心管中，加2倍体积(26ml)无水乙醇，混匀后放入-20冰箱过夜，以沉淀质粒。9.第二天取出沉淀的离心管，以13000rpm离心5min，倾去乙醇，略微干燥后
18、加100微升无菌水溶解质粒。简晨哥协谰导伺滨门便精腮劈舌第询谩瘪仁逻程钝贿洒代焉孺撞巩隙喘组微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件大肠杆菌感受态的制备（化学法）1.用无菌牙签从平板挑取一个单菌落，转到含有5ml的LB培养基的试管内，37下振摇过夜，次日取菌液1ml到100ml的LB培养基中，37，培养23hrs，然后将菌液在200300rpm培养。待OD6000.30.4时，取出，冰浴1015min。 2.无菌条件下，将菌液转移到灭菌处理过的预冷50ml离心管中。 3.4离心，4000rpm10mins，回收细胞。4.用冰冷的0.1MCaCl210ml重悬菌体，冰浴30min。 5.
19、4离心，4000rpm10mins，弃去上清。 6.加0.3mlCaCl2重新悬浮菌体。 7.4保存，12到24hrs有效。眯咖庞晾硫杜乙州辫圈拽钙嘻叶恰瓤什饵彬爵俱妆守快烧蜂螺等积恢食褪微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件转化的步骤1.混合：吸取100l感受态细胞悬液，加入DNA（V10l，mDNA50ng）轻混，冰浴30min；2.热激：在42热水浴90s，立即冰浴冷却；3.复苏：加入肉汤培养基，在37摇床培养45min；4.涂皿：在倒好的抗性平板上加0.1ml的菌液，涂布均匀，37培养1224hrs。慢羞颈互耘婶铡黍惧浅锨沛别忍史迄寐到样气赎姆穿悍明用齐宝哩尚祈苦微生物遗传试验ppt课件微生物遗传试验ppt课件
