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1、倪培华倪培华层析技术http:/2009年年3月月讲课内容讲课内容层析技术概述层析技术概述1层析的基本理论层析的基本理论层析的基本概念层析的基本概念层析的分类层析的分类凝胶层析凝胶层析2上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月层析技术概述层析技术概述1凝胶层析凝胶层析2上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月概述概述 19031903年年 俄国植物学家俄国植物学家 茨维特茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带得到黄色、绿色区带上海交通大学医学院上海交通大学医学院2
2、009年年3月月19311931年，年，KuhnKuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素采用柱色谱分离了类胡萝卜素19411941年，年，MartinMartin和和SyngeSynge提出分配色谱法提出分配色谱法 19441944年，年，MartinMartin等又提出纸色谱法等又提出纸色谱法 19521952年，年，MartinMartin和和JamesJames发明了气液色谱法发明了气液色谱法19551955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分 析的建立析的建立19561956年，年，StahlStahl系统研究了薄层色谱法系统研究了薄层色谱
3、法(TLC)(TLC)上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月19581958年，年，SteinStein和和MooreMoore研制出氨基酸分析仪，确定了研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构核糖核酸的分子结构19671967年，年，HorvvathHorvvath和和HuberHuber等研制了高效液相色谱等研制了高效液相色谱( (high-performance liquid chromatography,HPLChigh-performance liquid chromatography,HPLC) )仪仪19751975年，年，SmallSmall等提出离子色谱等
4、提出离子色谱 2020世纪世纪8080年代，超临界色谱年代，超临界色谱2020世纪世纪9090年代，毛细管电泳年代，毛细管电泳 2121世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱取得世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱取得更大的发展更大的发展上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月一、层析的基本理论一、层析的基本理论 层析：层析： 一种基于被分离物质的一种基于被分离物质的物理、化学及生物物理、化学及生物学特性的不同学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。同而进行分离和分析的方法。溶解度溶解度吸附能力吸附能力立体化学特性立
5、体化学特性分子的大小分子的大小带电情况带电情况 亲和力的大小及特异亲和力的大小及特异 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月二、层析的基本概念二、层析的基本概念v固定相：固定相： 层析的一个基质。层析的一个基质。v固体物质：吸附剂，凝胶，离子交换剂等固体物质：吸附剂，凝胶，离子交换剂等v液体物质：固定在硅胶或纤维素上的溶液液体物质：固定在硅胶或纤维素上的溶液v基质能与待分离的化合物进行可逆的反应基质能与待分离的化合物进行可逆的反应吸附吸附溶解溶解交换交换上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v 流动相：流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离在层析过程中，推动
6、固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。都称为流动相。柱层析：柱层析： 洗脱剂洗脱剂薄层层析：展开剂（展层剂）薄层层析：展开剂（展层剂）上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月LL 层析分析法的基本原理：流动相Mobilephase固定相Stationaryphase样本分子依其分子极性选择亲和两相之一吸附层析分配层析Liquid - SolidLiquid - SolidLiquid - SolidLiquid - SolidLiquid - LiquidLiquid - LiquidLiquid - Liquid
7、Liquid - Liquid两相系统ABC每次分离样本都要做一次选择One Plate ofSeparation(理论板数)S极性L非极性极性非极性样本样本上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v分配系数（分配系数（K K）及迁移率（或比移值）：）及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定（温度、压力）的分配系数是指在一定（温度、压力）的分配系数是指在一定（温度、压力）的分配系数是指在一定（温度、压力）的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量条件下，某种组分在固定相和流动相中含量条件下，某种组分在固定相和流动相中含量条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用（
8、浓度）的比值，常用（浓度）的比值，常用（浓度）的比值，常用K K K K来表示。来表示。来表示。来表示。v分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据 K=Cs/Cm K=Cs/Cm Cs: Cs: 溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度 Cm: Cm: 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度上海交通大学医学院上海交通大学医学院 1 2 3 4 5K=1K=0.13232161616168 816168 84 4121212124 42 28 812128 82 2909010101001001 1181881810.10.12.72.724.324.372
9、.972.90.010.010.360.364.864.8629.1629.1665.6165.61上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v分配系数主要与下列因素有关：分配系数主要与下列因素有关：被分离物质本身的性质被分离物质本身的性质固定相和流动相的性质固定相和流动相的性质层析柱的温度层析柱的温度上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月三、层析法的分类三、层析法的分类v根据固定相基质的形式分类根据固定相基质的形式分类纸层析纸层析薄层层析薄层层析柱层析柱层析 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月纸层析纸层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析上海交通大学
10、医学院上海交通大学医学院2009年年3月月 层层析法的析法的演变过程演变过程：圆形滤纸长条滤纸薄层层析(TLC)柱层析容量容量变变大大容量更大加展开液上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v纸层析：纸层析： 指以滤纸作为基质的层析指以滤纸作为基质的层析v薄层层析：将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成薄层层析：将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成 一薄层，在薄层上进行层析一薄层，在薄层上进行层析v柱层析：柱层析： 指将基质填装在管中形成柱形，在柱指将基质填装在管中形成柱形，在柱 中进行层析中进行层析上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v根据流动相的物态分类根据流动相的物
11、态分类液相层析：指流动相为液体的层析液相层析：指流动相为液体的层析气相层析：指流动相为气体的层析气相层析：指流动相为气体的层析气气相相层层析析液液相相层层析析气气- -固固 气气- -液液液液- -固固 液液- -液液以气体作为流动相以气体作为流动相以液体作为流动相以液体作为流动相上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v根据层析机制分类根据层析机制分类上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v定义定义 指指混混合合物物随随流流动动相相通通过过吸吸附附剂剂时时，由由于于吸吸附附剂剂对对不不同同物物质质的的吸吸附附力力而而使使混混合合物物分离的方法。分离的方法。vv原
12、理原理原理原理 在不同条件下，吸附在不同条件下，吸附在不同条件下，吸附在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用剂与被吸附物之间的作用剂与被吸附物之间的作用剂与被吸附物之间的作用物物物物理理理理作作作作用用用用的的的的范范范范德德德德华华华华吸吸吸吸附附附附：无无无无选选选选择择择择性性性性，吸吸吸吸附附附附速速速速度度度度快快快快，吸吸吸吸附的过程是可逆的附的过程是可逆的附的过程是可逆的附的过程是可逆的化化化化学学学学吸吸吸吸附附附附：由由由由原原原原子子子子价价价价力力力力的的的的作作作作用用用用引引引引起起起起。有有有有选选选选择择择择性性性性，吸吸吸吸附附附附速度较慢，不易解吸速度较慢，
13、不易解吸速度较慢，不易解吸速度较慢，不易解吸（1 1 1 1）吸附层析）吸附层析）吸附层析）吸附层析 在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月吸附层析吸附层析v常用的吸附剂 硅胶碱性碱性碱性碱性: : : :碳氢化合物碳氢化合物碳氢化合物碳氢化合物 中性中性中性中性: : : :醛醛醛醛,
14、 , , ,酮酮酮酮, , , ,醌醌醌醌, , , ,酯酯酯酯, , , ,内酯内酯内酯内酯酸性酸性酸性酸性: : : :酸性色素酸性色素酸性色素酸性色素, , , ,醛醛醛醛, , , ,酸酸酸酸聚酰胺氧化铝活性炭磷酸钙粉末粉末粉末粉末: :吸附力大吸附力大吸附力大吸附力大,流速慢流速慢流速慢流速慢 颗粒颗粒颗粒颗粒: :吸附力中吸附力中吸附力中吸附力中, ,流速易控流速易控流速易控流速易控 锦纶锦纶锦纶锦纶- -活性炭活性炭活性炭活性炭: :吸附力弱吸附力弱吸附力弱吸附力弱锦纶锦纶锦纶锦纶66666666或锦纶或锦纶或锦纶或锦纶6 6 6 6 酰胺基团酰胺基团酰胺基团酰胺基团 对酚对酚对
15、酚对酚,DNP-,DNP-,DNP-,DNP-氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸, , , , 醌醌醌醌, , , ,羧酸羧酸羧酸羧酸 氢键：羟基与羰基氢键：羟基与羰基氢键：羟基与羰基氢键：羟基与羰基唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月（2 2 2 2）分配层析分配层析分配层析分配层析利利用用不不同同组组分分在在流流动动相相和和固固定定相相中中的的分分配配系数不同系数不同而进行分离的方法。而进行分离的方法。上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月层析技
16、术概述层析技术概述1凝胶层析凝胶层析2上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月凝胶层析凝胶层析v凝胶层析凝胶层析（gel chromatographygel chromatography）v凝胶排阻层析凝胶排阻层析（gel exclusion chromatographygel exclusion chromatography）v分子筛层析分子筛层析（molecular sieve chromatographymolecular sieve chromatography）v凝胶过滤凝胶过滤（gel filtrationgel filtration）v凝胶渗透层析凝胶渗透层析（ge
17、l permeation chromatographygel permeation chromatography） 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月固定相（凝胶）固定相（凝胶）v三维空间网状结构三维空间网状结构A good gel for gel filtration contains about95% water上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月 凝胶层凝胶层析法：析法：样品样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出 分子筛效应分子筛效应： 分子大小不分子大小不同同, ,在凝胶受在凝胶受到的阻滞作用到的阻滞作用有差异有差异, ,从而从而造成各组
18、分在造成各组分在凝胶柱中的迁凝胶柱中的迁移速度不同得移速度不同得到分到分离。上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 v基本概念基本概念 外水体积：外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的 体积，也就是凝胶颗粒间液体流体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积动相的体积内水体积：内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶 层析中固定相体积就是指内水体积层析中固定相体积就是指内水体积基质体积：基质体积：指凝胶颗粒实际骨架体积指凝胶颗粒实际骨架体积
19、柱床体积：柱床体积：指凝胶柱所能容纳的总体积指凝胶柱所能容纳的总体积洗脱体积洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需：指将样品中某一组分洗脱下来所需 洗脱液的体积洗脱液的体积 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月柱床体积柱床体积VT凝胶干体积凝胶干体积Vg内水体积内水体积Vi存在于柱床内凝胶存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水外面空隙之间的水相体积，相应于一相体积，相应于一般层析法中流动相般层析法中流动相的体积。的体积。颗粒内部所含水相颗粒内部所含水相的体积它可从的体积它可从干凝干凝胶颗粒重量胶颗粒重量和吸水和吸水重量相减求得。重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内凝胶体积以及颗粒内外
20、间隙体积的总和。外间隙体积的总和。 VT = 1/4 D2h 外水体积外水体积V0V VT T = Vg + V= Vg + V0 0 + Vi+ Vi数理关系数理关系上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月 Ve VoVe Vo Kd = Kd = Vi Vi分配系数（分配系数（ Kd ）：）：特点：特点：（1）与被分离物质分子的大）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有小和凝胶颗粒孔隙的大小有关关 （2）与柱的长短粗细无关）与柱的长短粗细无关 每个溶质分子在流动相和固定相之间每个溶质分子在流动相和固定相之间每个溶质分子在流动相和固定相之间每个溶质分子在流动相和固定相之间
21、有一个特定的分配系数（有一个特定的分配系数（有一个特定的分配系数（有一个特定的分配系数（KdKdKdKd）Ve=Vo+KdViVe=Vo+KdViVe=Vo+KdViVe=Vo+KdVi上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月(2)Ve = Vo + Vi(2)Ve = Vo + Vi Kd = 1 Kd = 1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内完全向凝胶颗粒内部扩散部扩散n在两相分配的比值在两相分配的比值为为1,1,最后流出最后流出. .(1)Ve = Vo(1)Ve = Vo Kd = 0 Kd = 0n分分子子完完全全被被排排阻阻于于凝凝胶胶颗颗粒粒之外之
22、外n全全部部分分布布于于流流动相里动相里, ,n最先流出。最先流出。(3) 0 Kd 1 (3) 0 Kd 1 Ve = Vo +ViKdVe = Vo +ViKd为为溶质以某种程溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩度向凝胶颗粒内扩散散 Kd=0 0Kd=0 0Kd=0 0Kd=0 0Kd1Kd1Kd1Kd1 Kd=1Kd=1Kd=1Kd=1洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月三三. .凝凝胶胶层层析析的的优优点点 1.1.凝凝胶胶是是一一种种不不带带电电荷荷的的惰惰性性载载体体，结结构稳定构稳定。 2. 2. 操作条件较温和操作条件较温和。 3.3.
23、样样品品得得率率高高, ,重重复复性性好好, ,可可进进行行大大量量样品的分离纯化。样品的分离纯化。四、凝胶层析的缺点四、凝胶层析的缺点1.1.要要求求样样品品和和洗洗脱脱液液的的粘度很低粘度很低。2.2.凝凝胶胶颗颗粒粒网网络络孔孔径径大大小小非非常常有有限限, ,所所以以可可被被纯纯化化的的物物质质的的分分子子量范围受到限制量范围受到限制。3.3.凝凝胶胶结结构构对对某某些些溶溶质质分子具有吸附作用分子具有吸附作用。上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质v 凝胶种类凝胶种类葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶聚
24、丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v（一）葡聚糖凝胶（一）葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是指由葡聚糖凝胶是指由天然高分子葡聚糖与其天然高分子葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。它交联剂交联而成的凝胶。基本骨架：基本骨架：葡聚糖（葡聚糖（dextran）交联剂：交联剂：3-氯代氯代-1,2-环氧氯丙环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的聚合而成的三维空间网状结构三维空间网状结构。上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3
25、月月上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月vSephadexSephadex系列系列: : 葡聚糖与葡聚糖与3-3-氯氯-1,2-1,2环氧丙烷（交环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制分比控制 vSephadex G-200Sephadex G-200，后面的数字是凝胶的吸水率，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是（单位是ml / gml / g干胶）乘以干胶）乘以10 10 v数字越大数字越大: : 排阻极限越大，分离范围也越大排阻极限越大，分离范围也越大v凝胶颗粒小的分离较好、分辨率较高，但流速低凝胶颗粒小的分
26、离较好、分辨率较高，但流速低v凝胶颗粒大，流速高，但洗脱峰较为扁平，分辨凝胶颗粒大，流速高，但洗脱峰较为扁平，分辨率也较差率也较差 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月（二）琼脂糖凝胶（二）琼脂糖凝胶v琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的v琼脂糖是由琼脂糖是由D D半乳糖和半乳糖和3,63,6脱水半乳糖交替脱水半乳糖交替构成的多糖链构成的多糖链v在在100100 C C时呈液态，当温度降至时呈液态，当温度降至4040 C C以下时，以下时，多糖链以氢键方式相互连
27、接形成双链单环的琼多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月（三）、聚丙烯酰胺凝胶（三）、聚丙烯酰胺凝胶 v 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺交联而成。丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺交联而成。 v聚丙烯酰胺凝胶主要由聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-RadBio-Rad生产生产v商品名：商品名：Bio-Gel PBio-Gel Pv型号：型号：Bio-Gel P-2 P-300Bio-Gel P-2 P-300
28、等等1010种种数字基本代表它们的排阻极限的数字基本代表它们的排阻极限的10103 3，数字越大，数字越大，可分离的分子量也就越大可分离的分子量也就越大 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月各种层析胶体：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose + acrylamidecelluloseBio-RadBioGel PBioGel Aacrylamideagarose上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月凝胶的保存凝胶的保
29、存v反复洗涤去除蛋白等杂质反复洗涤去除蛋白等杂质v加入适当的抗菌剂（加入适当的抗菌剂（0.020.02叠氮钠）叠氮钠）v4 4 C C下保存下保存v较长时间的保存（凝胶洗涤后脱水、干燥）较长时间的保存（凝胶洗涤后脱水、干燥）将凝胶过滤抽干后浸泡在将凝胶过滤抽干后浸泡在5050的乙醇中脱水的乙醇中脱水抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至9595乙醇脱水后将凝胶抽干乙醇脱水后将凝胶抽干置于置于6060 C C烘箱中烘干，即可装瓶保存烘箱中烘干，即可装瓶保存上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作 上海交通
30、大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月 凝胶柱凝胶柱的的装填装填方法：方法：装填胶体暂停流洗X继续流洗已堆积沉淀中上清紧密堆积检查好管柱是否畅通12GelGel继续流洗上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月v层析柱的选择层析柱的选择层析柱大小：根据样品量的多少以及对分辨率的要求来层析柱大小：根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择进行选择层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难均一、流
31、速过慢等实验上的一些困难一般柱长度不超过一般柱长度不超过100cm100cm，为得到高分辨率，可以将柱子，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用串联使用层析柱的直径和长度比一般在层析柱的直径和长度比一般在1:251:251:1001:100之间之间用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短低，所以一般比较短上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定v肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡v采用一种有色的物质，如蓝色葡聚采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖糖-2000-200
32、0、血红蛋白等上柱，观察、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度凝胶柱的均匀程度v如果色带狭窄、平整、均匀下降，如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱则需重新装柱上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月洗脱液的选择洗脱液的选择v凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pHpH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品
33、，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。v为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。有一定浓度的盐。 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月加样量加样量v快速、均匀快速、均匀v加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。实验效率低。一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的一般分级分离时加样
34、体积约为凝胶柱床体积的1 1-5-5左右左右分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的柱床体积的1010-25-25。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月洗脱速度洗脱速度v保持洗脱速度恒定通常有两种方法保持洗脱速度恒定通常有两种方法使用恒流泵使用恒流泵恒压重力洗脱恒压重力洗脱洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等颗粒大小等洗脱速度慢样品可以与凝胶基质充分平衡，分离洗脱速度慢样品可以与凝胶基
35、质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长大大延长上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月凝胶层析的应用凝胶层析的应用v（一）生物大分子的纯化一）生物大分子的纯化 分级分离抗原或抗体v（二）分子量测定二）分子量测定 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月 Velog Mr对同一类型的化合物对同一类型的化合物对同一类型的化合物对同一类型的化合物, , , ,洗脱洗脱洗脱洗脱特性与组分的分子量有关特性与组分的分子量有关特
36、性与组分的分子量有关特性与组分的分子量有关, , , ,流过凝胶柱时流过凝胶柱时流过凝胶柱时流过凝胶柱时, , , ,按分子量按分子量按分子量按分子量(MW)(MW)(MW)(MW)大小顺序流出大小顺序流出大小顺序流出大小顺序流出,MW,MW,MW,MW大的大的大的大的走在前面走在前面走在前面走在前面,Ve,Ve,Ve,Ve与与与与MWMWMWMW的关系可的关系可的关系可的关系可用下式表示用下式表示用下式表示用下式表示: : : :Ve = K1 - K2lgMWVe = K1 - K2lgMWK1,K2 K1,K2 K1,K2 K1,K2 为常数为常数为常数为常数, MW, MW, MW,
37、MW为分子量为分子量为分子量为分子量上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月 （三）脱盐及去除小分子杂质（三）脱盐及去除小分子杂质v利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。的稀释，生物分子不易变性。v一般常用的是一般常用的是Sephadex G-25Sephadex G-25等排阻极限较小的等排阻极限较小的凝胶类型。凝胶类型。上海交通大学医学院上海交
38、通大学医学院2009年年3月月Elution volume (ml)AlbuminNaClnDesalting in a simple column 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月实验：实验： 凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月血红蛋白血红蛋白 64,480二硝基苯二硝基苯-鱼精蛋白鱼精蛋白 2,000-12,000Sephadex G-50 孔径孔径 1,500-30,000一、原理：一、原理：Kd=0Kd=0Kd=1Kd=1上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月1、装柱、装柱 先用蒸馏水赶走
39、层析柱中的死体积；先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积；凝胶不能有气泡和分层现象；凝胶不能有气泡和分层现象；装柱结束后要保持凝胶表面平整。装柱结束后要保持凝胶表面平整。二、操作注意点：二、操作注意点：上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月 凝胶柱凝胶柱的的装填装填方法：方法：装填胶体暂停流洗X继续流洗已堆积沉淀中上清紧密堆积检查好管柱是否畅通12GelGel继续流洗上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月2 2、加样、加样使液面和凝胶表面相切，关闭出口；使液面和凝胶表面相切，关闭出口；加样时尽量不要破坏凝胶面；加样时尽量不要破坏凝胶面；让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。上海交通大学医学院上海交通大学医学院2009年年3月月血红蛋白和二硝基苯血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱鱼精蛋白的洗脱体积？体积？三、结果要求：三、结果要求：上海交通大学医学院上海交通大学医学院
