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1、实验实验13 DNA13 DNA片段的片段的PCRPCR扩增扩增1 1、用、用PCRPCR技术对技术对DNADNA进行扩增进行扩增2 2、用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的、用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNADNA进进行检测行检测 电电 泳泳观察PCR反应反应 实验步骤DNADNA在体内复制的条件是什么？在体内复制的条件是什么？模板：模板：酶：酶：原料、能量：原料、能量：解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等。聚合酶等。DNADNA分子的每条链分子的每条链dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP引物：引物：温和的反应条件温和的反应条件DNADNA分子的结构分子的结构合
2、成合成DNADNA分子的原料分子的原料脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸合成合成DNADNA分子的原料分子的原料脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸dATP dGTP dCTP dTTP 聚合反应机理聚合反应机理：DNA聚合酶聚合酶不同细胞的细胞周期不同细胞的细胞周期 不同生物细胞不同生物细胞 需要的时间需要的时间细细 菌菌一般是一般是20203030分钟分钟蚕豆根尖细胞蚕豆根尖细胞17.317.3小时小时小鼠十二指肠细胞小鼠十二指肠细胞15.315.3小时小时人的肝细胞人的肝细胞2222小时小时人的宫颈癌细胞人的宫颈癌细胞22.522.5小时小时PCRPCR技术可在技术可在几小时内几小时内，将特定核酸序列
3、扩增将特定核酸序列扩增百万倍百万倍! !PCR的概念的概念 PCRPCR（ P Polymerase olymerase C Chain hain R Reaction,eaction,聚合酶链反应聚合酶链反应）是指在体外，通过特异是指在体外，通过特异DNADNA引物引物扩增扩增核酸分子中核酸分子中某个某个特定区域特定区域的技术。的技术。 PCR的反应体系的反应体系DNA模板模板原料：原料： dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP) ； 酶：酶： Taq聚合酶聚合酶（嗜热细菌中分离得到）（嗜热细菌中分离得到）引物：引物：（单链（单链DNA片段）片段）MgMg2+2+（维持酶活性所必需）
4、（维持酶活性所必需）PCRPCR缓冲液：缓冲液：维持维持pH，保护，保护Taq酶酶 PCR技术原理技术原理变变 性性退火退火 延伸延伸 PCR三步曲三步曲 预变性预变性保温保温 变变 性性9095延伸延伸 7075退火退火 4060PCR仪仪用于用于PCR的预混液（的预混液（ 500 L 体系）：体系）： ddH2O 310 310 L L1010butter 5butter 50 0 L LMgClMgCl2 2 40 40 L LdNTPdNTP混合液混合液 2020 L L引物引物1 251 25 L L引物引物2 252 25 L L模板模板DNA 2525 L L Taq DNATa
5、q DNA聚合酶聚合酶 5 5 L L 标记一个微量离心管，用取样器取标记一个微量离心管，用取样器取20 L的预混液的预混液加入到该管中。加入到该管中。反应试剂反应试剂 用量用量PCR SuperMix 10L引物（浓度10M） 1L引物（浓度10M） 1L模板DNA 5LddH2O 3L总体积 20L微量可调移液器（微量可调移液器（一档吸、二档排一档吸、二档排）PCR反应参数反应参数： 变性变性 94 30 s退火退火 52 30 s延伸延伸 72 60 s 预变性预变性 94 300 s 保温保温 72 600 s循环次数循环次数 351、基本概念、基本概念 以琼脂糖凝胶作为介质以琼脂糖凝
6、胶作为介质,DNA在外加电场的在外加电场的作用下泳动的技术。作用下泳动的技术。2、实验原理、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳基本原理琼脂糖凝胶电泳基本原理制胶制胶使用使用电泳缓冲液在制胶器上配电泳缓冲液在制胶器上配制制1.0%的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。混样混样2L载样缓冲液、载样缓冲液、 2L 核酸荧核酸荧光染料，光染料，10LPCR产物混匀。产物混匀。点样点样将上步混好的样将上步混好的样10
7、L加到凝胶加到凝胶孔中孔中。电泳电泳90V电压下电泳电压下电泳1020min。琼脂糖凝胶电泳的过程琼脂糖凝胶电泳的过程将凝胶倒入制胶器的槽中将凝胶倒入制胶器的槽中（60oC）将琼脂糖加入电泳缓冲液将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中在微波炉中加热溶解至透明。加热溶解至透明。制 胶将梳子从制胶槽中拔出将梳子从制胶槽中拔出 取出凝胶板放入电泳槽中取出凝胶板放入电泳槽中 向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶 琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用缓冲液的作用1 1、增加电导率；、增加电导率；2 2、维持电泳过程中、维持电泳过程中的合适的的合适的pHpH。吸取吸取P
8、CR反应产物反应产物10L。注意吸头。注意吸头要插入到管底，才能取到要插入到管底，才能取到PCR产物。产物。 将将PCR产物与加样缓冲液充分混合产物与加样缓冲液充分混合（吸排几次吸排几次） 混 样常用的上样缓冲液配方及各成分的作用常用的上样缓冲液配方及各成分的作用蔗糖蔗糖使样品呈色，便于上样，使样品呈色，便于上样，形成可见指示带，预测电泳进程。形成可见指示带，预测电泳进程。溴酚蓝溴酚蓝增加样品密度，保证增加样品密度，保证DNADNA均匀沉均匀沉入加样孔内。入加样孔内。核酸荧光染料核酸荧光染料可嵌合入可嵌合入DNADNA分子，在特定激发分子，在特定激发光源的激发下可发出荧光，荧光源的激发下可发出
9、荧光，荧光强度与光强度与DNADNA含量成正比。含量成正比。（需要与加样缓冲液混合）（需要与加样缓冲液混合）加 样进行电泳10-20分钟电 泳实验用的核酸荧光染料与实验用的核酸荧光染料与DNA嵌合后，在嵌合后，在DNA图谱观察仪的可见光下图谱观察仪的可见光下发射发射黄绿色黄绿色荧光。荧光。电泳结果的观察电泳结果的观察在在DNADNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。PCR的应用的应用PCRPCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。度高、效率高、应用范围广等特点。PCRPCR技技术在术在分子生物学、医学和案件侦破分子生物学、医学和案件侦破等领域等领域得到广泛应用。得到广泛应用。
