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1、实验三 对流免疫电泳 【实验目的】 掌握对流免疫电泳的原理、操作方法、 结果判定及了解其用途。【实验原理】 带电胶体颗粒可在电场中定向移动，移动速度及带电胶体颗粒可在电场中定向移动，移动速度及 方向与颗粒所带电荷及分子量大小有关。蛋白质方向与颗粒所带电荷及分子量大小有关。蛋白质 为两性电解质，每种蛋白质都有自己的等电点，为两性电解质，每种蛋白质都有自己的等电点， 在在pHpH值大于其等电点的溶液中，羧基解离多，蛋值大于其等电点的溶液中，羧基解离多，蛋 白质带负电，向正极泳动；在白质带负电，向正极泳动；在pHpH值小于其等电点值小于其等电点 的溶液中，氨基解离多，蛋白质带正电，向负极的溶液中，氨
2、基解离多，蛋白质带正电，向负极 泳动。泳动。pHpH值离等电点越远，所带电荷越多，泳动值离等电点越远，所带电荷越多，泳动 速度也越快。因此，可通过控制溶液的速度也越快。因此，可通过控制溶液的pHpH值的方值的方 法，使抗原抗体在通电的琼脂板上泳动，进行抗法，使抗原抗体在通电的琼脂板上泳动，进行抗 原抗体成分的分析，或进行抗原抗体的检测。原抗体成分的分析，或进行抗原抗体的检测。 电泳缓冲液电泳缓冲液pHpH为为8.68.6，在这种溶液中：，在这种溶液中：抗抗原原分分子子羧羧基基解解离离带带负负电电荷荷，且且分分子子量量小小，泳泳动动速速度度快快，能能克克服服琼琼脂脂中中的的电电渗渗阻阻力力，故故
3、在在电电泳泳时时从负极向正极移动。从负极向正极移动。抗体属球蛋白，所暴露的极性基团较少，在碱性抗体属球蛋白，所暴露的极性基团较少，在碱性缓冲液电离也少，只带微弱的负电荷，且缓冲液电离也少，只带微弱的负电荷，且相对相对分分子质量较大，电泳力较小，泳动速度慢，克服不子质量较大，电泳力较小，泳动速度慢，克服不了电渗阻力，在琼脂电渗力作用下反而由正极向了电渗阻力，在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动。负极移动。将抗体置正极端，抗原置负极端，则电泳时抗原将抗体置正极端，抗原置负极端，则电泳时抗原抗体相向泳动，在两孔之间相遇，在比例最合适抗体相向泳动，在两孔之间相遇，在比例最合适处就会形成白色沉淀线。处
4、就会形成白色沉淀线。免疫电泳的特点： 免疫电泳是由琼脂扩散与电泳结合而成的一种检测技术。抗原抗体在凝胶中扩散的同时，加入电场力的作用，使抗体或抗原在凝胶中的扩散移动速度加快，缩短了试验时间；同时限制了扩散移动的方向，使集中朝电泳的方向扩散移动，增加了试验的敏感性，所以该方法比一般的凝胶扩散试验更快速和灵敏。【实验材料】 1、电泳缓冲液0.05MLpH8.6巴比妥缓冲液。 2、抗体 羊抗人的IgG血清。 3、抗原 人的IgG。 4、 1 琼 脂 用 pH8.6巴 比 妥 缓 冲 液 配 置 ， 冰箱保存备用。 5、仪器 电泳仪、电泳槽 6、器械 载玻片、打孔器、10ml吸管、 移液器、移液头。
5、【实验方法实验方法】 1 1、1.01.0琼脂板制备琼脂板制备 取取pH8.6pH8.6巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液100ml100ml置于搪瓷缸置于搪瓷缸 中，加入中，加入1g1g琼脂粉，加热至完全溶解，冰箱保琼脂粉，加热至完全溶解，冰箱保 存备用。存备用。 加热熔化加热熔化1.01.0琼脂，待冷却至琼脂，待冷却至50506060时，时， 用用10mL10mL吸管吸取吸管吸取6mL6mL加于载玻片上。加于载玻片上。 2 2、打孔、打孔 在凝固后的琼脂板上，用打孔器打两排在凝固后的琼脂板上，用打孔器打两排 孔，孔间距为孔，孔间距为4mm4mm。 AbAgAbAg标记孔沉淀线3、加样 将抗原加入琼脂
6、板上有标记孔侧的 小孔中，抗体加入另一侧小孔中， 以加满为度，不可溢出孔外。 4、电泳 将加好样品的琼脂板置电泳槽上， 抗原侧置负极端，抗体孔侧置正极 端。搭好桥后，接通电源，控制电 压610 V/cm板长，电泳约3060 min。5、关闭电源，取出琼脂板，观察结果。 【实验结果】将玻片对着光源，观察抗原孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则表示阳性，否则为阴性。【注意事项】1.1.电泳时电流不宜过大，以免蛋白变性。电泳时电流不宜过大，以免蛋白变性。2.2.抗原和抗体的电极方向不能搞错。抗原和抗体的电极方向不能搞错。3.3.抗原和抗体的浓度要适当，抗原太浓或太稀都不抗原和抗体的浓度要适当，抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线。易出现沉淀线。4.4.电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳时间越长。时间越长。5.5.琼脂的质量要好（选用进口或者进口分装），否琼脂的质量要好（选用进口或者进口分装），否则不易出现结果，也可选用琼脂糖。则不易出现结果，也可选用琼脂糖。6.6.琼脂的浓度不宜太高（琼脂的浓度不宜太高（1 12 2），应以容易），应以容易挑出孔内琼脂为宜。挑出孔内琼脂为宜。【思考题】 1、对流免疫电泳有何特点？ 2、对流免疫电泳中，抗原为何放阴极 端，抗体为何放阳极端？
