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1、第六章第六章胚胎培养和离体授粉胚胎培养和离体授粉胚胚培养培养胚乳培养胚乳培养胚珠和子房培养胚珠和子房培养雌蕊的主要雌蕊的主要部分是子房，部分是子房，子房的胚珠子房的胚珠中产生胚囊，中产生胚囊，并在成熟胚并在成熟胚囊中产生卵囊中产生卵细胞，胚珠细胞，胚珠是子房中的是子房中的重要结构。重要结构。一、胚培养一、胚培养1、含义、含义1.1 含义含义 采用人工的方法将胚从种子、采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。成幼苗的过程。1.2 培养对象培养对象 胚胎发生过程中
2、的不同发胚胎发生过程中的不同发育时期的胚和具胚的器官。如：成熟胚、育时期的胚和具胚的器官。如：成熟胚、幼胚、胚珠培养、子房培养。幼胚、胚珠培养、子房培养。1.3 意义：意义：q促使发育不良或中途败育的胚发育成熟促使发育不良或中途败育的胚发育成熟q打破休眠期促进胚萌发打破休眠期促进胚萌发q快速繁殖良种砧木快速繁殖良种砧木q诱导胚性愈伤组织诱导胚性愈伤组织2、离体胚培养的发育途径、离体胚培养的发育途径按按正常胚胎发育途径形成植株正常胚胎发育途径形成植株脱分化形成愈伤组织脱分化形成愈伤组织胚胚“早熟萌发早熟萌发”2.3 胚胚“ 早熟萌发早熟萌发”畸形苗畸形苗发育不正常而死（即胚性发育）发育不正常而死
3、（即胚性发育）未成熟幼胚未成熟幼胚分离变异体分离变异体离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成幼苗。直接长成幼苗。3、成熟胚的培养、成熟胚的培养3-1、材料的消毒与接种、材料的消毒与接种健壮优良的个体自交种或杂交种子，常规消毒灭菌，健壮优良的个体自交种或杂交种子，常规消毒灭菌，剥离胚。剥离胚。3-2、培养基、培养基 大量元素和微量的无机盐为基本成分大量元素和微量的无机盐为基本成分谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长植物天然浸提物（植物天然浸
4、提物（YEYE）促进胚生长）促进胚生长硫氨素促进胚根的伸长硫氨素促进胚根的伸长生长素低浓度促进胚的发育（胚根）生长素低浓度促进胚的发育（胚根）赤霉素促进有后熟作用的种子萌发赤霉素促进有后熟作用的种子萌发3-3、培养条件、培养条件 pH一般为一般为5.26.31212小时光照和小时光照和2525 C C，热带兰花杂交种胚，热带兰花杂交种胚30 30 C C附加成分附加成分4、原胚、原胚(幼胚幼胚)的培养的培养4.1 培养方法培养方法 4.1.1 取材：子房取材：子房 4.1.2 常规表面消毒常规表面消毒 4.1.3 在高倍显微镜下在高倍显微镜下 剥离幼胚，接剥离幼胚，接 种种于培养基于培养基 4
5、.1.4 送入培养室培养送入培养室培养 4.2 原胚培养的条件原胚培养的条件 未成熟的幼胚，当它在胚囊里生长时，未成熟的幼胚，当它在胚囊里生长时，不仅依赖于周围细胞中的代谢，而且依不仅依赖于周围细胞中的代谢，而且依赖于周围胚乳消耗的养料。与成熟胚的赖于周围胚乳消耗的养料。与成熟胚的相对自养性比较，幼胚则完全是异养的，相对自养性比较，幼胚则完全是异养的，在离体情况下，要求更复杂的培养基。在离体情况下，要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外，还要加入微除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和各种生长辅助物质。胚龄越小，量元素和各种生长辅助物质。胚龄越小，要求的培养基成分就越复杂要求的培养基成
6、分就越复杂。4.2 原胚原胚(幼胚幼胚)的培养的条件的培养的条件4.2.1 无机氮：无机氮：4.2.2 渗透压：渗透压：4.2.3 复杂的天然提取物：复杂的天然提取物：4.2.4 活性炭：活性炭：包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；蔗糖，蔗糖，8%-10%8%-10%，不同发育期，渗透压不一样，不同发育期，渗透压不一样，初期高（初期高（WHYWHY）。因为）。因为自然条件下，原胚被一自然条件下，原胚被一层高渗液体包围着。层高渗液体包围着。椰乳椰乳 CM有促进幼胚生长和分化的作用有促进幼胚生长和分化的作用吸附有毒物质吸附有毒物质4.2.5 有利幼胚培养的因素有利幼胚培养的因素
7、胚乳看护培养，胚乳看护培养，利于原胚的生长有明显的促进利于原胚的生长有明显的促进作用。作用。胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要：胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要：胚柄促进生长的活性，心形早期活性最高。而胚柄促进生长的活性，心形早期活性最高。而且保留胚柄减少对胚的直接损失。且保留胚柄减少对胚的直接损失。二、胚乳培养二、胚乳培养1. 胚乳胚乳X3（2极核1精子）是营养组织，影响胚的发育。是营养组织，影响胚的发育。有些植物在胚发育过程中把胚有些植物在胚发育过程中把胚乳消耗尽（豆科和葫芦科）；乳消耗尽（豆科和葫芦科）；有些植物，胚乳在成熟种子中有些植物，胚乳在成熟种子中存在，贮存大量营养物质（禾存在，贮
8、存大量营养物质（禾谷类，椰子，咖啡）谷类，椰子，咖啡）2 胚乳培养胚乳培养 2.1 含义含义 将胚乳从母体上分离出来，放在无将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程发育，以至形成幼苗的过程。2.2 胚乳培养的意义胚乳培养的意义胚乳培养再生植株证明了全能性理论；胚乳培养再生植株证明了全能性理论；研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；再生植株多为三倍体，产生无籽果实；再生植株多为三倍体，产生无籽果实；可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非整倍体植
9、株。整倍体植株。胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。物代谢途径的理想系统。2.3 2.3 胚乳培养的发展史胚乳培养的发展史2.3.1 2.3.1 发展史发展史19331933年，年，LampeLampe和和MillsMills进行最初尝试。进行最初尝试。19491949年，年，LaRueLaRue报道玉米成熟胚乳长出愈伤。报道玉米成熟胚乳长出愈伤。其后，黑麦草，黄瓜，蓖麻相似的结果。其后，黑麦草，黄瓜，蓖麻相似的结果。19731973年，印度学者获得了三倍体胚乳再生植株。年，印度学者获得了三倍体胚乳再生植株。2.3.2 由胚乳再生完
10、整植株的物种由胚乳再生完整植株的物种12科，科，20多种。多种。蔷薇科：苹果，梨，桃。蔷薇科：苹果，梨，桃。禾本科：大麦、玉米和水稻。禾本科：大麦、玉米和水稻。茄科：枸杞，马铃薯。茄科：枸杞，马铃薯。3 胚乳培养的方法胚乳培养的方法3.1 3.1 胚乳愈伤组织的建立胚乳愈伤组织的建立绝大多数经历愈伤组织阶段（绝大多数经历愈伤组织阶段（器官发生器官发生），极），极少数直接从胚乳直接分化器官少数直接从胚乳直接分化器官( (胚状体胚状体) )。3.2 3.2 胚乳发育时期胚乳发育时期发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织的诱发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织的诱导频率很低。导频率很低。处于旺盛生长期
11、的胚乳，离体条件下最易诱导处于旺盛生长期的胚乳，离体条件下最易诱导产生愈伤组织。产生愈伤组织。接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低。率很低。3.3 3.3 培养基成份培养基成份 WT、MS植物激素植物激素3.3.1 生长素细胞分裂素合理搭配，效果更生长素细胞分裂素合理搭配，效果更好好 一般植物一般植物 均适宜均适宜3.3.2 特殊种类激素特殊种类激素 如如: 大麦大麦2,4-D 猕猴桃玉米素猕猴桃玉米素3.3.3 无特别要求，任何一种生长素均可无特别要求，任何一种生长素均可 如如:枣枣3.4 3.4 胚在胚乳培养中的作用胚在胚乳培养中的作用旺盛
12、期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无需原位旺盛期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无需原位胚的参与，就能形成愈伤组织。胚的参与，就能形成愈伤组织。完全成熟的胚乳，生理活动很弱，在诱导脱分化完全成熟的胚乳，生理活动很弱，在诱导脱分化前，必须借助于原位胚的萌发，使其活化。前，必须借助于原位胚的萌发，使其活化。胚在萌发时产生某种物质胚在萌发时产生某种物质“ “ 胚因子胚因子”。外源。外源GA3GA3能部分取代胚因子。能部分取代胚因子。3.5 胚乳培养过程胚乳培养过程胚乳胚乳胚状体发育成苗胚状体发育成苗不定芽苗不定芽苗柚，柑桔和枣柚，柑桔和枣大麦大麦, 水稻水稻, 玉米玉米, 苹果苹果, 马铃薯马铃薯愈伤组织愈
13、伤组织形态发生形态发生4 胚乳再生植株的染色体倍性变异胚乳再生植株的染色体倍性变异很少三倍体很少三倍体(稳定型稳定型)，大多为二倍体，非整倍体，大多为二倍体，非整倍体(畸变型畸变型)。WHY？畸变型胚乳类型畸变型胚乳类型：多倍性细胞嵌合体，核型胚乳：多倍性细胞嵌合体，核型胚乳核型胚乳核型胚乳：被子植物中最普遍的胚乳发育形式。：被子植物中最普遍的胚乳发育形式。初生胚乳核第一次分裂和以后的多次分裂不伴随初生胚乳核第一次分裂和以后的多次分裂不伴随细胞壁的形成，胚乳核游离在胚囊中。细胞壁的形成，胚乳核游离在胚囊中。细胞型胚乳细胞型胚乳：从初生胚乳核分裂开始，产生细胞：从初生胚乳核分裂开始，产生细胞壁，
14、形成胚乳细胞。壁，形成胚乳细胞。原因原因: 胚乳愈伤发生的部位胚乳愈伤发生的部位：不同部位胚：不同部位胚乳细胞染色体组成不同。乳细胞染色体组成不同。 培养基中外源激素的种类和水平培养基中外源激素的种类和水平： 继代培养时间长短继代培养时间长短：三、胚珠和子房培养三、胚珠和子房培养1、作用、作用促进原胚继续生长，使杂种幼胚发育成熟；促进原胚继续生长，使杂种幼胚发育成熟；成功：四季桔、柑、凤仙花、洋葱成功：四季桔、柑、凤仙花、洋葱成功的植物：西葫芦、莴苣、百合等成功的植物：西葫芦、莴苣、百合等未授粉胚珠和子房，诱导孤雌生殖，产生雌未授粉胚珠和子房，诱导孤雌生殖，产生雌性单倍体性单倍体2、外植体消毒
15、和接种、外植体消毒和接种3、培养基及培养条件、培养基及培养条件4、离体培养胚胎的发育、离体培养胚胎的发育胚珠或授粉子房培养，合子胚可以更好地发育胚珠或授粉子房培养，合子胚可以更好地发育成植株。但如果条件不适，也容易从幼胚或珠成植株。但如果条件不适，也容易从幼胚或珠心组织产生愈伤组织。心组织产生愈伤组织。芸香科易产生珠心胚。培养胚珠，获得大量珠芸香科易产生珠心胚。培养胚珠，获得大量珠心胚，用以品种复壮、快速繁殖和获得无病毒心胚，用以品种复壮、快速繁殖和获得无病毒苗。同时，通过珠心组织培养，产生胚性愈伤苗。同时，通过珠心组织培养，产生胚性愈伤组织，建立胚性组织培养实验体系。组织，建立胚性组织培养实验体系。思考题思考题1、如何剥离幼胚？、如何剥离幼胚？2、为什么幼胚比成熟胚培养要、为什么幼胚比成熟胚培养要求的培养基成分复杂？求的培养基成分复杂？3、胚胎培养技术在育种工作中、胚胎培养技术在育种工作中有哪些应用？有哪些应用？
