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1、显微镜直接计数法汤国平一、实验目的一、实验目的1、明确显微镜计数的原理。、明确显微镜计数的原理。2学习运用血球计数板进展微生物计数学习运用血球计数板进展微生物计数的方法。的方法。二、实验资料二、实验资料 酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管、吸水纸等。玻片，无菌毛细管、吸水纸等。三、实验原理三、实验原理 利利用用血血球球计计数数板板在在显显微微镜镜下下直直接接计计数数，是是一一种种常常用用的的微微生生物物计计数数方方法法。此此法法的的优优点点是是直直观观、快快速速。将将经经过过适适当当稀稀释释的的菌菌悬悬液液或或孢孢子子悬悬液液放放在在血血球球计
2、计数数板板载载玻玻片片与与盖盖玻玻片片之之间间的的计计数数室室中中，在在显显微微镜镜下下进进展展计计数数。由由于于计计数数室室的的容容积积是是一一定定的的0.13，所所以以可可以以根根据据在在显显微微镜镜下下察察看看到到的的微微生生物物数数目目来来换换算算成成单单位位体体积积内内的的微微生生物物总总数数目目。由由于于此此法法计计得得的的是是活活菌菌体体和和死死菌菌体体的的总总和和，故故又又称为总菌计数法。称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，
3、微生物的计数就在计数室中进展。 计数室的刻度普通有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共也是400小格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是一样的。每一个大方格边长为1，那么每一大方格的面积为12，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1，所以计数室的容积为0.13。其计算方法如下：12516的计数板计算公式细胞数/ ml=(80小格内的细胞数 /80)40010000稀释倍数 =A/5 25 104 B21625的计数板计算公式细胞数/ ml=
4、(100小格内的细胞数 /100)40010000稀释倍数 =A/4 16 104 B四、操作过程四、操作过程1稀释将酵母菌悬液进展适当稀释，菌液如不浓，可不用稀释。2镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进展镜检。假设有污物，那么需清洗后才干进展计数。3加样品将清洁枯燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴不宜过多，使菌液沿缝隙靠毛细浸透作用自行进入计数室，普通计数室均能充溢菌液。留意不可有气泡产生。静置510分钟即可计数。4显微镜计数将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进展计数。在计数前假设发现菌液太浓或太稀，
5、需重新调理稀释度后再计数。普通样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。假设选用2516规格的计数板那么每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格即80个小格，假设选用1625规格的计数板，那么数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，即100小格中的菌体进展计数。位于格线上的菌体普通只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小到达母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5.对每个样品计数三次，取其平均值，计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。 各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml12345第一室第二室A-五个中方格的总菌数B-稀释倍数
6、6清洗血球计数板 血球汁数板运用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其枯燥。经过镜检察看每小格内能否残留菌体或其他沉淀物。假设不干净，那么必需反复清洗直到干净为止。 7.本卷须知1实验过程中发现，如何稀释？ 假设发现每小格中酵母菌的个数多于10个，可按以下处置：取1ml酵母菌培育液参与到盛有9ml蒸馏水的试管中，摇匀，再计数；如发现酵母菌的个数依然过大，那么同样再稀释一次，直至每小格中酵母菌的个数介于5-10，并作记录。2调理显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要留意光线不要偏向一边，否那么视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。 3因菌液在血球计数板处于不同空间，要在不同焦距下才干看全，所以，察看时必需不断调细螺旋调焦距长短，方可找全。4每个样品反复23次，假设两次差别太大应重测。
