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1、 1.测定微生物数量的常用方法有稀定微生物数量的常用方法有稀释涂布平涂布平 板法和板法和显微微镜直接直接计数法。数法。 2稀稀释涂布平板法常用来涂布平板法常用来统计活菌的数目，活菌的数目， 但但统计结果往往比活菌数目低。果往往比活菌数目低。3只有能合成只有能合成脲酶酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的唯一氮源的选择培养基分离培养基分离该细菌。菌。4鉴定分解尿素定分解尿素细菌的方法是在以尿素菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基唯一氮源的培养基中加入酚中加入酚红指示指示剂，据是否，据是否变红进行判断。行判断。 自读教材自读教材夯基础夯基础 1筛选菌株
2、的思路菌株的思路 (1)自然界中目的菌株的自然界中目的菌株的筛选： 依据：根据它依据：根据它对 的要求，到相的要求，到相应的的环境中境中去去寻找。找。 实例：例：PCR技技术过程中用到的耐高温的程中用到的耐高温的 ，就是从，就是从热泉中泉中筛选出来的出来的Taq细菌中提取出来的。菌中提取出来的。生存生存环境境Taq DNA聚聚合合酶酶 (2)实验室中目的菌株的室中目的菌株的筛选： 原理：人原理：人为提供有利于提供有利于 生生长的条件的条件(包括包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同，同时 其他微生物的生其他微生物的生长。 方法：利用方法：利用选择培养基分离。培养基分离。 a选择培养基：允培养
3、基：允许 微生物生微生物生长，同，同时 其他种其他种类微生物生微生物生长的培养基。的培养基。 b实例：例：选择分解尿素的分解尿素的细菌的培养基，以菌的培养基，以 作作为唯一氮源，只有能合成唯一氮源，只有能合成 的微生物才能分解尿素。的微生物才能分解尿素。目的菌株目的菌株抑制或阻止抑制或阻止特定特定阻止阻止或抑制或抑制尿素尿素脲酶酶稀稀释涂布平板涂布平板稀稀释度度活菌活菌 计数原数原则：一般：一般选择菌落数在菌落数在 的平板的平板进行行计数。数。 结果分析：果分析：统计的菌落数往往比活菌的的菌落数往往比活菌的实际数目数目 。原因是当两个或多个。原因是当两个或多个细胞胞连在一起在一起时，平板上，平
4、板上观察到的察到的只是只是 。 (2)其他方法：利用其他方法：利用 直接直接计数。数。30300低低一个菌落一个菌落显微微镜 圆褐固氮菌生活于土壤中，能以氮气作褐固氮菌生活于土壤中，能以氮气作为氮源。氮源。请探探讨、交流、交流实验室分离室分离圆褐固氮菌的方法。褐固氮菌的方法。 提示：提示：配制无氮培养基作配制无氮培养基作为选择培养基。培养基。 跟随名师跟随名师解疑难解疑难 1选择培养基的培养基的类型及作用型及作用 (1)在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可以。如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食度的食盐可得到金黄色葡可得到金
5、黄色葡萄球菌。萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上上加入。加入。 (2)改改变培养基中的培养基中的营养成分。如培养基中缺乏氮源养成分。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种上生存。当培养基的某种营养成分养成分为特定化学成分特定化学成分时，也，也具有分离效果。具有分离效果。 (3)改改变微生物的培养条件。如将培养基放在高温微生物的培养条件。如将培养基放在高温环境境中培养只能得到耐高温的微生物。中培养只能得到耐高温的微生物。 2统计菌落数目菌落数
6、目 (1)稀稀释涂布平板法：涂布平板法： 原理：当原理：当样品的稀品的稀释度足度足够高高时，培养基表面生，培养基表面生长的一个菌落，来源于的一个菌落，来源于样品稀品稀释液中的一个活菌。通液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推平板上的菌落数，就能推测出出样品中大品中大约含有多少活菌。含有多少活菌。为了保了保证结果准确，一般果准确，一般选择菌落数在菌落数在30300的平板的平板进行行计数。数。 注意事注意事项： a设置重复置重复组：同一稀：同一稀释度下，至少涂布度下，至少涂布3个平板作个平板作为重复重复组，才能增，才能增强强实验的的说服力与准确性。分析服力与准确性。分析结果果时，需考需考虑
7、重复重复组的的结果是否一致，果是否一致，结果不一致，意味着操作果不一致，意味着操作有有误，需要重新，需要重新实验。 特特别提醒提醒教材中的教材中的实例例说明了明了设置重复置重复组的重要的重要性。第一位同学只涂布了性。第一位同学只涂布了1个平板，没有个平板，没有设置重复置重复组，因，因此此结果不具有果不具有说服力。第二位同学考服力。第二位同学考虑到到设置重复置重复组的的问题，涂布了，涂布了3个平板，但是，其中个平板，但是，其中1个平板的个平板的计数数值结果与果与另另2个相差太个相差太远，说明在操作明在操作过程中可能出程中可能出现了了错误，因，因此，不能此，不能简单地将地将3个平板的个平板的计数数
8、值用来求平均用来求平均值。 b设置置对照：目的是排除照：目的是排除实验中非中非测试因素因素对实验结果的影响，提高果的影响，提高实验的可信度。的可信度。 计算公式：每克算公式：每克样品中的菌株数品中的菌株数(CV)M。 C：代表某一稀：代表某一稀释度下平板上生度下平板上生长的平均菌落数。的平均菌落数。 V：代表涂布平板：代表涂布平板时所用的稀所用的稀释液的体液的体积。 M：代表稀：代表稀释倍数。倍数。 (2)显微微镜直接直接计数法：数法： 原理：此法利用特定原理：此法利用特定细菌菌计数板或血球数板或血球计数板，在数板，在显微微镜下下计算一定容算一定容积的的样品中微生物的数量。品中微生物的数量。
9、缺点：不能区分缺点：不能区分细菌的死活。菌的死活。 方法：用方法：用计数板数板计数。数。计数板是一数板是一块特制的特制的载玻片，玻片，上面有一个特定的面上面有一个特定的面积为1 mm2和高和高为0.1 mm的的计数室，数室，在在1 mm2的面的面积里又被划分成里又被划分成25个个(或或16个个)中格，每个中格中格，每个中格进一步划分成一步划分成16个个(或或25个个)小格，但小格，但计数室都是由数室都是由400个小个小格格组成的。如成的。如图所示。所示。 自读教材自读教材夯基础夯基础 有机有机质中性中性38 cm30300温度温度时间数目数目稳定定 (4)计数：当菌落数目数：当菌落数目稳定定时
10、，取同一，取同一 下的下的3个平个平板板进行行计数，求出数，求出 ，并根据所，并根据所对应的的 计算出算出样品中品中细菌的数目菌的数目稀稀释度度平均平均值稀稀释度度 2菌种菌种鉴定定 (1)原理：分解尿素的原理：分解尿素的细菌合成的菌合成的脲酶酶将尿素分解将尿素分解为 ，使培养基的使培养基的 增增强强。 (2)方法：在以方法：在以 为唯一氮源的培养基中加入唯一氮源的培养基中加入 指示指示剂培养培养细菌，若指示菌，若指示剂变 ，可确定，可确定该种种细菌能菌能够分解尿分解尿素。素。氨氨碱性碱性尿素尿素酚酚红红 1当第一次当第一次测定定时为什么要将稀什么要将稀释的范的范围放放宽一些一些？ 提示：提示
11、：为确保能从中确保能从中选择出菌落数在出菌落数在30300之之间的的平板平板进行行计数。数。 2为什么要什么要选取菌落数目取菌落数目稳定定时的的记录作作为结果？果？ 提示：提示：防止因培养防止因培养时间不足而不足而导致致遗漏菌落的数目。漏菌落的数目。 跟随名师跟随名师解疑难解疑难 1操作中的注意事操作中的注意事项 (1)无菌操作：无菌操作：铁铲和信封都要和信封都要灭菌。称取土壤、将称菌。称取土壤、将称好的土好的土样倒入倒入锥形瓶、稀形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在酒精土壤溶液，每一步都要在酒精灯的火焰旁灯的火焰旁进行。行。 (2)做好做好标记：如在培养皿上注明培养基种：如在培养皿上注明培养基种
12、类、培养日、培养日期以及培养期以及培养样品的稀品的稀释度等。度等。 2结果分析与果分析与评价价 (1)培养物中是否有培养物中是否有杂菌菌污染以及染以及选择培养基是否培养基是否筛选出出菌落：菌落：对照的培养皿在培养照的培养皿在培养过程中没有菌落生程中没有菌落生长，说明培养明培养基没有被基没有被杂菌菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于大于选择培养基的数目，培养基的数目，说明明选择培养基已培养基已筛选出一些菌落。出一些菌落。 (2)样品的稀品的稀释操作是否成功：如果得到了操作是否成功：如果得到了2个或个或2个以上个以上菌落数目在菌落数目在30300的平板，的平板，则说明
13、稀明稀释操作比操作比较成功，并能成功，并能够进行菌落的行菌落的计数。数。 (3)重复重复组的的结果是否一致：如果不同同学果是否一致：如果不同同学选取的是同一取的是同一种土种土样，统计的的结果果应该接近。如果接近。如果结果相差太果相差太远，需要分，需要分析析产生差异的原因。生差异的原因。 例例1 下表是培养分解尿素的下表是培养分解尿素的细菌的培养基配方，菌的培养基配方，请回答下面的回答下面的问题：编号号成分成分含量含量KH2PO41.4 g Na2HPO42.1 g MgSO47H2O0.2 g 葡萄糖葡萄糖10.0 g 尿素尿素1.0 g 琼脂脂15.0 g 将上述物将上述物质溶解后，用自来水
14、定容到溶解后，用自来水定容到1 000 mL (1)在在该培养基的配方中，培养基的配方中，为微生物提供碳源的是微生物提供碳源的是_，提供氮源的是，提供氮源的是_。 (2)绝大多数微生物都能利用大多数微生物都能利用_，但是，只有，但是，只有能合成能合成脲酶酶的微生物才能分解的微生物才能分解_。 (3)分析分析该培养基的配方，培养基的配方，该培养基培养基对微生物是否具微生物是否具有有选择作用？如果具有，又是如何作用？如果具有，又是如何进行行选择的？的？ 解析解析碳源是提供碳元素的物碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元，氮源是提供氮元素的物素的物质，所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。，所以碳源是葡萄糖
15、，氮源是尿素。该培养基的培养基的配方中含有凝固配方中含有凝固剂琼脂，所以，配制的一定脂，所以，配制的一定为固体培固体培养基。养基。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶酶的微生物才能分解尿素，所以的微生物才能分解尿素，所以这种培养基种培养基对微生物有微生物有选择作用。作用。选择的原理是只有能的原理是只有能够利用尿素的微生物才能利用尿素的微生物才能够生生长。 答案答案(1)葡萄糖尿素葡萄糖尿素 (2)葡萄糖尿素葡萄糖尿素 (3)该培养基培养基对微生物具有微生物具有选择作用。以尿素作用。以尿素为唯一氮唯一氮源的培养基可以分离得到源的培养基可以分离
16、得到产生生脲酶酶的微生物的微生物(即分解尿素的即分解尿素的微生物微生物)。 (1)病毒病毒为非非细胞胞结构生物体，构生物体，专营活活细胞内寄生生活，胞内寄生生活，目前不能利用人工培养基来培养。目前不能利用人工培养基来培养。 (2)能能够在在选择培养基上生培养基上生长的微生物不一定是的微生物不一定是实验所需所需要的微生物，因要的微生物，因为有些微生物可利用其他微生物的代有些微生物可利用其他微生物的代谢产物物进行生行生长繁殖，因此繁殖，因此还需要需要对分离后的微生物分离后的微生物进行行鉴定。定。 例例2 自然界中的微生物往往是混自然界中的微生物往往是混杂生生长的。人的。人们在研究微生在研究微生物物
17、时一般要将它一般要将它们分离提分离提纯，然后，然后进行数量的行数量的测定。下面是定。下面是对大大肠杆菌杆菌进行数量行数量测定的定的实验，请回答有关回答有关问题。 实验步步骤： (1)制制备稀稀释倍数倍数为102、103、104、105、106的系列稀的系列稀释液。液。 (2)选用用_法接种法接种样品。品。 (3)适宜温度下培养。适宜温度下培养。 结果分析：果分析： (1)测定的大定的大肠杆菌数，在杆菌数，在对应稀稀释倍数倍数为106的培养的培养基中，得到以下几种基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是果，正确可信的是 () A一个平板，一个平板，统计的菌落数是的菌落数是23 B两个平板，两个平
18、板，统计的菌落数分的菌落数分别是是22和和26，取平均，取平均值24 C三个平板，三个平板，统计的菌落数分的菌落数分别是是21、5和和52，取平，取平均均值26 D四个平板，四个平板，统计的菌落数分的菌落数分别是是21、30、24和和25，取平均，取平均值25 (2)一同学在稀一同学在稀释倍数倍数为105的培养基中的培养基中测得平板上菌落得平板上菌落数的平均数的平均值为23.4，那么每毫升，那么每毫升样品中的菌株数是品中的菌株数是(涂布平涂布平板板时所用稀所用稀释液的体液的体积为0.2 mL)_。 (3)用用这种方法种方法测定密度，定密度，实际活菌数量要比活菌数量要比测得的数得的数量量_，因，
19、因为_。 (4)某同学在某同学在测定大定大肠杆菌的密度杆菌的密度时发现，在培养基上，在培养基上还有其他有其他杂菌的菌落，能否肯定菌的菌落，能否肯定该大大肠杆菌的品系被杆菌的品系被污染染了？了？为什么？什么？ 答案答案实验步步骤：(2)稀稀释涂布平板涂布平板 结果分析：果分析：(1)D(2)1.17108(3)多当两个或多个多当两个或多个细胞胞连在一起在一起时，平板上，平板上观察的是一个菌落察的是一个菌落(4)不能。因不能。因为不能排除不能排除杂菌来自培养基或培养菌来自培养基或培养过程。程。 本本题出出错原因是不理解菌落数目的原因是不理解菌落数目的统计规则。实验时，每一个，每一个浓度至少涂布三个平板，以增度至少涂布三个平板，以增强强实验的的说服服力和准确性。当力和准确性。当样品的稀品的稀释倍数足倍数足够高高时，培养基表面生，培养基表面生长的一个菌落来源于的一个菌落来源于样品稀品稀释液中的一个活菌。液中的一个活菌。计数数时选择菌落数在菌落数在30300的平板的平板计数，若某两个或多个稀数，若某两个或多个稀释浓度度下下获得的菌落数符合条件得的菌落数符合条件时，再看两者菌落数的比，再看两者菌落数的比值：若：若小于小于2，则取两者的平均取两者的平均值；若大于；若大于2，则取小者。取小者。
