《分子生物学(杨洋)第三章-dna的复制-thereplicationofdna》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学(杨洋)第三章-dna的复制-thereplicationofdna（168页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Welcome to My Molecular Biology ClassYang Yang（杨洋（杨洋 教授）教授） Huazhong University of Science and TechnologyMolecular Biology of the Gene, 5/E - Watson et al. (2004)Part I: Chemistry and Genetics Part II: Maintenance of the Genome Part III: Expression of the GenomePart IV: RegulationPart V: MethodsPart
2、 II: Maintenance of the GenomeDedicated to the structure of DNA and the processes that propagate, maintain and alter it from one cell generation to the nextCHAPTER 3: The replication CHAPTER 3: The replication of DNA (DNAof DNA (DNA的复制）的复制）的复制）的复制） The revised central dogmaTranslationRNA processingR
3、NA processingDNA repair基基因因组组的的保保持持基基因因组组的的表表达达1. The Chemistry of DNA Synthesis(DNA合成的化学基础）合成的化学基础）2. The Mechanism of DNA Polymerase（DNA聚合酶的聚合酶的作用机制）作用机制）3. The Specialization of DNA Polymerases（DNA聚合聚合酶的特化）酶的特化）4. The Replication Fork（复制叉）（复制叉）5. DNA Synthesis at the Replication Fork（复制叉上的（复制叉上的D
4、NA合成）合成）6. Initiation of DNA Replication（复制的起始）（复制的起始）7. Binding and Unwinding（结合和解旋）（结合和解旋）8. Finishing Replication（复制的终止）（复制的终止）OutlineThefirstpartdescribesthebasicchemistryofDNAsynthesisandthefunctionoftheDNApolymerase1. The Chemistry of DNA Synthesis1.1 DNA synthesis requires deoxynucleoside tri
5、phosphates and a primer:template junction2.（DNA合成需要脱氧核苷三磷酸和引物合成需要脱氧核苷三磷酸和引物-模板接头）模板接头）DNA合成必须具备的两个关键底物：合成必须具备的两个关键底物：1.四种脱氧核苷三磷酸四种脱氧核苷三磷酸-dATP,dGTP,dCTP,dTTP2.2.引物引物-模板接头（模板接头（primer:templatejunction）SubstratesrequiredforDNAsynthesis2-脱氧核糖核苷三磷酸脱氧核糖核苷三磷酸退火引物退火引物DNA的生长末端的生长末端模板链模板链 1.2DNAissynthesized
6、byextendingthe3endoftheprimer(DNA通过引物通过引物3端的延伸进行合成）端的延伸进行合成）DNA合成由掺入合成由掺入dNTP的的 -磷酸的亲核攻击磷酸的亲核攻击引发，导致引物引发，导致引物3端端延伸一个核苷酸，并延伸一个核苷酸，并释放一个焦磷酸释放一个焦磷酸1.3Hydrolysisofpyrophosphate(PPi)isthedrivingforceforDNAsynthesis（焦磷酸水解是（焦磷酸水解是DNA合成的驱动力）合成的驱动力）2. The mechanism of DNA Polymerase (Pol)（DNA聚合酶的作用机制）聚合酶的作用机
7、制）2.1 DNA Pol use a single active site to catalyze DNA synthesis （DNA聚合酶用一个活性位点催化聚合酶用一个活性位点催化DNA的的合成）合成）A single site to catalyze the addition of any of the four dNTPs（DNA聚合酶用一个活性位点来催化任意聚合酶用一个活性位点来催化任意4种脱氧核苷三磷种脱氧核苷三磷酸的添加）酸的添加）Recognition of different dNTP by monitoring the ability of incoming dNTP i
8、n forming A-T and G-C base pairs（DNA聚合聚合酶监视引入核苷酸形成酶监视引入核苷酸形成A-T或或G-C碱基对的能力，而不是检测进入碱基对的能力，而不是检测进入活性位点的是何种核苷酸）活性位点的是何种核苷酸）只有在形成正确碱基对的情况下，引物的只有在形成正确碱基对的情况下，引物的3-羟基和在最佳催化位置上羟基和在最佳催化位置上的引入核苷三磷酸的的引入核苷三磷酸的 -磷酸才能发生催化反应磷酸才能发生催化反应 Incorrect base pair dramatically lowers the rate of catalysis（错（错误核苷酸掺入的速率是碱基配对
9、正确时掺入速率的误核苷酸掺入的速率是碱基配对正确时掺入速率的1/10000） Distinguishing different Distinguishing different dNTPsdNTPs: : kinetic selectivity kinetic selectivity 不正确的不正确的A-A碱基配对使引入核苷酸的碱基配对使引入核苷酸的 -磷酸错位，极大地降低了磷酸错位，极大地降低了催化速率，导致催化速率，导致DNA聚合酶优先添加正确配对的聚合酶优先添加正确配对的dNTPDistinguishing between rNTP and dNTP by stericsteric ex
10、clusion exclusion of rNTPs from the active site (空间位阻阻止空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用聚合酶催化反应使用rNTP-核糖核苷三磷酸）核糖核苷三磷酸）DNA聚合酶对核糖核苷三磷酸与脱氧核糖核苷三磷酸显示出令人惊异聚合酶对核糖核苷三磷酸与脱氧核糖核苷三磷酸显示出令人惊异的分辨能力的分辨能力虽然细胞中虽然细胞中rNTP比比dNTP浓度要高浓度要高10倍，但它们掺入的速率却是倍，但它们掺入的速率却是dNTP的的1/10002.2DNAPolresembleahandthatgripstheprimer-templatejunction(DNA聚
11、合酶像手掌一样握住引物聚合酶像手掌一样握住引物-模板接头）模板接头）ThumbFingersPalmDNADNA聚合酶的聚合酶的聚合酶的聚合酶的3 3个结构域：拇指，手指，手掌个结构域：拇指，手指，手掌个结构域：拇指，手指，手掌个结构域：拇指，手指，手掌（拇指）（拇指）（手指）（手指）（手掌）（手掌）1.Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs and one for removal of the mispaired dNTP. 2.2.The polymerization site: The polymerization
12、site: 1.1.(1)(1) binds to two metal ions（Mg2+, Zn2+) that alter the chemical environment around the catalytic site and lead to the catalysis（结合（结合2个二价金属离子，可以改变个二价金属离子，可以改变正确碱基配对的正确碱基配对的dNTP和和3-羟基周围的化学环境）羟基周围的化学环境）2.(2) Monitors the accuracy of base-pairing for the most recently added nucleotides (检查
13、最新加入的碱基配对的检查最新加入的碱基配对的准确性，错误配对使催化活性显著降低，使引物准确性，错误配对使催化活性显著降低，使引物-模板接头模板接头从聚合酶活性位点上脱离下来，并结合到聚合酶上的一个从聚合酶活性位点上脱离下来，并结合到聚合酶上的一个独立的具有校对功能的核酸酶的活性位点上）独立的具有校对功能的核酸酶的活性位点上）3.3. Exonuclease site/proof reading site（校对功能，外切（校对功能，外切核酸酶活性位点）核酸酶活性位点）DNAPolymerase-palmdomain(手掌域）手掌域）手掌域）手掌域）Binds to the incoming dN
14、TP, encloses the correct paired dNTP to the position for catalysis（手指域中（手指域中的几个残基可以和引入的的几个残基可以和引入的dNTP结合，一旦结合，一旦形成正确的形成正确的碱基配对后，手指域即发生移动，包围住碱基配对后，手指域即发生移动，包围住dNTP）这种闭合形式可以使引入的核苷酸与催化性的金属离子密这种闭合形式可以使引入的核苷酸与催化性的金属离子密切接触，从而促进催化反应切接触，从而促进催化反应手指域还与模板区结合，使模板的磷酸二酯键骨架手指域还与模板区结合，使模板的磷酸二酯键骨架在活性部位后立即产生约在活性部位后立即
15、产生约90度的回折。此弯曲度的回折。此弯曲仅使催化位点上引物后的第一个模板碱基暴露仅使催化位点上引物后的第一个模板碱基暴露DNAPolymerase-fingerdomain（手指域）（手指域）（手指域）（手指域）ThumbFingersPalm（拇指）（拇指）（手指）（手指）（手掌）（手掌）模板上的弯折模板上的弯折模板碱基模板碱基模板模板引物引物Not directly involved in catalysisInteracts with the synthesized DNA （与（与最新合成的最新合成的DNA相互作用）相互作用） maintain correct position of
16、 the primer and the active site（维持引物及活性部（维持引物及活性部位的正确位置）位的正确位置） maintain a strong association between DNA Pol and its substrate（维持（维持DNA聚合酶与其底物之间的紧密连接）聚合酶与其底物之间的紧密连接）DNAPolymerase-thumbdomain（拇指域）（拇指域）（拇指域）（拇指域）2.3DNAPolareprocessiveenzymes（DNA聚合酶是一种延伸酶）聚合酶是一种延伸酶）DNA合成的速度主要取决于合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力（催
17、化聚合酶的延伸能力（催化是快速的，每秒添加是快速的，每秒添加1000个核苷酸）个核苷酸）Processivity（延伸能力）（延伸能力） is a characteristic of enzymes that operate on polymeric substrates（酶（酶处理多聚体底物的一种特性）处理多聚体底物的一种特性）The processivity of DNA Pol is the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction （ DNA聚合酶的
18、延伸能力聚合酶的延伸能力定义为每次酶与引物定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平模板接头结合时所添加核苷酸的平均数）均数） 每个每个DNA聚合酶都有其特征性的延伸能力，范围从每次结聚合酶都有其特征性的延伸能力，范围从每次结合后时仅几个核苷酸到合后时仅几个核苷酸到5000多个碱基多个碱基The rate of DNA synthesis is closely related to the polymerase processivity, because the rate-limiting step is the initial binding of polymerase to the
19、 primer-template junction（聚合酶与引物（聚合酶与引物-模板接头的最初结合模板接头的最初结合是限速步骤，一旦结合后核苷酸的添加就非常迅是限速步骤，一旦结合后核苷酸的添加就非常迅速了）速了）高延伸性的聚合酶与一个完全非延伸性的酶相比，高延伸性的聚合酶与一个完全非延伸性的酶相比，其其DNA合成的整体速率可高出合成的整体速率可高出1000倍倍假设的非延伸性假设的非延伸性DNA聚合酶聚合酶延伸性延伸性DNA聚合酶聚合酶添加添加1个个dNTP然后释放下来然后释放下来延伸性的延伸性的DNA聚合酶与聚合酶与模板结合一次，就能模板结合一次，就能添加很多添加很多dNTP2.4Exonuc
20、leasesproofreadnewlysynthesizedDNA（外切核酸酶负（外切核酸酶负责校正新合成的责校正新合成的DNA)仅仅依靠碱基配对的几何学和碱基间互补性的系统，无法达到细仅仅依靠碱基配对的几何学和碱基间互补性的系统，无法达到细胞内观察到的极高的胞内观察到的极高的DNA合成精确度（约每添加合成精确度（约每添加1010个碱基对个碱基对产生一个错误）产生一个错误）影响影响DNA聚合酶精确度的主要因素是碱基偶然变换成聚合酶精确度的主要因素是碱基偶然变换成“错误错误”的的互变异构体（亚氨基或者烯醇）互变异构体（亚氨基或者烯醇）碱基的这种变构体使不正确的碱基对可以位于催化中正确的位置。碱
21、基的这种变构体使不正确的碱基对可以位于催化中正确的位置。校正可以纠正这种错误校正可以纠正这种错误DNA合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸来实合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸来实现的现的The mismatched dNMP is removed by proofreading exonuclease（校正外切核酸酶）（校正外切核酸酶）, a part of the DNA polymerase（DNA聚合酶的一部分）聚合酶的一部分）n当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时，校当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时，校正外切核酸酶可将此核苷酸从引物链的正外切核酸酶可将此
22、核苷酸从引物链的3端去端去除除n给了给了DNA聚合酶第二次添加正确核苷酸的机聚合酶第二次添加正确核苷酸的机会会1.DNA合成缓慢或合成缓慢或无无DNA合成合成错配的最后一个碱基对错配的最后一个碱基对外切核酸酶活性位点外切核酸酶活性位点2.错配核苷酸的去除错配核苷酸的去除3.重新进行重新进行DNA合成合成无需无需DNA脱离聚合酶即可脱离聚合酶即可进行校正，引物进行校正，引物-模板接头模板接头从从DNA聚合酶活性位点聚合酶活性位点滑动到外切核酸酶活性位点滑动到外切核酸酶活性位点当聚合酶把不正确核苷酸当聚合酶把不正确核苷酸掺入掺入DNA后，后，DNA合成合成速率降低，引物速率降低，引物3端与端与DN
23、A聚合酶活性位点聚合酶活性位点的亲和力减弱的亲和力减弱错配后引物的错配后引物的3端端与校正外切核酸酶与校正外切核酸酶活性位点的亲和力活性位点的亲和力增加，与此位点结合后增加，与此位点结合后错配核苷酸即被除去错配核苷酸即被除去当不正确的碱基对当不正确的碱基对被去除后，正确配对的被去除后，正确配对的引物引物-模板接头又滑回模板接头又滑回到到DNA聚合酶活性位点聚合酶活性位点n校正外切核酸酶校正外切核酸酶键盘上的键盘上的“delete”（删除）（删除）键键n只能将最近发生的错误去除掉只能将最近发生的错误去除掉n校正外切核酸酶极大地增加了校正外切核酸酶极大地增加了DNA合成的精确合成的精确度，从每添加
24、度，从每添加105个核苷酸插入个核苷酸插入1个错误碱基降个错误碱基降低到每添加低到每添加107个核苷酸插入个核苷酸插入1个错误碱基个错误碱基n但是仍然高于细胞中观察到的实际突变概率：每但是仍然高于细胞中观察到的实际突变概率：每添加添加1010个核苷酸出现个核苷酸出现1次错误）次错误）n下一章：复制后的错误修复下一章：复制后的错误修复3. The replication fork（复制叉）（复制叉）3.1 Both strands of DNA are synthesized together at the replication fork (复制叉上复制叉上DNA双链的两条链是同时进行复制的双
25、链的两条链是同时进行复制的)在细胞中，在细胞中，DNA双链的两条链时同时进行复制双链的两条链时同时进行复制的，这要求将双螺旋的两条链分开以形成两条的，这要求将双螺旋的两条链分开以形成两条DNA模板模板replicationfork： The junction between the newly separated template strands and the unreplicated duplex DNA （刚分开的模板链和未复制的双链（刚分开的模板链和未复制的双链DNA之间的连之间的连接区称为复制叉接区称为复制叉)Leadingstrand(前导链）前导链）Laggingstrand（后
26、随链）（后随链）OkazakifragmentReplicationfork已复制已复制DNA未复制未复制DNA前导链聚合酶运动方向前导链聚合酶运动方向后随链聚合酶运动方向后随链聚合酶运动方向总的总的DNA复制方向复制方向复制叉向着未复制的复制叉向着未复制的DNA双链区域运动，其身后留下指导两个双链区域运动，其身后留下指导两个子代子代DNA双链形成的两条单链双链形成的两条单链DNA模板模板nDNA的合成只能从的合成只能从53进行（沿着进行（沿着3端进行合成）端进行合成）n半不连续复制：半不连续复制：两条暴露的模板中只有一条能够随着复两条暴露的模板中只有一条能够随着复制叉的运动进行连续复制，在此
27、条模板链上，制叉的运动进行连续复制，在此条模板链上，DNA聚合聚合酶简单地尾随复制叉，此模板指导下新合成的酶简单地尾随复制叉，此模板指导下新合成的DNA链称链称为为前导链（前导链（Leadingstrand）n另一条模板链指导另一条模板链指导DNA聚合酶在与复制叉移动相反的方聚合酶在与复制叉移动相反的方向上运动，此模板指导下新合成的向上运动，此模板指导下新合成的DNA链称为链称为后随链（后随链（Laggingstrand），），此条此条DNA链必须以不连续方式进链必须以不连续方式进行合成行合成n在后随链上形成的新链在后随链上形成的新链DNA短片段称为短片段称为冈崎片段冈崎片段（Okazakif
28、ragment）：细菌中：细菌中1000-2000个核个核苷酸，真核生物中苷酸，真核生物中100-400个核苷酸个核苷酸n冈崎片段被合成出来之后，相互之间很快共价连接成一冈崎片段被合成出来之后，相互之间很快共价连接成一条连续的完整的新条连续的完整的新DNA链，因此冈崎片段是链，因此冈崎片段是DNA复制复制中短暂的中间产物中短暂的中间产物半不连续复制模型的提出和证明：冈崎半不连续复制模型的提出和证明：冈崎片段（片段（Okazakifragment）的发现）的发现连续复制连续复制半不连续复制半不连续复制不连续复制不连续复制nOkazaki选择选择T4噬菌体的噬菌体的DNA复制作为模型来研究复制作为
29、模型来研究n在逐渐缩短脉冲标记时间的情况下，用在逐渐缩短脉冲标记时间的情况下，用3H-脱氧胸苷脱氧胸苷来脉来脉冲标记进行冲标记进行T4噬菌体噬菌体DNA复制的大肠杆菌复制的大肠杆菌n2秒钟脉冲标记时间，通过超速离心测定新合成片段的大秒钟脉冲标记时间，通过超速离心测定新合成片段的大学学相对于离心管顶部的距离相对于离心管顶部的距离放放射射性性强强度度DNA短片段短片段DNA长片段长片段标记时间标记时间2秒秒标记时间标记时间120秒秒相对于离心管顶部的距离相对于离心管顶部的距离放放射射性性强强度度DNA连接酶基因连接酶基因缺陷的缺陷的T4噬菌体噬菌体标记时间标记时间60秒秒突变的噬菌体突变的噬菌体3
30、.2 The initiation of a new strand of DNA require an RNA primer（DNA新新链的起始需要一条链的起始需要一条RNA引物）引物）所有所有DNA聚合酶均需要带有游离聚合酶均需要带有游离3-羟基的引物，不能从头启动羟基的引物，不能从头启动新新DNA链的合成链的合成DNA新链合成是如何开始的？新链合成是如何开始的？细胞利用了细胞利用了RNA聚合酶有而聚合酶有而DNA聚合酶没有的聚合酶没有的能力：从头开始合成新能力：从头开始合成新RNA链链Primase （引物酶）（引物酶）is a specialized RNA polymerase ded
31、icated to making short RNA primers on an ssDNA template. Do not require specific DNA sequence.（引物（引物酶是一种能在单链酶是一种能在单链DNA模板上制造短模板上制造短RNA引物引物的特殊的的特殊的RNA聚合酶，这些引物随后由聚合酶，这些引物随后由DNA聚聚合酶进行延伸）合酶进行延伸）DNA Pol can extend both RNA and DNA primers annealed to DNA template （DNA聚合酶用与聚合酶用与DNA模板退火的模板退火的RNA引物或引物或DNA引物
32、都能够启动合成）引物都能够启动合成）n前导链和后随链都需要引物酶来起始前导链和后随链都需要引物酶来起始DNA的合成。的合成。但是引物酶在这两条链上的工作频率却相差极大但是引物酶在这两条链上的工作频率却相差极大-why?n每条前导链只需要一条每条前导链只需要一条RNA引物，相反后随链的不引物，相反后随链的不连续合成意味着每个冈崎片段都需要新引物连续合成意味着每个冈崎片段都需要新引物n所以后随链的合成需要数百至数千的冈崎片段及其所以后随链的合成需要数百至数千的冈崎片段及其相关相关RNA引物引物n引物酶不需要特异引物酶不需要特异DNA序列来起始新序列来起始新RNA引物的引物的合成，相反引物酶只有在与
33、其它合成，相反引物酶只有在与其它DNA复制蛋白如复制蛋白如DNA解旋酶结合时才被激活解旋酶结合时才被激活n引物酶一旦被激活，即用最新暴露的后随链模板合引物酶一旦被激活，即用最新暴露的后随链模板合成成RNA引物，而这种合成是没有序列特异性的引物，而这种合成是没有序列特异性的3.3 RNA primers must be removed to complete DNA replication（完成（完成DNA复制复制必须去除必须去除RNA引物，并用引物，并用DNA取而代之）取而代之）n为了用为了用DNA取代取代RNA引物，引物，RNA酶酶H识别并识别并除去各条除去各条RNA引物的大部分引物的大部分
34、nRNA酶酶H特异性地降解与特异性地降解与DNA碱基配对的碱基配对的RNA（H：RNA-DNA杂交链中的杂交）杂交链中的杂交）n除了与除了与DNA末端直接相连的末端直接相连的RNA引物外，引物外，RNA酶酶H可除去其它所有的可除去其它所有的RNA引物引物nRNA酶酶H只能断裂只能断裂2个核糖核苷酸之间的键个核糖核苷酸之间的键A joint efforts of RNase H, DNA polymerase & DNA ligase （RNA酶酶H: 特异性降解特异性降解与与DNA碱基配对的碱基配对的RNA ； 5-核酸外切酶；核酸外切酶； DNA聚合酶；聚合酶； DNA连接酶连接酶-填充切口
35、）填充切口）只有当所有的只有当所有的RNA引物都被替代而且相关的切口均被填充后，引物都被替代而且相关的切口均被填充后，DNA的合成才结束的合成才结束nDNA连接酶（连接酶（DNAligase)：在毗邻的：在毗邻的5-磷酸基团和磷酸基团和3-羟基之间形成一个磷酸羟基之间形成一个磷酸二酯键，填充切口二酯键，填充切口3.4 DNA helicases unwind the double helix in advance of the replication fork（DNA解旋酶在复制解旋酶在复制叉之前解开双螺旋）叉之前解开双螺旋）nDNA聚合酶解离双链聚合酶解离双链DNA的能力很差的能力很差nDN
36、A解旋酶（解旋酶（DNAhelicase）：催化：催化双链双链DNA两条链的分离两条链的分离n这种酶使用这种酶使用ATP水解的能量结合到单链水解的能量结合到单链DNA上，并沿着其定向移动，以去除任何上，并沿着其定向移动，以去除任何退火到其结合的单链退火到其结合的单链DNA上的上的DNA链链DNA解旋酶分离双螺旋的两条链解旋酶分离双螺旋的两条链DNA解旋酶解旋酶（环形的六聚体蛋白）与后随链模板结合与后随链模板结合为解旋酶的运动提供能量为解旋酶的运动提供能量5-3极性：说明极性：说明DNA解旋解旋酶与复制叉上的后随链模板结合酶与复制叉上的后随链模板结合nDNA解旋酶的延伸性解旋酶的延伸性(Proc
37、essivity)：每每次和底物集合后可解开次和底物集合后可解开DNA上的多个碱基对，上的多个碱基对，具有高度的延伸能力，解旋酶只有到达其环具有高度的延伸能力，解旋酶只有到达其环绕的绕的DNA末端时才被解离下来末端时才被解离下来nDNA解旋酶的极性（解旋酶的极性（polarity):解旋酶在解旋酶在单链单链DNA上都沿着一定的方向运动，上都沿着一定的方向运动，5-3，3-5。此方向始终是根据其结合的。此方向始终是根据其结合的DNA链而不是去除的那一条链决定的链而不是去除的那一条链决定的n解旋酶沿单链解旋酶沿单链DNA的运动也需要化学能量的的运动也需要化学能量的提供提供ATP水解提供能量水解提供
38、能量3.5 Single-stranded binding proteins (SSBs) stabilize single-stranded DNA（单链结合蛋白使单链（单链结合蛋白使单链DNA稳定）稳定）n新产生的单链新产生的单链DNA必须保持碱基未配对状态，直至必须保持碱基未配对状态，直至可被用作可被用作DNA合成的模板为止合成的模板为止n为了使分开的链稳定，为了使分开的链稳定，单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB）迅速地结合其上迅速地结合其上n一个一个SSB的结合会促进另一个的结合会促进另一个SSB与其紧邻的单链与其紧邻的单链DNA结合结合-协同结合（协同结合（Cooperativ
39、eCooperativebindingbinding），），），），SSBSSB分子相互之间也能够结合，大大分子相互之间也能够结合，大大分子相互之间也能够结合，大大分子相互之间也能够结合，大大稳定了稳定了稳定了稳定了SSBSSB与单链与单链与单链与单链DNADNA之间的相互作用之间的相互作用之间的相互作用之间的相互作用n n协同结合使单链协同结合使单链协同结合使单链协同结合使单链DNA随着随着DNA解旋酶的释放而很快解旋酶的释放而很快被被SSB所覆盖，一旦覆盖，单链所覆盖，一旦覆盖，单链DNA即处于伸直状即处于伸直状态，抑制分子间的碱基配对态，抑制分子间的碱基配对nSSB以序列非特异性方式与单
40、链以序列非特异性方式与单链DNA相互作用：静相互作用：静电相互作用，无氢键作用电相互作用，无氢键作用CooperativeCooperative bindingbinding（协同结合）协同结合）额外的额外的SSB优先结合到先前已有优先结合到先前已有SSB分子分子结合的结合的DNA附近。只有当最初结合的单链附近。只有当最初结合的单链DNA被被SSB完全覆盖完全覆盖后，其它后，其它DNA分子才发生结合分子才发生结合SSB额外额外SSB的结合的结合3.6 Topoisomerase removes supercoils produced by DNA unwinding at the replic
41、ation fork（拓扑异构酶除去（拓扑异构酶除去DNA解螺解螺旋时在复制叉上产生的超螺旋旋时在复制叉上产生的超螺旋）3.7 Replication fork enzymes extend the range of DNA polymerase substrate （复制（复制叉酶扩大了叉酶扩大了DNA聚合酶底物的范围）聚合酶底物的范围）nDNA聚合酶本身只能使与单链聚合酶本身只能使与单链DNA模板退火的引物有效模板退火的引物有效的延长。而引物酶，的延长。而引物酶，DNA解旋酶以及拓扑异构酶（复制解旋酶以及拓扑异构酶（复制叉上工作的酶）等极大地扩大了叉上工作的酶）等极大地扩大了DNA聚合酶可
42、能的底物聚合酶可能的底物范围范围n引物酶提供了在任何单链引物酶提供了在任何单链DNA上都能起始新的上都能起始新的DNA链链的能力的能力nDNA解旋酶对双链的解离和拓扑异构酶对正超螺旋的解旋酶对双链的解离和拓扑异构酶对正超螺旋的消除使消除使DNA聚合酶能够复制双链聚合酶能够复制双链DNAn虽然不同生物中这些蛋白质名称不同，但是细菌，酵虽然不同生物中这些蛋白质名称不同，但是细菌，酵母，人等生物均使用这一套酶的活性来完成母，人等生物均使用这一套酶的活性来完成DNA的复的复制制保守性保守性大肠杆菌：大肠杆菌：引物酶：引物酶：DnaGDNA解旋酶解旋酶:DnaB如何证明大肠杆菌的如何证明大肠杆菌的Dna
43、B蛋白具有蛋白具有DNA解旋酶的功能？解旋酶的功能？环状的环状的M13噬菌体噬菌体DNA5-端端32P标记的短线性标记的短线性DNA游离的游离的5-端端32P标记标记的短线性的短线性DNA引物酶：引物酶：DnaGDNA解旋酶解旋酶:DnaBSSB：单链结合蛋白：单链结合蛋白-游离的游离的5-端端32P标记标记的短线性的短线性DNA-1.DNA Pol can not accomplish replication without the help of other enzymes 2.The born and death of a RNA primer: primase and RNase H/
44、exonuclease/DNA Pol/ligase3.Dealing the DNA structure (helicase, topoisomerase, SSB)nDNA解旋酶以及拓扑异构酶行使其功能时，并没有解旋酶以及拓扑异构酶行使其功能时，并没有永久性地改变永久性地改变DNA的化学结构，只是使的化学结构，只是使DNA分子的分子的构象发生改变构象发生改变nDNA解旋酶仅仅将解旋酶仅仅将DNA双链维持在一起的氢键打开双链维持在一起的氢键打开而没有断裂任何共价键而没有断裂任何共价键n构象的变化对于双链构象的变化对于双链DNA分子的复制是至关重要的分子的复制是至关重要的n在复制叉上工作的蛋白
45、质与在复制叉上工作的蛋白质与DNA密切作用，但采用密切作用，但采用的是序列非特异性的方式的是序列非特异性的方式n很多蛋白质具有很多蛋白质具有环绕环绕(DNA解旋酶）或者包裹解旋酶）或者包裹DNA （DNA聚合酶）聚合酶）的功能，以保持与的功能，以保持与DNA的结合的结合4. The specialization of DNA polymerases（DNA聚合酶的特化）聚合酶的特化）4.1DNAPolsarespecializedfordifferentrolesinthecell（细胞中（细胞中DNA聚合酶为行使不同功能聚合酶为行使不同功能而被特化）而被特化）nDNA聚合酶在高效而精确复制基
46、因组过程聚合酶在高效而精确复制基因组过程中处于核心地位中处于核心地位n细胞中具有多种被特化的细胞中具有多种被特化的DNA聚合酶聚合酶n原核生物和真核生物原核生物和真核生物n原核生物原核生物-大肠杆菌大肠杆菌5种种DNA聚合酶：聚合酶：nDNA聚合酶聚合酶III（DNAPloIII):染色体复制中最主染色体复制中最主要的酶，很强的延伸能力要的酶，很强的延伸能力DNA聚合酶聚合酶III核心酶核心酶DNA聚合酶聚合酶III全酶全酶更大的具有高度延伸能力的复合体更大的具有高度延伸能力的复合体有校正外切核酸酶活性有校正外切核酸酶活性高度精确性高度精确性nDNA聚合酶聚合酶I（DNAPloI):专门用于除
47、去起始专门用于除去起始DNA合成所需的合成所需的RNA引物，具有引物，具有5核酸外核酸外切酶活性，可以去除切酶活性，可以去除RNA酶酶H所不能除去所不能除去RNA-DNA连接连接(能能将将DNA合成位点最上游的合成位点最上游的RNA引物迅速除去）引物迅速除去）延伸能力不强，每次结合仅能添加延伸能力不强，每次结合仅能添加20-100个核苷酸。适用于个核苷酸。适用于RNA引物的去除和在所产生的单链引物的去除和在所产生的单链DNA缺口中进行缺口中进行DNA的合的合成成有校正外切核酸酶活性有校正外切核酸酶活性-高度精确性高度精确性nDNA聚合酶聚合酶II,IV,V:用于用于DNA修复，无校正活性修复，
48、无校正活性n真核生物真核生物-15种种DNA聚合酶：聚合酶：对于真核生物基因组复制至关重要的有对于真核生物基因组复制至关重要的有3种：种：DNA PolDNA Pol DNA Pol /primase：参与新：参与新DNA链的起始，四链的起始，四亚基蛋白复合体由二亚基的亚基蛋白复合体由二亚基的DNA Pol 和和二亚基二亚基的引物酶组成。引物酶合成的引物酶组成。引物酶合成RNA引物后，所产生引物后，所产生的的RNA引物引物-模板接头立即与模板接头立即与DNA Pol 结合以启结合以启动动DNA合成合成DNA Pol /primase的延伸能力较低，很快被高延的延伸能力较低，很快被高延伸性的伸性
49、的DNA Pol 或者或者DNA Pol 取代取代DNA Pol 或者或者DNA Pol 取代取代DNA Pol /primase的过程称为聚合酶的切换（的过程称为聚合酶的切换（ Polymerase switching，the process of replacing DNA Pol /primase with DNA Pol or DNA Pol ）导致在真核细胞复制叉上有导致在真核细胞复制叉上有3种不同的种不同的DNA聚合聚合酶在工作酶在工作其它其它DNA聚合酶大多参与聚合酶大多参与DNA的修复的修复真核细胞真核细胞DNA复制过程中聚合酶的切换复制过程中聚合酶的切换DNAPol：后随链模
50、板：后随链模板DNAPol ：前导链模板前导链模板引物酶进行引物酶进行RNA引物的引物的合成合成聚合酶聚合酶 进行进行DNA的合成的合成4.24.2SlidingclampsSlidingclamps（滑动夹）（滑动夹）（滑动夹）（滑动夹）dramaticallydramaticallyincreaseDNApolymeraseactivityincreaseDNApolymeraseactivity（滑动夹极大地增加了（滑动夹极大地增加了（滑动夹极大地增加了（滑动夹极大地增加了DNADNA聚合酶的延伸能力）聚合酶的延伸能力）聚合酶的延伸能力）聚合酶的延伸能力）n复制叉上高度的延伸能力确保了染
51、色体的复制叉上高度的延伸能力确保了染色体的快速复制快速复制nDNA聚合酶可以在不脱离模板的情况下合聚合酶可以在不脱离模板的情况下合成成千上万的碱基对成成千上万的碱基对n但是在没有其它蛋白质存在的情况下，但是在没有其它蛋白质存在的情况下，DNA聚合酶在复制叉上仅能合成聚合酶在复制叉上仅能合成20-100个碱基对后即从模板上脱离下来个碱基对后即从模板上脱离下来n问题：什么原因使这些酶在复制叉上的延问题：什么原因使这些酶在复制叉上的延伸能力如此显著的提高？伸能力如此显著的提高？n具有高延伸能力的关键原因：具有高延伸能力的关键原因：DNA聚合酶聚合酶与被称为与被称为滑动滑动DNA夹（夹（Sliding
52、DNAclamps）的蛋白质结合的蛋白质结合n这些蛋白质由多个相同亚基组成，并组装这些蛋白质由多个相同亚基组成，并组装成成”油炸圈饼油炸圈饼“的形状的形状与与DNA结合的滑动结合的滑动DNA夹的三维结构夹的三维结构DNA聚合酶与滑动聚合酶与滑动DNA夹的相互作用夹的相互作用DNA聚合酶与滑动夹所形成的复合体在聚合酶与滑动夹所形成的复合体在DNA合成时合成时沿着沿着DNA模板高效移动模板高效移动滑动夹滑动夹n问题：与滑动夹的结合是如何改变问题：与滑动夹的结合是如何改变DNA聚合聚合酶的延伸能力的？酶的延伸能力的？n无滑动夹：无滑动夹：DNA聚合酶平均每合成聚合酶平均每合成20-100个碱个碱基对
53、就从模板上解离并散落开来基对就从模板上解离并散落开来n有滑动夹：有滑动夹：DNA聚合酶的活性部位仍经常从聚合酶的活性部位仍经常从DNA的的3-OH末端脱落，但是其与滑动夹的结合阻止了聚末端脱落，但是其与滑动夹的结合阻止了聚合酶从合酶从DNA上散开上散开通过保持通过保持DNA聚合酶与聚合酶与DNA的紧密接触，滑的紧密接触，滑动夹使动夹使DNA聚合酶能够迅速地重新结合到同一聚合酶能够迅速地重新结合到同一引物引物-模板接头上，从而大大增加了模板接头上，从而大大增加了DNA聚合聚合酶的延伸能力酶的延伸能力滑动夹增强了相结合的滑动夹增强了相结合的DNA聚合酶的延伸能力聚合酶的延伸能力DNA聚合酶从引物聚
54、合酶从引物-模板接头上释放下来模板接头上释放下来DNA聚合酶重新与同一引物聚合酶重新与同一引物-模板接头模板接头结合并继续结合并继续DNA的合成的合成无引物无引物-模板时模板时DNA聚合酶的释放聚合酶的释放n当单链当单链DNA模板完全复制后，模板完全复制后，DNA聚合酶必须聚合酶必须从此从此DNA和滑动夹上释放下来，从而在新的引和滑动夹上释放下来，从而在新的引物物-模板接头处工作模板接头处工作nDNA聚合酶的释放：通过依赖于环结合聚合酶的释放：通过依赖于环结合DNA的的DNA聚合酶与滑动夹之间亲和力的变化来实现聚合酶与滑动夹之间亲和力的变化来实现n与引物与引物-模板接头结合的模板接头结合的DN
55、A聚合酶和滑动夹之聚合酶和滑动夹之间有很高的亲和力。但是当聚合酶到达单链间有很高的亲和力。但是当聚合酶到达单链DNA模板的末端时，聚合酶构象发生改变，降模板的末端时，聚合酶构象发生改变，降低了其与滑动夹以及低了其与滑动夹以及DNA之间的亲和力之间的亲和力n导致导致DNA聚合酶的释放，使其可以在新的引物聚合酶的释放，使其可以在新的引物-模板接头上继续工作模板接头上继续工作n但是滑动夹仍然与但是滑动夹仍然与DNA保持结合保持结合n释放释放DNA聚合酶后，滑动夹并不立即从复制的聚合酶后，滑动夹并不立即从复制的DNA上脱落下来。相反其它必须在上脱落下来。相反其它必须在DNA新合成新合成处作用的蛋白质通
56、过与滑动夹蛋白的相互作用而处作用的蛋白质通过与滑动夹蛋白的相互作用而执行功能执行功能n例如：真核细胞中组装染色质的酶与例如：真核细胞中组装染色质的酶与真核生物滑真核生物滑动夹（称为动夹（称为PCNA）之间的相互作用被募集到之间的相互作用被募集到DNA的复制部位的复制部位（EukaryoticslidingDNAclampisPCNA）n一些蛋白质通过与滑动夹之间的相互作用在它们一些蛋白质通过与滑动夹之间的相互作用在它们最被需要的时候聚集到新的最被需要的时候聚集到新的DNA合成部位合成部位SlidingDNAclampsarefoundacrossallorganismandshareasimi
57、larstructure大肠杆菌滑动夹大肠杆菌滑动夹T4噬菌体滑动夹噬菌体滑动夹真核生物滑动夹真核生物滑动夹（PCNA蛋白的三聚体）蛋白的三聚体）滑动夹蛋白是不同生物滑动夹蛋白是不同生物DNA复制体系中的保守部件，不同生复制体系中的保守部件，不同生物滑动夹结构是保守的物滑动夹结构是保守的4.3SlidingclampsareopenedandplacedonDNAbyclamploaders（滑动夹通过滑动夹加载器打开并安置在（滑动夹通过滑动夹加载器打开并安置在DNA上）上）滑动夹在溶液中是一个闭合的环，必须打开滑动夹在溶液中是一个闭合的环，必须打开才能套在才能套在DNA双螺旋上双螺旋上nCl
58、amploader(滑动夹加载器滑动夹加载器)isaspecialclassofproteincomplexcatalyzestheopeningandplacementofslidingclampsontheDNA,suchaprocessoccursanytimeaprimer:templatejunctionispresent滑动夹装载器滑动夹装载器是一种特殊的蛋白复合体，能够催是一种特殊的蛋白复合体，能够催化滑动夹的打开并将其安放在化滑动夹的打开并将其安放在DNA上。这种酶上。这种酶通过结合通过结合ATP并将其水解而将滑动夹置于并将其水解而将滑动夹置于DNA的引物的引物-模板接头上模板
59、接头上n滑动夹加载器还能将滑动夹在不使用的时候将其滑动夹加载器还能将滑动夹在不使用的时候将其从从DNA上移除上移除SlidingclampsareonlyremovedfromtheDNAoncealltheassociatedenzymescompletetheirfunction.只改变滑动夹的构象，但不改变其化学组成只改变滑动夹的构象，但不改变其化学组成n问题：是什么控制滑动夹何时从问题：是什么控制滑动夹何时从DNA上装载上装载或者移除呢？或者移除呢？n只要细胞中出现引物只要细胞中出现引物-模板接头，滑动夹的装模板接头，滑动夹的装载就可以发生，不限于载就可以发生，不限于DNA复制时形成，
60、在复制时形成，在几个几个DNA修复事件中也可以发生修复事件中也可以发生n滑动夹只有当其不再被其它酶使用时才能从滑动夹只有当其不再被其它酶使用时才能从DNA上移除，即：滑动夹只能在与其相作用上移除，即：滑动夹只能在与其相作用的所有酶都完成工作后才能从的所有酶都完成工作后才能从DNA上移除上移除TheabovepartdescribeshowthesynthesisofDNAoccursinthecontextofanintactchromosomeatreplicationforks.AnarrayofproteinsarerequiredtoprepareDNAreplicationatthe
61、sesites.5. DNA synthesis at the replication fork（复制叉上的（复制叉上的DNA合成）合成）The leading strand and lagging strand are synthesized simultaneously（在复制叉上前导链和后随链同时进行合成）（在复制叉上前导链和后随链同时进行合成）To coordinate the replication of both strands, multiple DNA Pols function at the replication fork （为了协调两条链的复制，在复制叉上有多（为了协调两
62、条链的复制，在复制叉上有多种种DNA聚合酶行使功能）聚合酶行使功能）大肠杆菌中这些聚合酶的协同作用是通过它大肠杆菌中这些聚合酶的协同作用是通过它们连接成一个巨大的多蛋白复合体而实现的：们连接成一个巨大的多蛋白复合体而实现的：DNA Pol III holoenzyme（DNA聚合酶聚合酶III 全酶）全酶）全酶是对一个具有核心酶并结合有增强其功全酶是对一个具有核心酶并结合有增强其功能的其它元件的多蛋白复合体的总称能的其它元件的多蛋白复合体的总称nDNA聚合酶聚合酶III全酶：全酶：n2个拷贝的个拷贝的DNA聚合酶聚合酶III核心酶核心酶n1个拷贝的五蛋白个拷贝的五蛋白-复合体：与复合体：与DN
63、A聚合酶聚合酶III核心酶的核心酶的2个拷贝都结合，对于全酶的形个拷贝都结合，对于全酶的形成是至关重要的成是至关重要的ThecompositionoftheDNAPolIIIholoenzyme具有核心酶的多蛋白复合体具有核心酶的多蛋白复合体DNA聚合酶聚合酶III核心酶核心酶DNA聚合酶聚合酶III核心酶核心酶五蛋白五蛋白- -复合体复合体（滑动夹装载器）（滑动夹装载器）（能够与（能够与DNA聚合酶聚合酶III核心酶的两个拷贝核心酶的两个拷贝结合）结合）滑动夹滑动夹柔性接头柔性接头滑动夹装载器滑动夹装载器n问题：问题：n当当DNA同时在前导和后随模板链上合成同时在前导和后随模板链上合成的时候
64、，两个的时候，两个DNA聚合酶聚合酶III核心酶如何核心酶如何在复制叉处保持连接？在复制叉处保持连接？nTrombonemodel（长号模型）（长号模型）：n大肠杆菌复制叉上用于协调两种大肠杆菌复制叉上用于协调两种DNA聚聚合酶（前导链合酶（前导链DNA聚合酶和后随链聚合酶和后随链DNA聚合酶）复制的模型聚合酶）复制的模型DNA解旋酶解旋酶E.coliDNA复制叉上的复制叉上的DNA解旋酶在后随链模板上沿着解旋酶在后随链模板上沿着5-3方向运动，方向运动，DNA聚合酶聚合酶III全酶通过全酶通过 亚基与亚基与DNA解旋酶相互作用，解旋酶相互作用， 亚基与两个亚基与两个DNA聚合酶核心酶都结合。
65、一个聚合酶核心酶都结合。一个DNA聚合酶聚合酶III核心核心酶复制前导链，另一个酶复制前导链，另一个DNA聚合酶聚合酶III核心酶复制后随链。核心酶复制后随链。前导链前导链DNA聚合酶聚合酶后随链后随链DNA聚合酶聚合酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA引物酶周期性地与引物酶周期性地与DNA解旋酶结合并在后随链解旋酶结合并在后随链模板上合成新的模板上合成新的RNA引物引物DNA引物酶引物酶当后随链当后随链DNA聚合酶完成一个冈崎片段合成之后聚合酶完成一个冈崎片段合成之后即从滑动夹和即从滑动夹和DNA上脱落上脱落脱落脱落随后，刚刚被引物结合的后随链随后，刚刚被引物结合的后随链DNA成为夹子装载器的靶
66、子。成为夹子装载器的靶子。夹子装载器在由新合成的夹子装载器在由新合成的RNA引物生成的引物引物生成的引物-模板接头位置模板接头位置上组装成新的滑动夹。上组装成新的滑动夹。滑动夹装载到新引物滑动夹装载到新引物结合的后随链上结合的后随链上结合有滑动夹的引物结合有滑动夹的引物-模板接头与后随链模板接头与后随链DNA聚合酶结合，开始聚合酶结合，开始下一个冈崎片段的合成下一个冈崎片段的合成DNA聚合酶合成新的冈崎片段聚合酶合成新的冈崎片段n虽然这个过程重点描述较复杂的后随链的虽然这个过程重点描述较复杂的后随链的合成，但是在整个过程中，前导链上的新合成，但是在整个过程中，前导链上的新单链单链DNA模板也已
67、经产生，并由前导链上模板也已经产生，并由前导链上的的DNA聚合酶聚合酶III进行快速的复制进行快速的复制n真核生物真核生物DNA复制也需要多种复制也需要多种DNA聚合聚合酶，每个复制叉上有酶，每个复制叉上有3种不同的种不同的DNA聚合聚合酶：酶：DNA Pol /primase，DNA Pol，DNA Pol nDNA Pol /primase启动新链合成，而由启动新链合成，而由DNA Pol和和 DNA Pol 进行链的延伸进行链的延伸InteractionsbetweenreplicationforkproteinsformtheE. colireplisome（复制叉蛋白之间的相互作用形
68、成大肠杆菌（复制叉蛋白之间的相互作用形成大肠杆菌的的复制体复制体）n除了除了DNA聚合酶聚合酶III全酶各个元件之间的全酶各个元件之间的相互作用之外，还有几个蛋白质相互作用之外，还有几个蛋白质-蛋白质间蛋白质间的相互作用用于加快复制叉的复制进程的相互作用用于加快复制叉的复制进程1.DNAhelicase&DNAPolIIIholoenzyme（最重要的是（最重要的是DNA解解旋酶与旋酶与DNA聚合酶聚合酶III全酶之间的相全酶之间的相互作用）：互作用）：thisinteractionismediatedbytheclamploaderandstimulatestheactivityoftheh
69、elicase(10-fold)此结合使解旋酶运动的速度增加此结合使解旋酶运动的速度增加10倍，从而倍，从而激发了解旋酶的活性。如果解旋酶与激发了解旋酶的活性。如果解旋酶与DNA聚聚合酶分离，其速度将减慢下来。合酶分离，其速度将减慢下来。DNA解旋酶与解旋酶与DNA聚合酶聚合酶III全酶之间的结合加快了全酶之间的结合加快了DNA链链分离的速度分离的速度DNA解旋酶与解旋酶与DNA聚合酶结合聚合酶结合增强增强DNA解旋酶解旋酶的活性的活性降低降低DNA解旋酶解旋酶的活性的活性n解旋酶活性与解旋酶活性与DNA聚合酶全酶的偶联，防聚合酶全酶的偶联，防止了解旋酶从止了解旋酶从DNA聚合酶全酶上聚合酶全
70、酶上“逃脱出逃脱出去去”，因此使得这两个关键的复制叉酶得，因此使得这两个关键的复制叉酶得以协调以协调2.第二个重要的蛋白质相互作用：第二个重要的蛋白质相互作用：DNA解旋酶解旋酶与引物酶之间的相互作用与引物酶之间的相互作用DNAhelicase&primaseisrelativelyweekandstronglystimulatestheprimasefunction(1000-fold).DNA解旋酶与引物酶之间的相互作用相对较弱，但是解旋酶与引物酶之间的相互作用相对较弱，但是此相互作用大大激发了引物酶的功能（提高活性约此相互作用大大激发了引物酶的功能（提高活性约1000倍）。倍）。RNA引
71、物合成后，引物酶从引物合成后，引物酶从DNA解旋酶解旋酶上脱落。上脱落。ThisweakinteractionisimportantforregulationthelengthofOkazakifragments.这种较弱的相互作用对于冈崎片段长度的调节很重要。这种较弱的相互作用对于冈崎片段长度的调节很重要。更紧密的结合会导致后随链上的引物合成更频繁，这更紧密的结合会导致后随链上的引物合成更频繁，这样冈崎片段就会较短。相反，较弱的相互作用会产生较样冈崎片段就会较短。相反，较弱的相互作用会产生较长的冈崎片段。长的冈崎片段。Replisomeisestablishedbyprotein-prote
72、ininteractions复制叉上作用的全部蛋白质的总和称为复制叉上作用的全部蛋白质的总和称为复制体（复制体（Replisome） DNA Pol III holoenzyme, helicase and primase interact with each other to form replisome, a finely tuned factory for DNA synthesis with the activity of each protein is highly coordinated.（用于（用于DNA合成的调度有序合成的调度有序的工厂）的工厂）n这个工厂含有多个相互作用的机器
73、，这些这个工厂含有多个相互作用的机器，这些机器都可单独行使重要的特殊功能。当它机器都可单独行使重要的特殊功能。当它们正在一起时，其活动通过相互之间的作们正在一起时，其活动通过相互之间的作用进行协调。用进行协调。6. Initiation of DNA replication(DNA复制的起始）复制的起始）6.1 Specific genomic DNA sequences direct the initiation of DNA replication（特定的基因组（特定的基因组DNA序列指导序列指导DNA复制的起复制的起始）始）Origins of replication（复制起始（复制起始
74、位点）：位点）： the sites at which DNA unwinding and initiation of replication occur（DNA解旋解旋和复制起始发生的特殊位点）和复制起始发生的特殊位点）依不同的生物而不同，每个染色体上可有少至依不同的生物而不同，每个染色体上可有少至一个多至数千个的复制起始位点一个多至数千个的复制起始位点6.2 The replicon model of replication initiation-a general view（复制起始的（复制起始的复制子模型复制子模型)Proposed by Jacob and Brenner in 19
75、63All the DNA replicated from a particular origin is a replicon (复复制子）制子）：所有的：所有的DNA都从称为复制子都从称为复制子的特定起始位点开始复制的特定起始位点开始复制大肠杆菌：一个染色体只有一个复制起始位大肠杆菌：一个染色体只有一个复制起始位点，所以整个染色体是一个复制子点，所以整个染色体是一个复制子真核染色体：多个复制起始位点，多个复制真核染色体：多个复制起始位点，多个复制子子Twocomponents,replicator（复制器）（复制器）andinitiator（起始子）（起始子）controltheinitia
76、tionofreplication复制子模型提出了控制复制起始的两个元件：复制子模型提出了控制复制起始的两个元件：复制器和起始子复制器和起始子nReplicator（复制器）（复制器）:theentiresiteofcis-actingDNAsequencessufficienttodirecttheinitiationofDNAreplication（足够指导（足够指导DNA复制起始的整套顺式作用复制起始的整套顺式作用DNA序序列）列）复制起始位点复制起始位点是是DNA上发生上发生DNA解旋以及解旋以及DNA合成起始部位的位点合成起始部位的位点尽管复制起始位点始终是复制器的一部分。但是尽管复
77、制起始位点始终是复制器的一部分。但是在真核细胞中复制起始位点仅仅是用于指导复制在真核细胞中复制起始位点仅仅是用于指导复制起始的起始的DNA序列的一部分。序列的一部分。Initiatorprotein（起始子蛋白）（起始子蛋白）:specificallyrecognizesaDNAelementinthereplicatorandactivatestheinitiationofreplication（特异性地识别复制器中的一个（特异性地识别复制器中的一个DNA元件并且激元件并且激活复制的起始）活复制的起始）起始子蛋白是复制起始中涉及的唯一的序列特异起始子蛋白是复制起始中涉及的唯一的序列特异性性D
78、NA结合蛋白。结合蛋白。而复制起始所需的其它蛋白质均不与而复制起始所需的其它蛋白质均不与DNA特异性特异性结合，相反这些蛋白质通过蛋白质相互作用和对结合，相反这些蛋白质通过蛋白质相互作用和对特殊特殊DNA结构（如单链结构（如单链DNA或引物或引物-模板接头）模板接头）的亲和性而集合到复制器上。的亲和性而集合到复制器上。Replicator:theentiresiteofcis-actingDNAsequencessufficienttodirecttheinitiationofDNAreplication（足够指导（足够指导DNA复制起始的复制起始的整套顺式作用整套顺式作用DNA序列）序列）I
79、nitiatorprotein:specificallyrecognizesaDNAelementinthereplicatorandactivatestheinitiationofreplication复制子模型复制子模型6.3 Replicator sequences include initiator binding sites and easily unwound DNA（复制器序列包括起始子结合位点和容易解（复制器序列包括起始子结合位点和容易解旋的旋的DNA）n复制器的复制器的DNA序列有序列有2个共同的特性：个共同的特性：1.含有起始子蛋白结合位点，此位点是组装复制含有起始子蛋白结
80、合位点，此位点是组装复制起始机器的核心起始机器的核心2.含有一段富含含有一段富含AT的的DNA，容易解旋但并不自，容易解旋但并不自发发生。在复制器上，发发生。在复制器上，DNA的解旋是由复制起的解旋是由复制起始蛋白控制的，这些蛋白的行为被严格调控。始蛋白控制的，这些蛋白的行为被严格调控。复制器的结构：复制器的结构：3个研究很透彻的复制器的个研究很透彻的复制器的DNA元件元件虽然很多真核生物病毒和单细胞真核生物酿酒酵母的虽然很多真核生物病毒和单细胞真核生物酿酒酵母的复制器的特殊序列不同，但是其整体结构很相似复制器的特殊序列不同，但是其整体结构很相似大肠杆菌单个复制器：大肠杆菌单个复制器：oriC
81、-两个重复的基序对两个重复的基序对oriC功能至关重要功能至关重要起始子蛋白DnaA结合位点（9核苷酸单位的基序，重复5次）起始时单链DNA形成的位点（13核苷酸单位的基序）起始DNA解旋部位SV40病毒病毒酿酒酵母酿酒酵母-单细胞真核生物单细胞真核生物n多细胞真核生物复制器的鉴别很困难多细胞真核生物复制器的鉴别很困难n少数几例复制器得到鉴别的例子表明：多少数几例复制器得到鉴别的例子表明：多细胞真核生物复制器比酵母和细菌中的复细胞真核生物复制器比酵母和细菌中的复制器要大得多，长度通常超过制器要大得多，长度通常超过1000bp7. Binding and Unwinding: origin se
82、lection and activation by the initiator protein(结合和解旋：结合和解旋：起始子蛋白起始子蛋白对复制起对复制起点的选择和激活）点的选择和激活）n起始子蛋白在复制起始中一般执起始子蛋白在复制起始中一般执行行3种不同的功能：种不同的功能：(1)bindstoreplicator（起始子蛋白（起始子蛋白与复制器中特异性与复制器中特异性DNA序列结合）序列结合）(2)distorts/unwindsaregionofDNA（一旦与（一旦与DNA结合，就扭曲或解旋结合，就扭曲或解旋其结合位点附近的其结合位点附近的DNA区域）区域）(3)interactswi
83、thandrecruitsadditionalreplicationfactors（起（起始子蛋白与复制起始所需的其它因子相互始子蛋白与复制起始所需的其它因子相互作用，并使它们聚集到复制器上）作用，并使它们聚集到复制器上）复制起始期间起始子复制起始期间起始子蛋白的功能蛋白的功能DNA结合结合DNA解旋解旋复制蛋白质的募集复制蛋白质的募集（每种起始子蛋白募集到（每种起始子蛋白募集到的蛋白质都不一样）的蛋白质都不一样）DNA结合结合DNA链分离链分离n原核生物大肠杆菌起始子蛋白原核生物大肠杆菌起始子蛋白DnaAnDnaA与与oriC中重复的中重复的9个核苷酸单位元件结个核苷酸单位元件结合，并受合，
84、并受ATP调控调控n当与当与ATP结合时，结合时，DnaA还与还与oriC中重复的中重复的13核苷酸单位元件所在区域的核苷酸单位元件所在区域的DNA结合，使结合，使13核苷酸单位元件区域内的核苷酸单位元件区域内的20bp的的DNA链链解旋分离解旋分离n此解旋的此解旋的DNA给其它复制蛋白提供了单链给其它复制蛋白提供了单链DNA模板，用于启动复制中模板，用于启动复制中RNA引物和引物和DNA合成步骤合成步骤nDnaA还会在复制器所形成的单链还会在复制器所形成的单链DNA上招上招募聚集其它的包括募聚集其它的包括DNA解旋酶在内的复制蛋解旋酶在内的复制蛋白白DnaAinE. coli (all 3
85、functions)n真核生物起始子蛋白真核生物起始子蛋白-起始位点识别复合起始位点识别复合体（体（originrecognitioncomplex，ORC)六蛋白复合体六蛋白复合体n具有起始子蛋白三项常见功能中的两项：具有起始子蛋白三项常见功能中的两项：n与复制子结合与复制子结合n将其它复制蛋白招募到复制器上将其它复制蛋白招募到复制器上没有使结合位点附近的没有使结合位点附近的DNA解旋的功能解旋的功能originrecognitioncomplex(ORC)ineukaryotes(functions 1 & 3)Three different functions of initiator
86、protein: (1) binds to replicator, (2) distorts/unwinds a region of DNA, (3) interacts with and recruits additional replication factorsDnaA in E. coli (all 3 functions), origin recognition complex (ORC) in eukaryotes (functions 1 & 3)7.2 Protein-protein and protein-DNA interactions direct the initiat
87、ion process（蛋白质（蛋白质-蛋白质和蛋白质蛋白质和蛋白质-DNA相互作用相互作用指导复制起始过程）指导复制起始过程）n起始子与复制器结合后，复制起始中剩下起始子与复制器结合后，复制起始中剩下的步骤主要由蛋白质相互作用和序列非依的步骤主要由蛋白质相互作用和序列非依赖性的蛋白质赖性的蛋白质-DNA相互作用来驱动相互作用来驱动n最终结果：组装出复制叉机器最终结果：组装出复制叉机器Initiating replication in bacteria（大肠杆菌的复（大肠杆菌的复制起始）制起始）DnaA recruits the DNA helicase- DnaB and the helic
88、ase loader DnaCDnaB（解旋酶）（解旋酶）interacts with primase（引物酶）（引物酶） to initiate RNA primer synthesis.7.3 Initiating replication in eukaryotes（真核生物复制起始）（真核生物复制起始）Eukaryotic chromosome are replicated exactly once per cell cycle, which is critical for these organisms（真核细胞染色体每一个细胞周期精确地复（真核细胞染色体每一个细胞周期精确地复制一次制
89、一次-至关重要）至关重要）Cell cycle: a single round of cell division，细胞完成一轮分裂所需要的，细胞完成一轮分裂所需要的过程称为细胞周期过程称为细胞周期Mitotic cell division: the chrom. Number is maintained during cell division，大多数真核细胞的分裂会使，大多数真核细胞的分裂会使子代细胞维持和父本细胞一致的染色体子代细胞维持和父本细胞一致的染色体数目，称为有丝分裂数目，称为有丝分裂Theeukaryoticmitoticcellcycle染色体准备分离染色体准备分离染色体分离染
90、色体分离（有丝分裂）（有丝分裂）细胞分裂准备细胞分裂准备DNA复制复制n染色体染色体DNA复制仅发生在细胞周期的复制仅发生在细胞周期的S期期n在此期间，细胞中所有在此期间，细胞中所有DNA都必须精确地都必须精确地复制一次复制一次nDNA的重复复制也会造成严重后果，使基的重复复制也会造成严重后果，使基因组中特殊区域的拷贝数增加。重要调控因组中特殊区域的拷贝数增加。重要调控基因的拷贝数即使增加一个或两个也会导基因的拷贝数即使增加一个或两个也会导致基因表达的灾难性的缺陷致基因表达的灾难性的缺陷n因此，真核细胞每分裂一次，每条染色体因此，真核细胞每分裂一次，每条染色体中的每个碱基对复制且只能复制一次中
91、的每个碱基对复制且只能复制一次-极其重要！极其重要！n真核细胞每条染色体上都有很多个复制起始位点，真核细胞每条染色体上都有很多个复制起始位点，所以所以DNA复制且只能复制一次的要求很有挑战性！复制且只能复制一次的要求很有挑战性！n第一：必须激活足够多的起始位点，以保证第一：必须激活足够多的起始位点，以保证S期中每期中每条染色体都被完全复制（如果复制起始位点激活太条染色体都被完全复制（如果复制起始位点激活太少，基因组中将有部分区域没有被复制）少，基因组中将有部分区域没有被复制）n第二：有些可能的起始位点并没有被用到，但是没第二：有些可能的起始位点并没有被用到，但是没有一个有一个复制后的复制起始位
92、点复制后的复制起始位点可以被启动。因此，可以被启动。因此，一个起始位点不管是被激活而使其自身复制，还是一个起始位点不管是被激活而使其自身复制，还是被邻近起始位点产生的复制叉所复制，它都必须失被邻近起始位点产生的复制叉所复制，它都必须失活，直至下一轮细胞分裂开始为止。活，直至下一轮细胞分裂开始为止。-如果上述要如果上述要求没有达到，那么一个细胞周期内带有起始位点的求没有达到，那么一个细胞周期内带有起始位点的DNA将被复制两次将被复制两次DNA复制使复制器失活复制使复制器失活5个复制器个复制器复制器复制器3,5首先被激活首先被激活起始位点起始位点1起始起始起始位点起始位点2被动复制被动复制起始位点
93、起始位点4被动复制被动复制(虽然这些复制器虽然这些复制器并未被启动，但是并未被启动，但是它们仍因其它们仍因其DNA的复制作用而被失活）的复制作用而被失活）失活失活n如果一个复制器在尚未被启动时被邻近起始如果一个复制器在尚未被启动时被邻近起始位点过来的复制叉复制，则称其为被动复制位点过来的复制叉复制，则称其为被动复制7.4Pre-replicativecomplex(pre-RC)formationandactivationdirectstheinitiationofreplicationineukaryotes（前复制复合体前复制复合体的形成和激活指导了真核细的形成和激活指导了真核细胞中的复制
94、起始）胞中的复制起始）n真核细胞中复制起始需要的两个步骤发生在细胞周期的真核细胞中复制起始需要的两个步骤发生在细胞周期的不同时期内：不同时期内：复制器的选择和起始位点的激活复制器的选择和起始位点的激活n复制器选择复制器选择是对指导复制起始的序列进行识别的过程是对指导复制起始的序列进行识别的过程发生在发生在G1期（早于期（早于S期），期），此过程导致在基因组中每个此过程导致在基因组中每个复制器上都组装一个多蛋白复合体复制器上都组装一个多蛋白复合体n起始位点的激活起始位点的激活只在细胞进入只在细胞进入S期期后发生，使复制器结合后发生，使复制器结合的蛋白复合体启动的蛋白复合体启动DNA的解旋和的解旋
95、和DNA聚合酶的募集聚合酶的募集n真核生物中复制器选择和起始位点激活两个真核生物中复制器选择和起始位点激活两个步骤的分离与原核细胞中的情况不同步骤的分离与原核细胞中的情况不同n原核细胞中复制器原核细胞中复制器DNA的识别与的识别与DNA的解的解旋以及聚合酶的募集相偶联旋以及聚合酶的募集相偶联n而真核细胞中这两个事件的短暂分离保证了而真核细胞中这两个事件的短暂分离保证了在每个细胞周期中每条染色体仅仅只复制一在每个细胞周期中每条染色体仅仅只复制一次次Initiationineukaryotesrequirestwodistinctsteps:1ststep-Replicatorselection:
96、theprocessofidentifyingsequencesforreplicationinitiation(G1phase),whichismediatedbytheformationofpre-RCsatthereplicatorregion.复制器选择是由复制器选择是由前复制复合体（前复制复合体（Pre-replicativecomplex，pre-RC)的形成介导的（发生在的形成介导的（发生在G1期期)前复制复合体是由前复制复合体是由4个独立的蛋白质个独立的蛋白质在复制器中以在复制器中以有序的方式组装而成有序的方式组装而成前复制复合体的前复制复合体的形成步骤形成步骤复制器被真核生物
97、起始子复制器被真核生物起始子ORC识别识别ORC募集两个解旋酶装载募集两个解旋酶装载蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1ORC和装载蛋白共同募集到和装载蛋白共同募集到一个可能是真核一个可能是真核DNA解旋酶的解旋酶的蛋白蛋白-Mcm2-7复合体复合体前复制复合体前复制复合体有序组装有序组装n前复制复合体的形成并不导致起始位点的前复制复合体的形成并不导致起始位点的DNA立刻被解旋或者立刻被解旋或者DNA聚合酶的募集聚合酶的募集n而是只有当细胞从细胞周期的而是只有当细胞从细胞周期的G1到达到达S期期后，后，G1期形成的期形成的前复制复合体（前复制复合体（pre-RC）才被激活，从而启动复制起始才被激活，从
98、而启动复制起始2ndstep-Originactivation（起始起始位点的激活）位点的激活）:pre-RCsareactivatedbytwoproteinkinases(CdkandDdk)thatareactiveonlywhenthecellsenterSphase.n前复制复合体（前复制复合体（pre-RC）被两种蛋白激酶（）被两种蛋白激酶（CdkandDdk)所激活，使复制得以启动。激所激活，使复制得以启动。激酶在酶在G1期失活，只有在细胞进入期失活，只有在细胞进入S期以后才能被期以后才能被激活。激活。n激酶被激活后，这些激酶以激酶被激活后，这些激酶以pre-RC为靶蛋白使为靶蛋
99、白使其磷酸化，进而导致在起始位点上其它复制蛋白其磷酸化，进而导致在起始位点上其它复制蛋白的组装以及复制的起始。的组装以及复制的起始。n这些新的蛋白质包括：这些新的蛋白质包括：3种种DNA聚合酶及其聚合酶及其募集的许多其它蛋白质募集的许多其它蛋白质n3种种DNA聚合酶在起始位点的组装是以一定聚合酶在起始位点的组装是以一定顺序进行的：顺序进行的：DNA Pol和和DNA Pol 先结合，先结合，然后是然后是DNA Pol /primasen此顺序保证了此顺序保证了3种种DNA聚合酶在起始位点的聚合酶在起始位点的出现都先于首个出现都先于首个RNA引物的合成（由引物的合成（由DNA Pol /prim
100、ase进行合成）进行合成）pre-RC的激活导致的激活导致真核复制叉的组装真核复制叉的组装DNAPol和和DNAPol DNAPol /primase滑动夹和夹子装载器滑动夹和夹子装载器7.5 Pre-RC formation and activation is tightly regulated to allow only a single round of replication during each cell cycle.（对（对pre-RC形成和激活的严谨调控使每形成和激活的严谨调控使每个细胞周期中仅有一轮复制发生）个细胞周期中仅有一轮复制发生）n真核细胞如何对数以百计甚至数以千计的
101、复真核细胞如何对数以百计甚至数以千计的复制起始位点进行活性控制，使得在一个细胞制起始位点进行活性控制，使得在一个细胞周期中没有一个位点被激活超过一次？周期中没有一个位点被激活超过一次？n细胞周期蛋白依赖性激酶（细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk)对对pre-RC形成和激活进行严谨调控形成和激活进行严谨调控nCdk对于对于pre-RC功能的调控有两个似乎功能的调控有两个似乎矛盾的作用：矛盾的作用：n高活性的高活性的Cdk是激活是激活pre-RC以启动以启动DNA复复制所必需的制所必需的nCdk的活性又会抑制新的活性又会抑制新pre-RC的形成的形成EffectofCdkactivityonpre-R
102、Cformationandactivation（Cdk对对pre-RC形成和活化的调控）形成和活化的调控）Cdk活性低活性低允许形成新的允许形成新的pre-RC无无pre-RC激活激活Cdk活性高活性高抑制形成新的抑制形成新的pre-RC激活已有的激活已有的pre-RC启动复制启动复制npre-RC的功能，的功能，Cdk水平以及细胞周期之水平以及细胞周期之间的密切联系保证了真核生物基因组在一个间的密切联系保证了真核生物基因组在一个细胞周期中只复制一次细胞周期中只复制一次n在在G1期没有有活性的期没有有活性的Cdk，但是细胞周期的，但是细胞周期的其它期（其它期（S,G2，M期）一直存在高水平的期
103、）一直存在高水平的Cdkn因此在每个细胞周期内，因此在每个细胞周期内，pre-RC仅仅只有仅仅只有一次形成的机会（一次形成的机会（G1期），而且这些期），而且这些pre-RC被激活的机会也仅有一次（被激活的机会也仅有一次（S期）期）Onlyoneopportunityforpre-RCstoform,andonlyoneopportunityforpre-RCactivationCellcycleregulationofCdkactivityandpre-RCformatin（Cdk活性和活性和pre-RC形形成的细胞周期调控）成的细胞周期调控）无新的无新的pre-RC的形成的形成Cdk活性低
104、活性低Cdk活性高活性高n在在G1期，期，Cdk活性低，新的活性低，新的pre-RC能够形成但是能够形成但是却不能被激活却不能被激活n在在S期，高水平的期，高水平的Cdk能够引发能够引发DNA复制的起始，复制的起始，并阻止任何在刚复制的并阻止任何在刚复制的DNA上的新的上的新的pre-RC的形的形成成nCdk在有丝分裂结束之前一直保持高水平，所以在在有丝分裂结束之前一直保持高水平，所以在染色体完成分离之前不再形成任何新的染色体完成分离之前不再形成任何新的pre-RC。没有新的没有新的pre-RC的形成，复制重新起始是不可能的形成，复制重新起始是不可能发生的发生的n只有当细胞将其染色体分离且完成
105、细胞分裂时，只有当细胞将其染色体分离且完成细胞分裂时，Cdk活性才消失，新的活性才消失，新的pre-RC才能够形成才能够形成7.6真核和原核生物真核和原核生物DNA复制起始的相似性复制起始的相似性n有共同的特点：有共同的特点：n第一步是起始子蛋白对复制器的识别第一步是起始子蛋白对复制器的识别n起始子蛋白和解旋酶装载蛋白共同将起始子蛋白和解旋酶装载蛋白共同将DNA解解旋酶募集到复制器上旋酶募集到复制器上n解旋酶产生单链解旋酶产生单链DNA区域，作为区域，作为RNA引物合引物合成的模板成的模板n当引物合成后，复制体的其它元件通过与形成当引物合成后，复制体的其它元件通过与形成的引物的引物-模板接头的
106、相互作用进行组装模板接头的相互作用进行组装8. Finishing replication（结束复制）（结束复制）nDNA复制的完成需要一系列特殊的事件，对复制的完成需要一系列特殊的事件，对于环形和线性染色体来说，这些事件是不同于环形和线性染色体来说，这些事件是不同的的n环形染色体：常规的复制叉机器能够复制整环形染色体：常规的复制叉机器能够复制整个分子，但是产生的子代分子之间是相互拓个分子，但是产生的子代分子之间是相互拓扑连接的扑连接的n线性染色体：最末端的复制不能由复制叉机线性染色体：最末端的复制不能由复制叉机器完成，必须发展一套新的策略克服末端复器完成，必须发展一套新的策略克服末端复制问题
107、制问题8.1 Finishing replication in bacteria:Type II topoisomerases separate daughter DNA moleculesTopoisomeraseIIcatalyzethedecatenationofreplicationproducts.拓扑异构酶拓扑异构酶II催化催化复制产物的解环复制产物的解环8.2 Finishing replication in eukaryotes:1.The end replication problem2.Telomere & telomerase: a link with cancer an
108、d agingWhatistheendreplicationproblem?Lagging strand synthesis is unable to copy the extreme ends of the linear chromosome（后随链的合成不能复制线性染色体的最末端）（后随链的合成不能复制线性染色体的最末端）Figure8-34n所有新的所有新的DNA合成启动都需要一条合成启动都需要一条RNA引物，这使得线性染色体末端的复制成为引物，这使得线性染色体末端的复制成为难题难题末端复制问题末端复制问题n在冈崎片段合成的最后一个在冈崎片段合成的最后一个RNA引物的末引物的末端与后随链
109、模板上最末端的碱基对配对的端与后随链模板上最末端的碱基对配对的情况下，当此情况下，当此RNA引物被去除后，在染色引物被去除后，在染色体末端仍将有一小段未复制的单链体末端仍将有一小段未复制的单链DNAn这意味着每一轮这意味着每一轮DNA复制后都将出现两条复制后都将出现两条子代子代DNA分子中的一条被截短的情况分子中的一条被截短的情况细胞解决末端复制问题的方法细胞解决末端复制问题的方法n用蛋白质代替用蛋白质代替RNA作为每个染色体末端最后一个作为每个染色体末端最后一个冈崎片段的引物：冈崎片段的引物：“引物蛋白引物蛋白”与后随链模板结合与后随链模板结合并用一个氨基酸来提供并用一个氨基酸来提供-OH，
110、以代替正常情况下，以代替正常情况下RNA引物提供的引物提供的3-OH-具有线性染色体的细菌的染色体末端复制具有线性染色体的细菌的染色体末端复制n多数真核细胞使用完全不同的方法来复制其染色体多数真核细胞使用完全不同的方法来复制其染色体末端：端粒，端粒酶末端：端粒，端粒酶n首尾相连的富含首尾相连的富含TG的重复序列构成，每条染色体的的重复序列构成，每条染色体的3端都位于其端都位于其5端之外成为单链端之外成为单链DNATelomeres（端粒）（端粒）n位于线性染色体的两端位于线性染色体的两端n端粒结合有很多蛋白，执行两个主要功能：端粒结合有很多蛋白，执行两个主要功能：n将细胞中染色体的天然末端和染
111、色体断裂和其将细胞中染色体的天然末端和染色体断裂和其它它DNA的断裂区分开的断裂区分开n端粒作为一种特殊的复制起始位点，可以使细端粒作为一种特殊的复制起始位点，可以使细胞复制染色体末端胞复制染色体末端-负责线性染色体末端的负责线性染色体末端的复制复制n端粒通过一种特殊的端粒通过一种特殊的DNA聚合酶聚合酶-端粒酶端粒酶（telomerase)来完成线性染色体末端的复来完成线性染色体末端的复制制n与染色体的大多数部分不同，端粒的相与染色体的大多数部分不同，端粒的相当一部分以单链的形式存在当一部分以单链的形式存在n大多数端粒有一个简单的重复序列，重大多数端粒有一个简单的重复序列，重复序列因生物而异
112、复序列因生物而异典型的端粒结构：框中显示了一个重复序列单元典型的端粒结构：框中显示了一个重复序列单元 染色体染色体3端的单链端的单链DNA区域可达数百个碱基区域可达数百个碱基TelomeraseisanovelDNApolymerasethatdoesnotrequireanexogenoustemplaten端粒酶端粒酶是一种新型的是一种新型的DNA聚合酶，它不需聚合酶，它不需要外源模板要外源模板n既含有蛋白质也含有既含有蛋白质也含有RNA成分，用于延伸成分，用于延伸其其DNA底物的底物的3端端n不需要外源性不需要外源性DNA模板来指导新模板来指导新dNTP的的添加，而是利用其添加，而是利用
113、其RNA成分作为模板，将成分作为模板，将端粒序列添加到染色体末端的端粒序列添加到染色体末端的3端端Howtelomeraseworks?Telomeraseextendstheprotruding3endofthechromosomeusingitsRNAcomponentsasatemplate.(Figure8-37)端粒酶进行的端粒复制端粒酶进行的端粒复制DNA合成合成易位易位DNA合成合成Howtheendproblemiseventuallyresolved?端粒酶通过延伸染色体的端粒酶通过延伸染色体的3端解决了末端复制问题端解决了末端复制问题Figure8-38The extend
114、ed 3 end allows the DNA polymerase to synthesize a new Okazaki fragment, which prevents the loss of genetic information at the chromosomal end.额外的额外的3端端DNA可以作为新冈崎可以作为新冈崎片段的模板片段的模板修复冈崎修复冈崎片段片段半不连续复制模型的提出和证明：冈崎半不连续复制模型的提出和证明：冈崎片段（片段（Okazakifragment）的发现）的发现连续复制连续复制半不连续复制半不连续复制不连续复制不连续复制3.2 The initiati
115、on of a new strand of DNA require an RNA primer（DNA新新链的起始需要一条链的起始需要一条RNA引物引物）所有所有DNA聚合酶均需要带有游离聚合酶均需要带有游离3-羟基的引物，不能从头启动羟基的引物，不能从头启动新新DNA链的合成链的合成n起始起始DNA合成的合成的RNA引物是如何被发现的？引物是如何被发现的？n支持支持RNA引发引发DNA合成的实验证据？合成的实验证据？n抗生素利福平能够抑制大肠杆菌细胞提取抗生素利福平能够抑制大肠杆菌细胞提取物对物对M13噬菌体噬菌体DNA的复制的复制n利福平特异性地抑制大肠杆菌利福平特异性地抑制大肠杆菌RNA
116、聚合酶聚合酶的活性，但是不抑制的活性，但是不抑制DNA聚合酶的活性聚合酶的活性M13利用大肠杆菌利用大肠杆菌RNA聚合酶合成用于聚合酶合成用于DNA复制的复制的RNA引物？引物？RNA引物引物关键实验证据：关键实验证据：nDNA酶不能完全降解冈崎片段，总会留下酶不能完全降解冈崎片段，总会留下一些一些10-12bp的的RNA小片段小片段TunekoOkazaki的研究工作的研究工作原始研究论文的工作原始研究论文的工作用加帽酶，鸟苷酰转移酶以及用加帽酶，鸟苷酰转移酶以及 -32PGTP标记标记RNA引物的引物的5端端如果引物在如果引物在5端被降解，那么就会失去放射性标记端被降解，那么就会失去放射性
117、标记先对引物进行放射性标记，再用先对引物进行放射性标记，再用DNA酶处理冈崎片段，去除酶处理冈崎片段，去除其其DNA部分，然后将剩余的产物进行凝胶电泳部分，然后将剩余的产物进行凝胶电泳DNA酶降解前酶降解前DNA酶降解后酶降解后Ma b c d e fghM泳道泳道d，h:大肠杆菌野生型菌株大肠杆菌野生型菌株泳道泳道a，e:缺陷型菌株缺陷型菌株(RNA酶酶H缺陷）缺陷）泳道泳道b,f:DNA聚合酶聚合酶I的核酸酶活性缺陷菌株的核酸酶活性缺陷菌株泳道泳道c,g:RNA酶酶H和DNA聚合酶聚合酶I核酸酶活性均缺陷菌株核酸酶活性均缺陷菌株n结论：大肠杆菌冈崎片段的合成由结论：大肠杆菌冈崎片段的合成由
118、10-12bp的的RNA引物引发引物引发n野生型菌株中由于存在降解野生型菌株中由于存在降解RNA的酶，所以的酶，所以很难检测到完整的很难检测到完整的RNA引物引物nAbstractnIntactprimerRNAfordiscontinuousDNAreplicationofEscherichia colihasbeendetectedbyspecificlabelingin vitroofits5-terminaltri-(ordi-)phosphategroupwithvacciniaguanylyltransferaseand-32PGTP.Amutantdefectiveeitheri
119、nRNaseHorinbothRNaseHandDNApolymeraseIaccumulatedabout10or30timesmoreintactprimerRNA,respectively,thanwild-typecells.TheprimersstartedwithpurineinanAtoGratioof5andthemostabundant5-terminaldinucleotidesequencewas(p)ppA-Pu.ThechainlengthoftheintactprimerRNAwasapproximately10to12nucleotideresidues.Thes
120、tructuralpropertiesoftheE. coliprimerRNAresemblethoseoftheeukaryoticprimerRNA.1. The Chemistry of DNA Synthesis(DNA合成的化学基础）合成的化学基础）2. The Mechanism of DNA Polymerase（DNA聚合酶的聚合酶的作用机制）作用机制）3. The Specialization of DNA Polymerases（DNA聚合聚合酶的特化）酶的特化）4. The Replication Fork（复制叉）（复制叉）5. DNA Synthesis at th
121、e Replication Fork（复制叉上的（复制叉上的DNA合成）合成）6. Initiation of DNA Replication（复制的起始）（复制的起始）7. Binding and Unwinding（结合和解旋）（结合和解旋）8. Finishing Replication（复制的终止）（复制的终止）SummaryThe Chemistry of DNA Synthesis: substrate, direction and energy. The Mechanism of DNA Polymerase: 1 polymerization mechanism, 2 diff
122、erent ways of discriminating substrates, 2 catalytic sites; 3 domains.The Specialization of DNA PolymerasesThe Replication Fork: the enzyme/proteins required to synthesize the leading and lagging strands.DNA Synthesis at the Replication Fork: Holoenzyme/trombone model to explain how the anti-paralle
123、l template strands are copied/replicated toward the replication fork. Replisome/protein interaction.SummaryInitiation of DNA Replication/binding and unwinding: the replicon model; initiation in bacteria; initiation control in eukaryotes-a link with cell cycle (pre-RC assembly and activation). FinishingReplication:Telomeres,telomerase
