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1、目标导航预习导引目标导航预习导引一二三四一、一、PCR原理原理1.概念:是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2.DNA复制需要的条件解旋酶、DNA母链、4种脱氧核苷酸、DNA聚合酶和引物。3.DNA的热变性:在80100的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性;当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链,这个过程称为复性。4.PCR反应的条件一定的缓冲溶液;DNA模板;分别与两条模板链相结合的两种引物;四种脱氧核苷酸;耐热的DNA聚合酶,一般用TaqDNA聚合酶;控制温度。目标导航预习导
2、引一二三四二、二、PCR反应过程反应过程1.变性:当温度上升到90以上时,双链DNA解聚为单链,一般实验温度为95。2.复性:温度下降到50左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,一般实验温度为55。3.延伸:温度上升到72左右,溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。PCR的变性过程实质上也是解旋,PCR的解旋和细胞内的DNA解旋有何不同?提示：PCR在高温条件下(90100)解旋,而细胞内的DNA在解旋酶的作用下解旋。目标导航预习导引一二三四三、实验操作三、实验操作1.PCR仪:能够自动调控温度的仪器,实现DNA的扩增。如果没有
3、PCR仪,可用3个恒温水浴锅代替,操作时在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。2.微量离心管:一种薄壁塑料管,总容积为0.5mL。3.微量移液器:用于添加转移PCR配方中的液体。目标导航预习导引一二三四四、操作提示四、操作提示1.为避免外源DNA等因素的污染,实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。2.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20储存。3.微量移液器的枪头在吸取试剂后必须更换。DNA很容易吸附在玻璃的表面,而不容易吸附在塑料的表面,由此推测PCR用到的微量离心管是用何种材质加工制作的?提示：是用塑料加工制作的。知识精要典题例解迁移应用一二知识架构一、一、PCR的
4、原理及反应过程的原理及反应过程1.PCR原理(1)概念多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)PCR原理DNA变性:在80100的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。DNA复性:当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链,这个过程称为复性。DNA合成:DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链,DNA合成方向总是从子链的5端向3端延伸。知识精要典题例解迁移应用一二知识架构(3)条件模板:两条DNA母链。引物:能分别与两条模板链结合的两种引物。原料:四种脱氧核苷酸
5、。酶:耐热的DNA聚合酶。其他条件:稳定的缓冲溶液和能自动调节温度的条件等。知识精要典题例解迁移应用一二知识架构2.PCR的反应过程(1)PCR过程变性当温度上升到90以上时,双链DNA解聚为单链。复性温度下降到50左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。知识精要典题例解迁移应用一二知识架构延伸温度上升到72左右,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(2)结果PCR一般要经历30多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。两引物间固定长度的DNA序列呈指数扩增(即2n)。一二知识精要典题例解迁移应用知识架构【例1
6、】在实验室内模拟生物体内的DNA复制,需要哪些条件?()酶游离的脱氧核苷酸ATPDNA分子引物tRNA适宜的温度适宜的酸碱度A. B.C.D.解析：在实验室内模拟DNA复制时,需要DNA聚合酶催化合成DNA子链;四种脱氧核苷酸为合成子链的原料;DNA母链为DNA复制的模板;还需要引物、适宜的温度、适宜的酸碱度等。答案：D一二知识精要典题例解迁移应用知识架构一二知识精要典题例解迁移应用知识架构一二知识精要典题例解迁移应用知识架构一二知识精要典题例解迁移应用知识架构下列有关PCR的描述,不正确的是()A.是一种酶促反应B.引物决定扩增的特异性C.扩增的对象是氨基酸序列D.扩增的对象是DNA序列解析
7、：PCR是特异扩增两个引物间的脱氧核苷酸序列,而不是氨基酸序列。答案：C一二知识精要典题例解迁移应用知识架构细胞内DNA复制与PCR扩增技术的比较 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构注:解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开,而DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键的。知识架构一二知识精要典题例解迁移应用二、二、PCR实验操作和结果分析评价实验操作和结果分析评价1.PCR体外扩增DNA片段的实验流程知识架构一二知识精要典题例解迁移应用知识架构一二知识精要典题例解迁移应用2.实验中DNA含量的测定DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进
8、行DNA含量的测定,具体方法如下:(1)稀释:2LPCR反应液,加入98L蒸馏水,即将样品进行50倍稀释(2)对照调零:以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零(3)测定:取DNA稀释液100L至比色杯中,测定260nm处的光吸收值知识架构一二知识精要典题例解迁移应用(4)计算:DNA含量(g/mL)=50(260nm的读数)稀释倍数一二知识精要典题例解迁移应用知识架构【例2】下列有关PCR操作过程的叙述,错误的是()A.PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B.PCR缓冲液和酶应分装成小份,在-20储存C.PCR所用缓冲
9、液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的吸液枪头都必须更换解析：为了防止外源DNA的污染,PCR反应中所用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等,在使用前要进行高压灭菌;还要将所用的缓冲液和酶分装成小份;并且使用一次性吸液枪头,A、B、D三项都正确。在使用前,将PCR所需试剂从冰箱内拿出来,放在冰块上缓慢融化,C项错误。答案：C一二知识精要典题例解迁移应用知识架构一二知识精要典题例解迁移应用知识架构一二知识精要典题例解迁移应用知识架构下图表示PCR扩增的产物,请分析它是哪次循环的产物?()A.第一次循环B.第二次循环C.第三次循环D.第四次循环
10、解析：在PCR反应中,以引物为标记,第一次循环时,以加入的DNA为模板,两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸,所以形成的每个子DNA中只有一种引物;从第二次循环开始,上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应,所以会形成DNA分子两端均含有引物的情况。因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。答案：A一二知识精要典题例解迁移应用知识架构几种PCR方法有反转录PCR、扩增未知序列的PCR、致突变PCR、定量PCR、免疫PCR等方法,PCR还可与其他方法联合使用,有很多新的联合法。(1)反转录PCR反转录PCR就是把RNA提取后反转录成互补DNA,并以此互补DNA链为模
11、板进行的PCR反应。通常用于检测某种RNA是否被表达,或者比较其相对表达水平。一二知识精要典题例解迁移应用知识架构(2)实时荧光定量PCR所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号的实时检测,从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR的进行,PCR产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。(3)免疫PCR免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。一
12、二知识架构误以为PCR过程中DNA聚合酶能对最初的DNA模板进行完整的复制。PCR过程中,第一次循环时,只能从引物结合的部位开始。由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合进行DNA的延伸,由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合进行DNA的延伸,之后,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。【例题】在进行DNA亲子鉴定时,需大量的DNA。PCR技术(多聚酶链式反应)可以使样品DNA扩增,获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如下图,图中短粗线是引物)。在很短的时间内将DNA扩增上百万倍,使实验室所
13、需的遗传物质不再受限于活的生物体。(导学号52260016)(1)图中的变性、延伸分别是指、。(2)假设PCR反应中的DNA模板为P,第一轮循环的产物2个子代DNA为N1,第二轮的产物4个子代DNA为N2,N1、N2中分别含有模板DNA单链的DNA分别有个、个。若继续循环,该DNA片段共经过30次循环后能形成个DNA片段。(3)某样品的一个DNA分子中共含3000个碱基对,碱基数量满足:(A+T)/(G+C)=1/2,若经5次循环,至少需要向试管中加入个腺嘌呤脱氧核苷酸(不考虑引物所对应的片段)。(4)若下图为第一轮循环产生的产物,请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。解析：(1)变性的
14、实质是DNA双链解旋;延伸的实质是以DNA单链为模板,按碱基互补配对原则合成子链的过程。(2)由于PCR原理为DNA双链复制,其特点是半保留复制,所以无论复制几次,模板链一直存在于2个DNA分子中。DNA复制的数量变化是指数式增长方式。(3)由(A+T)/(G+C)=1/2可知ATGC=1122,所以A的比例为1/6,在该DNA分子中的数量为30002(1/6)=1000个,5次循环形成的DNA数为32个,所以由原料合成的DNA数相当于32-1=31个,至少需腺嘌呤脱氧核苷酸为311000=31000个。(4)画图的关键是注意引物A、B的位置和所对应的模板链。答案：(1)模板DNA双链解旋形成单链在DNA聚合酶的作用下,原料脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链(2)22230(3)31000(4)如图
