第十讲蛋白质的物理化学性质分析

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1、u第一节蛋白质修饰的化学途径u第二节蛋白质改造的分子生物学途径u第三节重组蛋白质的表达一、功能基团的特异性修饰1.多位点取代2.单一的限制性取代3.次级取代二、基于蛋白质片段的嵌合修饰1.嵌合蛋白质非共价缔合系统2.二硫键与嵌合蛋白质的形成3.嵌合蛋白质通过化学激活形成肽键4.嵌合蛋白质通过酶连接反应形成肽键5.通过非肽键形成嵌合蛋白质第九讲 蛋白质的修饰和表达伊垒磨牛刷倔瑟梅佣挎弃径约艇按室哄圆赃耍邮济豫依选剖棉拂妆偷继巴第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析u第一节蛋白质修饰的化学途径u第二节蛋白质改造的分子生物学途径u第三节重组蛋白质的表达一、编码基因的专一性位点和

2、区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变2.区域性定向突变二、基因融合和基因剪接1.利用基因融合技术表达外源基因的缘由2.基因融合的策略3.产生蛋白质分子嵌合体的方法4.蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接第九讲 蛋白质的修饰和表达三、tRNA介导定点搀入非天然氨基酸绢撒芳级怕耀升捡疗埂实辟琵锋酝倘令癌龙涤丝袁些孩音硝浮协希看簇鸡第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析u第一节蛋白质修饰的化学途径u第二节蛋白质改造的分子生物学途径u第三节重组蛋白质的表达一、目标蛋白质在大肠杆菌中的表达1.表达载体的一般特点2.与外源基因有效表达的相关因素3.改善表达水平及溶解性的方法二、

3、目标蛋白质在酵母细胞中的表达1.有关酵母表达载体的复制、转录元件2.外源mRNA在酵母细胞中的翻译3.外源蛋白质在酵母中的分泌表达4.翻译后修饰第九讲 蛋白质的修饰和表达三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达1.选择哺乳动物细胞表达体系的优点2.两个主要的哺乳动物细胞表达系统四、噬菌体显示1.关于表达载体2.噬菌体显示技术的操作3.噬菌体显示技术的应用缮隧值牢恒娇槛鲜瘫窑隧啡棒记气联梆妹浪陛录裳讼旭锅螟毯绢构楔寓岳第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析u第一节蛋白质溶液的热力学u第二节蛋白质折叠动理学u第三节突变、稳定性和折叠1热运动与蛋白质构象2热力学函数与热力学平衡3热

4、容量4vant Hoff焓5折叠/退折叠转变6量热法与折叠过程热力学第十讲 蛋白质的物理化学性质分析欢继寥惫档乔丰托菜份料跨棉诞牲褪拷顾仿漓臃闲塌试慕八押雨艺株霍劝第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析任何生物学问题都可以分为两个方面，一方面是生物学的选择，另一方面就是这种选择何以能达到其目的。前一个问题的答案相当于给定了后一个问题的对象及其初始条件和边界条件；后一个问题则需回答在给定条件下的给定对象何以能在物理的和化学的自然规律的支配下完成生物学所规定的功能。第十讲 蛋白质的物理化学性质分析铆彬录间泵痛梭苍白衫只泉朗擒寇宁溶霸躁车谆劳裴滁纳香夯赋砒垄提狡第十讲蛋白质的物

5、理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析本章要介绍的蛋白质天然结构的稳定性和可折叠性是从遗传信息到生物功能的信息流动中的一个环节。生物学信息都包含在蛋白质的氨基酸序列和细胞环境中，需要回答的问题是给定的序列在给定的条件下何以能在生物学所要求的时间内达成足够稳定的、具有生物活力的天然结构。已有大量实验事实证明这个过程遵守物理化学规律。就目前我们掌握的知识而言，难点来自于两方面。一方面是尚未有成熟的液体统计热力学理论。另一方面则是多肽链骨架的线形共价结构所带来的运动学描述上的困难。第十讲 蛋白质的物理化学性质分析溢铅倚榷萌竭噎其聚贷翼屠令褒缉慕郑汝矗础性癸沼角炬狮泼扭案桑密云第十讲蛋白质的物理

6、化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析上个世纪 50 年代后期，特别是在遗传密码的分子基础被建立起来之后， Anfinsen 及其同事关于多肽链重新折叠的工作激发了对于折叠过程的物理化学的兴趣。具有适当初级序列的多肽链折叠成具有生物活性的天然结构，使得从遗传信息到生物功能的信息传递表达过程得以完成。在正确的物理化学条件下，蛋白质的折叠是自发的；在不正确的物理化学条件下，蛋白质通常没有紧致而特定的结构。在这个意义上，我们说蛋白质的结构只取决于它的氨基酸序列。基因一旦表达，即被翻译为一定的多肽序列，热力学就代替生物学机制起主导作用。原本是柔性、不规则的多肽链就折叠为生物学功能所需要的、更紧致、

7、特定的结构。第一节蛋白质溶液的热力学预田碾壤矛督泅旷泌勺辽拓米橡咯陌娠怎研诱纯撬付漏义朋翱滞极靳伴涨第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析作为蛋白质分子的多肽链是具有氨基酸侧链的线形分子。在被合成以后，除了部分多肽链会经历合成后加工，也有一些会发生二硫键的形成与断裂外，多肽链的共价键不再变化。在蛋白质折叠过程的研究中，只有二硫键的形成与断裂是共价结构的变化。二硫键的变化也强烈地依赖于溶液中相应的氧化还原剂的存在。绕着双原子共价键的旋转，可以改变分子的三维结构。绕单键旋转的角度称为构象角，给定一组构象角，就给出了多肽链的一个结构。所以，构象（视具体问题，常仅指主链构象）常被

8、用来指多肽链的三维结构。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学三淑滋猖抬芦壹竞瘁总栖犊沂卿耳怕勘讯沏疵试而茵散艇欣瞎尹欣釉恿需第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在构象取定以后，多肽链仍可完成复杂的内部运动。要对这种内部运动有所了解，或者说想要知道在通常的条件下，哪些运动形式较为可能发生，哪些较不容易发生，需要对溶液中的热运动有所了解。在蛋白质溶液中，所有分子都在不停地运动，这就是热力学所讨论的热运动。这种热运动既包括了分子相对于容器的运动，又包括了分子内部各部分之间的相对运动。要确定某一时刻蛋白质分子的运动状态是非常困难的，甚至是不可能的。但是蛋白质的三维结

9、构不仅取决于多肽链与溶液分子间的瞬时的相互作用，而且取决于它们永不停顿的热运动，所以先对热运动本身有一定的了解是有益的。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学墨锑廉饲芹啊露垄胸砖档骗津蓝姓镁唐黎碟曝厩桶桂秘域探惧删咆阶屯牵第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析对于单原子理想气体来说，每个原子的速度遵从麦克斯韦-玻尔兹曼分布，对于双原子分子，由于振动能级的量子化，能量均分定理不再成立。常温下双原子分子的振动能级很少被激发。在多原子分子中，围绕双原子键的旋转不是完全自由的，这种旋转需克服一定的位垒。绕双原子键的转动主要表现为在平衡位置附近的摆动，这是另一种形式的振动

10、。只有靠热运动的涨落，绕双原子键的旋转才可能实现。在多原子分子中，绕双原子键的转动常牵涉众多原子的位置变动和引起多原子分子构象的变化，这应该是多肽链折叠过程所涉及的主要运动形式。振动常指在保持构象不变的条件下，原子在平衡位置附近的运动。作为多原子分子的多肽链，围绕平衡构象的振动更是一个非常复杂的运动系统。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学点户锈域芭湾虑游卷晋驯政为赣叁阴绣坝粕喜醉稽磅熏蓑给递符渭汇铝海第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在热平衡条件下，在宏观上观察到的一种“状态”，包含了许多以不同概率发生的微观状态。每个微观状态需要由各个分子的位置、取向、

11、平动及作为整体的转动状态以及各个分子的内部运动状态所描述。可以假设许多不同的宏观状态，每种宏观状态有不同的微观状态概率分布，同时自己也有一定的发生概率。热力学平衡态就是有最大概率的宏观状态。蛋白质的天然态和退折叠态都是热力学的平衡态。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学蓬枣苛争悲贮狱罪邯焰削伟纽瞎掸誊歉帘转土展渣蚀查既旅难观茬缚凄宣第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析目前对液态水的了解远不如对气态水和固态水的了解。液态中的热运动非常复杂，尤其是蛋白质所在的水溶液本身就是一种极复杂的液体。在液态水中，相邻水分子以一定的概率形成氢键，因而存在一定范围的氢键网络。

12、氢键网络的数目、形状、延伸的范围都在不停地变化。无法像考虑整块冰的内部运动那样去分析每一个独立氢键网络的内部运动，更不用说去分析相连网络间的相互作用和相对运动。应该认识到，同样的困难存在于对多肽链热运动的分析中。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学晾枯彭辕鞠幸办每注咒攘胆绊炊郧细六爬焉刮慕啊啼雀后皆酞僵妇涉肃蝴第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析除了多肽链自身以外，多肽链还与溶剂分子存在相互作用。尤其是当有氢键或离子键、配位键等较强的相互作用存在时，多肽链与这些溶剂分子（水分子和各种金属离子等）形成一个整体，这使得多肽链的内部运动模式发生显著的变化。由于与多

13、肽链相互作用的强度和溶剂分子（主要是水分子）的数目总是在不停地变化，造成了分析蛋白质分子内部热运动的固有困难。一般来说，与溶剂分子的相互作用增加了蛋白质的有效分子量和内部运动自由度，这使内部运动的能级增加，分布变宽、加密。也使得可以被激发的内部运动增加。当然，另一方面的后果是纯溶剂在整个溶液中所占比例的减少。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学陶敞喊谜咸肪江炯蛤症捕帕巧囱衔巷饱化梢砖块喂婴唯绽蓬谭游卞灭秉谓第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析对于我们了解热运动来说，除了应该知道平均的热运动能量外，还应了解热运动的涨落。任何体系的能量分布都有一定的宽度，这个宽

14、度反映了体系能量围绕平均值或最可能值的涨落。对于大的体系，比如具有宏观尺度的体系，相对来说，分布是非常尖锐的，相应的涨落很难察觉。但是当体系变小时，涨落相对地（与体系的总能量相比）就会变得较大。这种涨落现象可以在布朗运动中观察到。对于像蛋白质分子那样小的体系，热力学能量的涨落就会是非常显著的。热力学能量的涨落在蛋白质的动力学性质中起着确定的作用。正是热运动的涨落，使多肽链可以聚集足够的能量以克服改变构象角所需要克服的位垒，并完成折叠或去折叠过程。各种程度涨落发生的概率决定多肽链构象变化的速度。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学拭航训枢域杉潞抡衰翘蛀错鹅歹杯睬疤怯嗡瑰笋震蓉扮圾二澜

15、姐固丹宠设第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析通过多肽链各部分之间和多肽链与溶液分子之间的相互作用，热运动可以在溶液中和多肽链的各部分之间传播。当在空间的一定范围内和在时间的一定间隔内的平均热运动能量不再随时间变化时，体系就达到了热力学平衡。在热力学平衡条件下，绝大多数的蛋白质分子有一个较为稳定（与其他构象相比，稳定自由能约为数百千焦每摩）而且紧致的（即所有残基紧密地堆积在一起）构象。这时，多肽链的绝大多数构象角有确定值（或者说确定的平均值）。这个稳定而紧致的构象就是蛋白质的天然态。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学械弧索隙旭烯被钢厦泉枝般呆唤即慎覆澳肌趁

16、跌吩母他褐逛翟翔钢与认再第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析多肽链的主链上含有氨基和羧基，侧链则取决于氨基酸序列而可以具有非常不同的亲疏水性和带电性质。可以预料，它在水溶液中与水分子及其他溶剂分子的相互作用会非常强地依赖于它的氨基酸序列。一段亲水的极性氨基酸序列显然有选择更多地与水分子结合的倾向，而一段疏水的氨基酸序列则会倾向于被包埋在蛋白质分子内部。对于随机合成的多肽链，也可以期望它在水溶液中的可能构象呈现出像它的可能的序列一样的多样性。 一、热运动与蛋白质构象第一节蛋白质溶液的热力学格羽侯宏桓证宜否咐辨嘱线篮舵椿娃柏竭撅躺继馏擎予浚羌敛删驳窿恃省第十讲蛋白质的物理化

17、学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在完全不考虑化学键的变化时多肽链的内能 E 由构象和内部运动所确定。体系的焓为： H E pV式中， p 为大气压力； V 为体系体积。蛋白质的天然态总是在多肽链与环境（通常是水溶液）的相互作用中形成而稳定的。多肽链的构象变化总是伴随着溶液的变化。往往难于描述的就是溶液的变化。式中的内能和焓均应包含溶液所作的贡献以及多肽链与溶液相互作用所作的贡献。由于这些贡献是分析的难点，对它们的了解有限，故常常只作为隐含内容存在。体积 V 是整个溶液的体积。体积的变化往往很小，所以，许多文献常常不区分内能与焓。 二、热力学函数与热力学平衡第一节蛋白质溶液的热力学木盎匆

18、媚哨佬闽侈科京趟革症钳夸戊先竞藤神懦曙苇寻店裙蹲姬床姜岳昨第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析 二、热力学函数与热力学平衡第一节蛋白质溶液的热力学眼苔彭贞涡叛夏差肥辟囱傻唇兑阂沾哥篆篱染扬棉彪诲葱晕计锌窒辗汕姆第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析假定多肽链有 N 和 U 两种稳定状态，比如说N 为天然状态；U 为失活或退折叠状态。在状态N ，多肽链有确定的构象，不确定的是它的内部运动。状态U 的情况就可能很复杂，它可能有几个、许多个或往往是无数个可能的构象，它以不同的概率选择它所可能采取的构象。在状态U ，也有可能一条多肽链只有它长度上的一段不再

19、停留在天然状态，而其余部分仍与天然态相同。一句话，失活态或退折叠态包含了天然态以外的其他任何状态，而且蛋白质分子不停地在可能状态之间转变。 二、热力学函数与热力学平衡第一节蛋白质溶液的热力学屏迹盔壳秀魏炳防吧黎人屿辙恩雅噬礁翅霉讲葱寿梢键假复版涩列冲瓮迫第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析需要注意下述事实。首先，在多肽链的两种状态（N 与U ）平衡共存的时候，体系也有自己的自由能、焓和熵等热力学量，只是没有明显地用到它们。 其次，体系的热力学平衡是由体系自由能极小决定的。在平衡达成时各种组分（处于状态N 或状态U 的分子）所占比例，取决于它们的标准自由能之差。 最后，无

20、论是从热力学还是从统计力学来看，熵都是一个有明确定义的物理量。熵的变化可以用实验方法测定。在简单的例子中，熵也可以用统计力学方法计算。 二、热力学函数与热力学平衡第一节蛋白质溶液的热力学笨臻韵溢车湿霞度静榷端霖塞裹粉淋崭瓶且岔瓮惦骋疆睫局依鹤勇耳后铺第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析量热实验，尤其是近30 年发展起来的使用微分扫描量热仪的实验，使得在蛋白质的折叠或退折叠转变过程中，直接测定热容量的变化成为可能，也使得测定在这些转变过程中如焓和熵这样一些热力学量的变化成为可能。在使用微分扫描量热仪的实验中，仪器以恒定的速率加热放在量热池中的蛋白质溶液，同时被加热的还有另

21、外一个作为参照的装有缓冲液的量热池。仔细地分别加热两个量热池，使样品池和参考池在温度逐渐升高或降低的过程中始终保持相同的温度。为维持相同温度，两个量热池在热量需求上的差别，就是两个池中液体热容量的差别。这个热容量差反映了热过程中的能量信息。 三、热容量 第一节蛋白质溶液的热力学息兑宛杨惦免捷末醛梢柜钨作恋开企赃拽卷老性哩艺焊姚桨工给褐盆累粒第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在测定蛋白质构象平衡转变的实验中，引起平衡移动的因素并不总是温度，其他的如失活剂浓度的改变，也可以引起蛋白质的折叠/退折叠转变。在这些实验中，构象变化常常是用谱学方法监测的。平衡常数根据监测参量的变

22、化间接得到。由于没有直接测量热，折叠/退折叠转变的焓变也不能测出。但是，如果在不同温度下完成这些实验，利用vant Hoff 作图，就可以从平衡常数随温度的变化关系中得到vant Hoff 焓。vant Hoff 焓的应用主要在对“两态转变”模型的分析中。 四、van t Hoff 焓 第一节蛋白质溶液的热力学纲线缮挽水题泪蜕瘫究纹沈璃徐惠吵慈腋呜壬加茅窖闹歇倍含侯著钢萨膜第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析蛋白质的失活可以由许多因素引起，温度、pH 值和失活剂的浓度增加都可引起蛋白质失活。我们已经提到蛋白质的失活状态是多种多样的。当有不可溶的聚集体或沉淀形成时，失活过

23、程是不可逆的。由于对不溶的聚集体的研究存在困难，目前还不能从对这些沉淀物的研究中得到多少信息。所以，人们更感兴趣的是对从活性态到失活态的可逆转变过程的研究。 一般在可逆的折叠/退折叠实验中，通过调节某一个可以引起多肽链发生折叠/退折叠转变的溶液条件，同时用荧光、紫外线吸收、圆二色或核磁等谱学方法来监测多肽链的结构变化。 五、折叠/退折叠转变 第一节蛋白质溶液的热力学惭恰盐虱气椎赵砒聘植锐正钉伙茎信笆表招屠瘤世耽忧考懊挚链勤央凤窝第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析与用一般谱学方法对蛋白质折叠/退折叠过程的监测不同，用微分扫描量热计对折叠退折叠过程的监测可以测定热力学量的

24、变化，因而提供更多的有关热过程的能量学信息。用微分扫描量热计直接测定的是蛋白质溶液的热容量与参考缓冲液热容量之差随温度的变化。对于众多的折叠/退折叠实验来说，只有使用微分扫描量热计的实验能够直接侧定退折叠过程中每摩尔蛋白质分子所吸收的热量（即量热焓Hcal) ，这是微分扫描量热计的独特能力。 六、量热法与折叠过程热力学 第一节蛋白质溶液的热力学促肝腻哎能吴焚耶刁璃彼菱邦咕戍蒂诞敢星舆畸芽奇包吴示库棉堆免冕恐第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析多年来用包括微分扫描量热计在内的许多实验方法所做的研究表明，如果用热力学自由能的语言来表述的话，蛋白质的折叠态与退折叠态相比只具有

25、不显著的稳定性。在近生理条件下，退折叠态和折叠态间的实验自由能差通常在2060 kJ/mol 范围内，这反映出平均每个氨基酸残基对稳定自由能的贡献比在相同条件下的平均热运动能小许多，同时也强调了蛋白质折叠的协同性。残基间单个的相互作用不足以维持蛋白质稳定的构象，但它们合起来的协同作用却能够做到。 六、量热法与折叠过程热力学 第一节蛋白质溶液的热力学茂皮靠藉祖惜全春泄劈活干手交詹焚腔讶洱鞘诀稼匀钵康佣登贿窄宽抓许第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析u第一节蛋白质溶液的热力学u第二节蛋白质折叠动理学u第三节突变、稳定性和折叠一、折叠动理研究技术二、两态动理三、过渡态1.折叠

26、过程与过渡态2.对折叠过渡态的性质分析四、折叠中间态1.熔球态2.快态与慢态3.二硫键引起的中间态4.多结构域蛋白的折叠第十讲 蛋白质的物理化学性质分析五、折叠的基本过程1.接触形成2.螺旋-链环转变3.-发卡形成潜每汇稠诗让馁姆幕鱼机卤庄陇乳戮葱版斟镶川皮绪读拳尖订妮叹浆功铬第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析蛋白质的天然态和退折叠态都是可以用热力学方法鉴别的多肽链的不同状态。虽然退折叠态并未得到充分的研究，在各种实验条件下存在的退折叠态也不尽相同，但一般地仍可以认为可以重折叠的退折叠态是多肽链在热力学平衡状态下存在的构象不停地变化的状态。热力学平衡可以向天然态方向移

27、动，也可以向退折叠态方向移动，取决于环境条件的变化，于是有了平衡态的折叠和退折叠转变过程。第二节蛋白质折叠动理学杉埂情缄贸谴咳鲸艾劳妈叮琢败类楼愚垦石勿蜒更镁航辗传慑留档暗梧款第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在对体系平衡转变的研究中，每一次环境条件改变后，无论这种改变多么微小，都应耐心地等待体系建立起新的平衡，再进行下一次测量，否则，可能会发现测量结果是与连续两次测量之间的时间间隔有关的。注意到这种现象后，从另一个角度来思考，可以提出这样的问题：对于任何给定的环境条件变化，蛋白质的状态将作出怎样的时间响应？换句话说，从热力学平衡转变研究的结果可以预期到的平衡的移动是

28、如何在一系列的时间序列中一步一步地达到的？这就提出了折叠过程动理学的问题。虽然在折叠/退折叠过程研究中所着眼的只是多肽链构象的变化，一般并不涉及化学键的改变，但用于化学反应动理学研究的许多成熟的实验技术和理论概念都被用来研究蛋白质的折叠/退折叠动理。 第二节蛋白质折叠动理学驮兼别鲤局生撇胚淬睡坡蜡剐渴涤嘲蹬国孜华压通惩晋肆搐状耗当囊蔓填第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析从化学反应的观点来看，从天然态（N）到退折叠态（U ）的转变可以看成是一个可逆的化学反应：NU首先提出的问题是，在转变中有没有中间态？如果没有中间态，那么反应就是一个简单的两态转变；如果有中间态，那么有

29、哪些中间态？它们在结构上有什么特征？它们的相对稳定性如何？哪一个是最稳定并因而是决定反应速率的中间态？第二节蛋白质折叠动理学峦邪兆寿霖郊瓤茶渡碗力扶雕蓄扮沈器熔拾艾诵绕欲雾寸兢各咳货暴勿青第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析其次，不管是单步的两态转变，还是由多步反应组成的复杂过程，每步反应是否有过渡态？如果有的话，过渡态在结构和稳定性上有什么特征？原则上，当把所有中间态和过渡态的结构、稳定性以及它们在折叠路径上的位置都搞清楚之后，折叠过程就在动理上弄明白了。这当然是非常困难的任务，因为折叠中间态是在短暂的时间内形成的，它们又只有很短暂的寿命。只有那些后继步骤进行得很慢，

30、因而可以积累到一定数量的中间态才有可能得到研究。至于过渡态，它们的寿命更短，因为从概念上来说，它们是折叠过程中最不稳定的暂时状态。并且，过渡态概念是否能一般地适用于蛋白质折叠过程，仍然是值得怀疑的问题。 第二节蛋白质折叠动理学痔歪淌场儡带陵隘楚坦抠受挪借戴绢曾潦辅赤事蓉刑中芋伴悼宦蝎兑蠢有第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析对过渡态概念适用性的怀疑产生于退折叠态的复杂性。蛋白质的退折叠态在构象上是不均一、多种多样的，这使得折叠和退折叠反应都是多重并行的。这些并行的反应在过程的某些阶段有可能会合并起来，或者保持分离一直到反应结束，这使得蛋白质折叠的动理更加地复杂化了。 第

31、二节蛋白质折叠动理学患靶街铡婴去爪效割曳宰素狮色罩瓶陋家绿毒铡营谭挎花技螺氢乔液疹部第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析最后，从科学研究应由简到繁、由浅入深的规律来看，在折叠动理研究中首先应当研究的是两个残基间形成接触这样的基本过程。由于快速混合技术的发展，从残基间接触形成、螺旋和发卡形成、直到单结构域小蛋白质的折叠，这样一些快速的简单的折叠过程的研究揭示了蛋白质折叠过程中最本质的特征。尤其是小蛋白质折叠速率只与反映天然结构中残基间相互接触的长程性的简单特征有关的事实，更加深了我们对折叠过程物理本质的理解。 第二节蛋白质折叠动理学眉企谓如收祸素尤唆叙汉翌内预润粳赵壬氏座

32、抡弱踞啊攀痞暗驳梨井孔惦第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在化学反应动理研究中常采用反应流（flow ）技术和流动停止（stopped-flow）技术。这些技术只需要较少的样品，又可以得到较高的时间分辨率，所以得到了广泛的应用。在反应流方法中，参与反应的各种组分被注入一个管道中，并在其中连续地流动。各组分在向前流动的同时，由于混流和扩散（热运动）而相互混合并发生化学反应。在管道的不同位置安装用于监测反应进程的装置，就可以观察体系状态随时间的变化。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学钒桩兹纬宇库甥妙洒陌季淬闷镑叼润里滩恬暴嗣侗涯扑涸盘昌皿焙首琉偿第十讲蛋白质的物

33、理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析如果各组分的混合过程较慢，有些部分已开始反应，而另外一些部分尚未混合，观察就会受到扩散等混合过程的干扰，使实验结果难于解释。这种干扰很难排除，于是产生了由于混合过程不是无限快而产生的测量的“死时间”。在流动停止法中，把需要混合的液体快速地注入空腔。空腔中装有活塞，当液体注入时活塞后退；当活塞退到一个止点时液体停止流动，快速混合起来的液体则继续发生反应。这种方法只需要很少量的样品，因而在蛋白质折叠动理的研究中得到了广泛应用。在通常的流动停止装置中混合的死时间大约是l ms。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学感豁杭磋尤鸣儿营言手及猩绢瞪匪娠华捉

34、崇伏陵妻糜酞恐王沸庭笋率掂剖第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析我们目前关于蛋白质折叠/退折叠动理的大部分知识都来自于流动停止法实验所获得的无数有价值的信息。但是这些方法有一个基本的缺陷，与快速的蛋白质折叠相比，它的时间分辨率仍然太低，毫秒量级的死时间对于蛋白质折叠中的许多重要事件来说是不够快的。在许多实验中典型的情况是，在这个死时间之内多数的（有时是所有的）与折叠有关的谱学变化已经完成，因而根本无法监测到结构的变化过程。在对合成的多肽链的研究中发现，像a 螺旋形成那样的基本过程发生得太快，以致无法用流动停止法来观察。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学限搔衷癌

35、距涤钳枕触壁嚏呻绝啥昏谚腑羽愚叼妻叛敬掠赞吉甥停梆摔躁匈第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析由于技术的进步和研究工作的需要，发展出了研究快速折叠的方法。这些方法可以分为光化学触发温度或压力跃变超快混合技术 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学夷教华蕴圆拨腑怜茅价铃锤筐靴蜘躁样漱誉侯万匪脏序烙骑虏冬酣采厚念第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析第一个超快折叠研究采用了光化学触发技术，即用短脉冲激光来触发失活的细胞色素c中一氧化碳的光解，这个实验利用了一氧化碳与失活蛋白质中的血红素的结合比与天然蛋白质中的血红素的结合要紧密得多这一事实。在与一氧化

36、碳结合的状态，失活的蛋白质更稳定；而在失去一氧化碳的时候，天然的蛋白质更为稳定，于是一氧化碳的光解就可以起动失活蛋白质的重折叠。因为光解发生在小于皮秒的时间内，这种方法对于折叠实验来说具有无限制的时间分辨率。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学汉负律幌严又培戒秉扇农嫁斡碗灶启韭奋略魁骇作假亲土阑供槐终鸣宋脾第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析一种在概念上相似但更一般的方法是用光诱导的电子迁移反应来起动折叠。第一个这样的实验也是用细胞色素c 完成的。还原形态的细胞色素c 比氧化形态的更稳定。导致这种稳定性差别的最基本的原因是在天然蛋白质中80 位的甲硫氨酸与血红素

37、铁离子之间的化学键的稳定性增加。钉bL-吡啶络合物或NADH 的光激发产生一个长寿命的激发态，可以作为强还原剂。注入一个电子后，在数微秒的时间内，细胞色素c 的血红素铁离子就从三价还原为两价，并使折叠起动。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学政赋免何禽短忱颈职沧阑驶病缩彼魂凝苯颗长橱素疹弛缚仔窿禽进滴奥镰第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析另外一种不同的光触发方法使用光失稳的二硫键，它不需要一个金属结合位点，因而可以用于更广范围的蛋白质的触发。在这种方法中，用二硫键交联多肽链片段，只要恰当地设计交联位置，就会使蛋白质被限制在错误的构象中。二硫键的光切可以发生在亚

38、皮秒时间内，从而快速地触发重折叠。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学侥肢互现病孟铅蕉乍隋妈窖科痔嘿辨谜赫饮及湃氯莫布酋迄抒首彼汪尘纪第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析第二类光触发使用激光脉冲以产生温度跃变，这是一种可以更广泛地采用的方法，因为任何产生显著焓变的折叠/退折叠过程的平衡都会受到温度跃变的扰动。这种方法的第一个实验通过用工作在532 nm 波长的皮秒激光加热染料溶液来实现的，这一实验的时间分辨率是约70 ps ，这个分辨率取决于使热量从热的染料分子扩散到溶剂分子所需要的时间。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学足阿嘘钧斡乏槛盎竭勇波碴舆徘股

39、驳待凌长秒咆番炮韩了迫龙栗识喘蝴涂第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析像尿素和盐酸胍那样的失活剂在蛋白质折叠实验中一直起着中心的作用。几乎所有蛋白质都可以在足够高的失活剂浓度下退折叠并保持可溶，所以失活剂的稀释将继续保持为起动蛋白质折叠的极重要的方法。由于这个原因，相当的努力用在采用连续流方法以提高混合实验的时间分辨率上。最近有两种这样的方法被用于蛋白质折叠，一种基于湍流混合，另一种基于流体力学聚焦。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学蔓湛酶方法烟愈杭咳株愚席朴瞅月胖殷手竖沙焊孤碟板纂惋谤另鹅矽毒款第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在湍

40、流混合法中，液体被强迫以高速穿过一个狭缝，高剪切力产生的湍流把液体“粉碎”称为湍流泡（涡旋）的非常小的体积元。由于失活剂的扩散只需越过很短的距离，混合过程很快（l 10 s）。在这种实验中，混合液体以恒定速度连续流动。在由混合器引出的喷管的不同位置上进行动理监测，时间通过距混合区域的距离和流动速度来测定。动理测量的第一个时间点显著地长于混合时间，因为混合溶液需要流过一个对监测用的探测器是不可及的体积。但是，这些仪器的死时间只有502s，这比流动停止法改进了一个数量级以上。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学殴娶会墒翔嫩郎摆穆萤肉砌榴狂糕柄尤畜健良讣卜令梨檄理良葛蒜巧婚供第十讲蛋白质的物

41、理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析第二种快速混合方法采用流体力学聚焦技术，以产生一股与容器内周围液体接触并以恒定速度流动的微观或亚微观厚度的蛋白质溶液流。通过液体以扩散方式进入或退出这一狭窄的蛋白质溶液流，两种液体发生混合。蛋白质溶液曾经被聚焦到50 nm 那样小的宽度，这对应于约1 s的混合时间。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学椭威犬貉载泳煽泌赁厂旱淖符忿立吧阐鸟踩窜阴羽栗仿更踪吮行卑限众初第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析与湍流混合法相比，这种技术应该能够显著地减小有效死时间。流体力学聚焦技术的一个优点是液体流是层状的，结果使得在混合器中，所

42、有成分在所有位置的浓度（包括在混合区域）原则上都是可以用理论方法计算和用实验方法测定的。采用这种技术，应用亚毫秒时间分辨的小角X 光散射法成功地测量了蛋白质折叠过程中过渡态的惯量半径。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学撬横雄牛攀该监督物了泵汪怠婿忍烁玄蝴裳抛龙锤炙访滋蝇盾业棠彭熊括第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析最后，蛋白质折叠动理可以在平衡态用动力学核磁共振方法来研究。对于经历两态折叠/退折叠转变的蛋白质，如果这两种状态的共振频率和转换弛豫时间都是已知的，则折叠和退折叠两者的速率都可以从线宽测量出来。在10 s10 ms 范围内，当折叠态和退折叠态都有显

43、著的分子分布时，这种方法用来测定转变速率是很有用的。 一、折叠动理研究技术第二节蛋白质折叠动理学晰瓶来使或抱合遭惺原普巢搐汉皱坞牛芒玉株衍呀褥执吗琢袒拇夷改峙徽第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析许多小蛋白质的折叠是协同的两态转变。在不同的溶液条件下（如不同温度、pH 值或失活剂浓度），溶液有不同的平衡常数。天然态和退折叠态分子在样品中所占分数可以用动理学和平衡热力学两种方法测到，这提供了严格的方法来检验蛋白质折叠反应的两态特征。实验表明，动理测量得到的天然态和退折叠态分子所占分数与在同样的溶液条件下用平衡转变测量得到的相符。 二、两态动理 第二节蛋白质折叠动理学扯欧磅

44、宣铆基剃强偿鞋推澈幕笛手兴交改讳刚保幼子茅萧荐前锈豆啼位槛第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析对那些快速折叠蛋白的实验表明，在小于毫秒的时间内，包含在氨基酸序列中的信息就可以被翻译成最终的天然的三维结构，这比人们早先所持有的看法快得多。这些小蛋白质在它们的折叠中遵守两态机理，同时，甚至在通常折叠和退折叠达成平衡最慢的地方折叠转变的中点它们也能极快地折叠。快速折叠的特征与二级结构的大小有关。所有快速折叠的蛋白质或蛋白质片段所包含残基数都小于100 个 。 二、两态动理 第二节蛋白质折叠动理学拣鞘谴甭迅充南机膝烷瑚冶滦涪滋翔帖寒芝呢样部畅愤珠凿朴善灼专祝玖第十讲蛋白质的物理

45、化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 折叠过程与过渡态在化学反应中速率是由始态与终态之间的位垒决定的。这个位垒的位置定义一个过渡态。反应物只有越过这个位置才能生成产物达到终态，所以又把过渡态称为活化态。按过渡态理论，过渡态与基态（始态和终态）处于准化学平衡状态。因而一些平衡热力学量可以从反应速率常数对温度的依赖关系得到，就如同反应的热力学参数可以从平衡常数对温度的依赖性得到一样。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学驴霸府足女湛延趁颊钡迁副俭对采琼清议耻令习啡瓤攀节紊篆闻搭沽浊双第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 折叠过程与过渡态过渡态理论是在研究小分子的化学

46、反应中发展起来的，用以描述反应中化学键的形成与断裂过程的热力学。这种理论是否适合于描述蛋白质分子的折叠/退折叠过程，应该是有疑问的。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学努瞳士会吹狼躁渠姐柑拾咽治晒开崖莽游巧息涧艰搪美悍盎沟聊唤当盛虎第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 折叠过程与过渡态蛋白质的折叠涉及协同地形成许多微弱的非共价相互作用，并且天然构象的形成是沿着一条梯度十分平缓的路径进行的，因而可以非常令人信服地假定，在退折叠态和天然构象间存在许多不同的路径。在最极端的情况下，溶液中每一个蛋白质分子在折叠中都有自己独特的路径。很清楚，如果折叠没有惟一的路径，那么，也不会

47、有惟一的热力学过渡态。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学咖诊冤栗粘蒂学腾熬鞍痴倒尚坊毁骄辖哭赁怜勋剑筹哦怯仿赚疹者菲袁壤第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析过渡态理论的中心假定是过渡态与基态在准热力学平衡中共存，虽然过渡态只有非常短的寿命。对于只有很少自由度的小分子来说，这种假定是很合理的，但对于蛋白质却不一定成立。对处于过渡态的蛋白质链，可以达到的构象空间仍然是非常大的，因而在过渡态存在的短暂时间内，不可能对这个空间做完全的取样。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学翼杏帅仿玉近釜缝蛀嚏傈嫁空惕拢恒蘑逗啊判绢铆消蕊门六莉贼冒冬救玉第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋

48、白质的物理化学性质分析由于对折叠的本质尚未很好地理解，很清楚，不可能在理论的基础上判断折叠是否由过渡态控制。但幸运的是，蛋白质的折叠反应满足几个受过渡态控制的过程所满足的实验标准。 在蛋白质折叠中存在一个把天然态和退折叠态分开的位垒。这个位垒的存在决定了许多平衡退折叠转变具有与一级相变类似的两态特征 。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学熔鲁睁消脸控貌胰煮沪蔷惠椿勿亚而折疟们灾峭牡戮烤兼锻碉杭碱齿碟储第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析 小蛋白质的折叠动理遵守化学动理的简单规律，即蛋白质的物理性质在折叠过程中的变化遵守单指数动理规律。这确认了在退折叠态和天然态之间存在一

49、个共同的位垒，所以事实上所有分子在折叠中都要遇到它。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学碧鼠舌赵帚芦楔蛾蕴奴贯溪椒疫己凛鞠贰市受熊纳警梅示歪痢下酥徘泄光第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析 在相同终态而不同始态的条件下，可以观察到退折叠重折叠的相同的速率常数。这证明，在进入新的溶液条件准备开始折叠的时候，蛋白质分子间存在决速的预平衡，以致(退折叠态的多样性)并不影响折叠的限速事件。换句话说，折叠中的分子并不保存对它们早先退折叠状态的历史的记忆（这种历史对单个的蛋白质分子可能是不同的）。当然，这一点对于一些有复杂因素介入的退折叠分子是不成立的，这些复杂因素包括脯氨酰顺反异

50、构、二硫键连接的链套的拓扑异构或与辅因子相互作用的方式不同。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学豁尉园灯萧稼妨筒污啊喷嘎填绩止性宽对腊较独佑吮妨蚜沙憾兑绕醛靴劣第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析一些实验事实一起证明蛋白质折叠确实是受活化控制的过程，所以过渡态理论广泛地用于分析过渡态的性质。在平衡条件下过渡态不会有显著的分子布居，所以过渡态的性质只能根据反应速率常数及其对体系变化的反应间接推断。常常采用两种互相补充的实验方法。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学茶该繁县谎殉裔视牲观溶话邵铡品涩月蛮猪掇匹渔利树挺硫徐允楼陶龟宝第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物

51、理化学性质分析在第一种方法中，变化折叠实验的条件（如溶剂成分和温度）以从所引起的退折叠和重折叠微观速率常数的改变中确定过渡态的热力学性质。在第二种方法中，用定点突变改变被研究的蛋白质，以探测突变残基对过渡态能量的贡献。两种方法的相同前提是，无论是对折叠条件还是对蛋白质进行的改变，都不要改变过渡态本身，而只是改变过渡态相对于退折叠态和天然态的稳定性。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学毅恍镐秋胸舱驼梧郑合详极粒瞒池灵梆意吮踏蜜贝兔迢护瘸庞憨勘脖惯头第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析2 对折叠过渡态的性质分析对过渡态性质的分析通常基于过渡态理论所假定的一个简单的反应图（图

52、45 ）。退折叠的活化吉布斯自由能等于天然态和过渡态间的自由能差，而重折叠的活化吉布斯自由能等于退折叠态和过渡态间的吉布斯自由能之差。 三、过渡态 第二节蛋白质折叠动理学都鹏帅祖嫉氨瞳咖贾丧椎刮情夹匆享禹鄙蓄复憋咏末竞玄亦贬葫拨槛蜗穗第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析图4-6 两态折叠反应的反应坐标图。横坐标为反应坐标，纵坐标为吉布斯自由能。反应向右进行时为退折叠，向左进行为重折叠。活化能一般情况下高于退折叠平衡自由能。值显示沿反应坐标过渡态与折叠态和退折叠态的相对位置。当值接近于1 时过渡态接近于折叠态；当值接近于零时过波态接近于退折叠态。 三、过渡态 第二节蛋白质

53、折叠动理学链击铲合旧爱靳窒坤太诗喜篇块沤琳订泳鲜格兔截双谦踌娩现稻廓钧莆芝第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 熔球态某些蛋白质在平衡态下确实可以半折叠的状态存在。可以通过把蛋白质暴露于中等浓度的失活剂中，或低pH 值下，或加盐的溶液中，来产生这些稳定的形式。不同蛋白质的部分折叠的中间态共同享有一些基本的特征。它们通常是紧致的，直径只比各自的天然态的直径大10 20 。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学咨赘厕她佯炯铣乃暮虽襄巫种俞哺脊篮榷蠢采囱御革诺趋良蟹汗饲枷巍载第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 熔球态用圆二色性在酰胺区域的检验显

54、示它们与天然蛋白质有相同的螺旋度。残基间特异的非局域的三级堆积相互作用似乎在这些形式中已经消失了，结果，这些中间态在芳香区域没有圆二色性，1H-NMR信号也不如在天然蛋白质中那样弥散。这些部分折叠的状态称为“熔球态”，虽然含意各有不同变化，但这个名称仍得到了广泛的使用。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学弄友腔奖父然绎粳编朝息掳傲赔敝湿燃揩闸删呛吃牲礼北漏澡弦射酶蛙递第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析就在平衡转变研究中发现熔球态以后，在折叠的动理研究中也发现熔球态是具有中心意义的中间态。假定在蛋白质链折叠的早期就迅速地蜷缩为一种租略的球形，并且如果同时伴随着以氢键

55、结合的二级结构的自发而广泛地形成时，这样的蜷缩就是最有效的。氢键减少了蛋白质骨架的极性，因而增加了疏水蜷缩的驱动力。随着二级结构之间的装配，这些氢键转移到低极性区域后变得更加稳定。疏水相互作用与氢键的这种相互加强的效应提示，甚至在早期阶段折叠就已经是一个协同过程。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学茄收凉叮标埔睁钮蔗蜀粗否尿枚哪蛆瞪脂拣篱吧杯饭卿肥讥旨泞巾敝嚣倪第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析熔球态的研究集中在如a-乳清蛋白、葡萄球菌核酸酶和肌球蛋白那样的小蛋白质上。在具有较弱三级结构的蛋白质中，或在三级相互作用由于紧密结合的辅助因子（如肌红蛋白中的血红素，或a

56、-乳清蛋白中起稳定作用的Ca2+）被移走而减弱了的蛋白质中，最容易观察到熔球类型的中间态。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学港啃智桐呼厌钮矢鸿报灿嘴赠舷橡爪漳照要侮说唯榴没奠迹匀沁稍洽雀簧第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析实验数据表明，三种蛋白质 脱辅基- 乳清蛋白、葡萄球菌核酸酶和脱辅基肌红蛋白的半折叠中间态展示出可以分为两部分的结构。在这种中间态，蛋白的一部分有定义得相当明确的三级结构和最少是部分的非局域相互作用，而剩下的部分则以退折叠形态为主。这些蛋白质的实际状态不同于原本意义上的熔球态。在原来的意义上，熔球态展示出以类天然的二级结构和三级相互作用的丧失为

57、特征的整体上松散了的结构。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学雨委传堪追狂熙骏裂浸劈缎虾跃苗妒绽愤忱钉镰鞭辨早对篇约喻雀攫乏史第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析2 快态与慢态蛋白质折叠与一般化学反应不同的一点是退折叠态在构象上的多种多样性。如果所有分子都要以相同的路径折叠，相对于整体的折叠速率来说，这些处于退折叠态的分子必须非常快速地在各种构象间转变。由于导致构象变化的绕双原子键的转动只需克服绕单键的低的而且彼此相差不大的位垒，对于那些较短的多肽链来说，这个条件可能容易满足。但是，当肽链变长、天然态的结构变得复杂时，退折叠态或半退折叠态的各种构象在寿命上的差别就会

58、显现出来。所以，一点也不奇怪，中间态的存在是更常见的情形，尤其是存在一些可以导致构象转变的更慢的过程。脯氨酸肽链的顺反异构化就是这样的慢过程，二硫键的形成和断裂则是更慢的过程。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学锄丈体肢揪破招盲景儿阀跑凉拆志衙蚂僻型比翘唾拖转慰茫渝玻兰咨霜单第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析如果用快速混合技术来研究蛋白质的动理学就会发现，许多蛋白质的部分分子在以秒计的时间或更短的时间内达到它们的天然态，而剩下的分子的折叠则慢得多，往往要等待数分钟它们才能达到天然态。在以同样的天然态为终点的重折叠实验中，很容易发现快和慢两种不同的动理相。而在失活剂

59、存在下的退折叠则常常是单相过程。快的折叠（UF ）和慢的折叠（US ）同时存在的过程可以用下面的方程来表示： 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学麓窄涨隔垫戒鉴赠葫齿秧骆陀梢米拖尖匆岂堵簇盈坷讼骏锋跋高统壳吴涝第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在体内条件下，有多种脯氨酰异构酶可以加速顺反异构 过 程 ， 从 而 也 加 速 有 关 蛋 白 质 的 折 叠 。在各种退折叠的蛋白质中，脯氨酰异构化是得到明确鉴定的慢反应。慢反应还可以由其他一些原因引起，比如慢的配体交换、二硫键连接的链套的重新安排等。慢反应分子和快反应分子的共存是由于退折叠态多样性引起的折叠路径的多样性的

60、最简单例子。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学醉累信咳襄欧跃厩询凳俊骂锰厦络乔妨兑炸恕疏只铸稳妖期汽洱孔盗恰证第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析3 二硫键引起的中间态对于在天然态中存在二硫键的蛋白质来说，这些二硫键必须在折叠反应中通过氧化反应形成。二硫键生成反应需要有一个像由氧化和还原的谷胱甘肽混合物组成的那样的氧化还原体系，以进行共价的巯基/二硫键交换。在体内，真核细胞中有二硫键异构酶，大肠杆菌中有DsbA 和DsbC 蛋白。这些琉基/二硫键氧化还原酶在二硫键生成反应中起着氧化剂的作用。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学惮闭讹描颅诬膊蚁堂盼伏讯繁德绽肋绪

61、碉詹骸捻瞪费粘梯啥锰冶活君爽挟第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析3 二硫键引起的中间态在牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI ）中，各二硫键形成的顺序（路径）和它们与构象折叠之间的关系已经研究得很清楚，因而以它作为例子来说明氧化折叠反应的基本特征。在有二硫键的蛋白质中形成半折叠中间物的现象并不很普遍，在RNaseA 和RnaseT1 的折叠过程中就很难发现这样的中间态。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学瞳协雹蒲骋琢讶编郭杉吮妨颤偏屑寄座台穗垛超碟孟今厢丸靡猎胀敞滤天第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析4 多结构域蛋白的折叠迄今为止，有关蛋白质折叠的

62、概念和实验工作都是针对小的、单体的、单结构域的蛋白质的。典型地，这些蛋白质含有100 个氨基酸残基。这些蛋白质代表折叠的基本单元，因而也是研究折叠机理的正确选择。更重要的是，这些蛋白质常可以可逆地折叠和退折叠，这是定量研究折叠热力学和动理学的必需条件。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学纲筐铁兹销钢倍抑赦辑圃运暖刀抬管览腕次碉碳仔俭你茄凌抵灌跳恢戌豌第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析4 多结构域蛋白的折叠但许多蛋白质有多于一个的结构域，也可能有多于一条的链。在单个结构域或单条链折叠起来之后，折叠尚未完成。在折叠的某个阶段，必须把这些单元装配或结合起来，以使天然态能

63、够形成。单个结构域的折叠常常是迅速的，但结构域间的对接或亚单元之间的结合则可能非常慢，并因此而成为折叠过程的限速步骤。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学特垛摸庐莆拦泼掂墒纱赏灭肠恫纷丙坪绣添纲布篙洱蠢羡章匆撤辰壬鸦贮第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析4 多结构域蛋白的折叠大蛋白需要数分钟或甚至数小时来达到天然态，而不是如小蛋白的仅需数秒或数毫秒，因而在大蛋白的折叠中会出现致命的问题。长寿命的未装配的结构域或亚单元会聚集，而不正确地配对的结构域也会形成无功能的物质。从这些方面考虑，大蛋白的折叠机制要比小蛋白的折叠机制更难以阐明。并且，对一种特定的大蛋白质要找到在体

64、外的可逆折叠条件仍是一门艺术。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学滤探迫猪梗独厚霜诊恐蔬眩纷汕搁祥椒封豁厦尸旦炬侄妊摸幽茧揉袋显忍第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析独立的折叠结构域最容易用量热计鉴别。当用热容量的变化来跟踪热致退折叠时，在完整的两个结构域的蛋白质的熔化曲线中可以找到两个峰。在双结构域的退折叠过程中有三个阶段：两个结构域的分离；第一个结构域的退折叠；第二个结构域的退折叠。对于大多数的双结构域蛋白质，量热曲线的第一个峰代表结构域-结构域相互作用的丧失和较不稳定的结构域的退折叠；第二个峰代表较稳定的结构域的退折叠。而在起稳定作用的结构域-结构域相互作用不

65、存在时，较不稳定的结构域会更不稳定，所以当被单独研究的时候，这个结构域的退折叠转变会移动到一个较低的温度。较稳定的那个结构域在理想的情况下会在与完整蛋白质相同的温度下退折叠。 四、折叠中间态 第二节蛋白质折叠动理学耗挨省协堡砸盆仕绕锈魂愈耘弛隧乾倪瑶网期塘震码吼斑九枉锻氓椿猿练第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析l 接触形成蛋白质折叠过程中最简单的基本过程可能就是在退折叠的多肽链中两个残基间接触的形成。虽然这个过程很重要，但是，直到光解实验用于细胞色素c 之后才开始得到研究。 五、折叠的基本过程 第二节蛋白质折叠动理学码绑者锑殉佐靴矛刀趣鲁抠妹尼谢诵糟酷文月锗旁远墒掐滇

66、瞧瞎廊恐叮艺第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析色氨酸三重态寿命测定提供了一种有用的方法来研究退折叠的或正在折叠中的蛋白质中特定分子内接触的形成动理。它们也证明了这种方法可以用来解决多肽动力学性质中的重要问题，其中最重要的是接触形成速率与长度和组成的关系。据预测，链套的最可能长度约10 个残基。这些计算表明，如果肽链过长，因为会导致较大的熵减少，末端对末端的接触有较低的可能性；而在较短的链中，由于链的僵硬性，末端接触的形成也是不利的。链套概率的极大反映接触形成速率的极大。在含有甘氨酸的多肽中没有观察到这样的极大，主要是由于与理论计算中的一般多肽相比它们有更大的柔性。 五

67、、折叠的基本过程 第二节蛋白质折叠动理学奈杯孰捐几抽深屎艇淀怠孕袁毫桌拂旋鄙废祥赡玖肌蓉瞳雪应料且赣拧晰第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析2 螺旋-链环转变从20 世纪80 年代的后期以来，开展了大量的分离肽 螺旋形成研究和理论分析。此后才有显著数量的大小与组成与蛋白质中相同的多肽被证明在纯水溶液中为螺旋。由于具有强螺旋形成倾向，所以高丙氨酸含量的肽特别地适合于这种研究。加之这样的多肽又容易制备，使得它们成了适用于快速动理技术研究的首选对象。 五、折叠的基本过程 第二节蛋白质折叠动理学脖诌戏撤宦剁烧个尼若奴辩圃疫桓管热画柄行弊嫌余遥浇梆荔砾档捶咳芝第十讲蛋白质的物理化

68、学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析2 螺旋-链环转变有几个重要的涉及螺旋-链环转变动理的事件仍有待澄清，包括直接观察螺旋生长的速率、探寻氨基酸取代和链长的动理效应。尽管可以从模型得到生长速率的估算，但通过采用时间分辨的近红外或拉曼测量以及具有纳秒时间分辨率的温度跃变法，应该有可能直接观察螺旋生长过程。靠化学修饰来使肽链有一个预先存在的螺旋核可能会使这种研究容易一些。 五、折叠的基本过程 第二节蛋白质折叠动理学从荡骇抑萤淫枷音孙近蛊瑰傲钻阎蹿如缆呸喂了志巴赊镜普楚袖记各播途第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析3. 发卡形成对片的研究并不像对螺旋的研究那样普遍。原因是

69、直到最近才有可能研究孤立的片。最简单的片只含有两条链段，即发卡。因为使这些发卡稳定的疏水侧链同时也使它们很黏糊，当浓度高到可以用核磁共振法来鉴定结构时，孤立的发卡就倾向于聚集。 实验显示，发卡构象在几个毫秒内形成，这与丙氨酸肽的螺旋形成速率相比慢了一个数量级以上。这个发卡的热力学和动理学行为非常类似于一个小蛋白质。 五、折叠的基本过程 第二节蛋白质折叠动理学址秸承荆敞砰瘤桃塘论爸袍蔗爆溜放洼疥掸岂矣谩隶慌肃稿谦计蹄膳露品第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析u第一节蛋白质溶液的热力学u第二节蛋白质折叠动理学u第三节突变、稳定性和折叠二、突变与热稳定性1.疏水突变2.氢键突

70、变3.适应极端条件的突变体一、热力学参数在分子水平上的解释1.静电相互作用2.范德华相互作用3.氢键4.疏水效应5.二硫键第十讲 蛋白质的物理化学性质分析三、突变与折叠过程1.过渡态的突变分析2.突变对稳定性和折叠过程的影响影膘器枯乌瓮秤肤擂篱伤汹晋呈敛寇址醇拔验徽蛀攫及沛阻徐壬旧纶样缸第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析蛋白质折叠/退折叠的平衡热力学的和动理学的研究表明，具有生物活性的蛋白质天然态是在热力学平衡状态下存在的单一构象状态，而失活态则是多构象状态。折叠态与退折叠态相比只有不显著的，但对有机体来说是足够而且适当的稳定性。总的来看，一般多肽链的折叠/退折叠是非

71、常复杂的过程，而且往往是不可逆的。许多单结构域的小蛋白质的可逆折叠/退折叠转变成了认识一般蛋白质折叠过程的基础。这些小蛋白质折叠表现出典型的两态协同过程的特征，以单分子为协同单位，又适用于过渡态理论。第三节突变、稳定性和折叠脯酿吏峪艳搂蔑何肾糟肛寻柔罩按章灸头教洼靴织皆昭二左毕扣涣规志折第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析这种协同性是以大量的弱相互作用为基础的。单独的相互作用不足以稳定结构，但许多不同残基的协同相互作用才显现出足够的稳定效果，并引导多肽链以一定的方式运动。当存在较强的相互作用，或存在较高的构象变化的位垒，或存在除肽链之外的其他因素时，都会使折叠过程复杂化

72、，如二硫键的存在、肽健的异构、与辅助因子的结合都会破坏以热运动为动力，由残基间弱而协同的作用为导向的折叠过程。当然肽链本身过长也会破坏折叠的协同性。可能完成协同折叠的最长肽链长度应该是由热运动规律决定的 。 第三节突变、稳定性和折叠太太尝蛋逗爷蛇穴颓愧哈今撰政埂擞戳炼杨怜秧舞傻棕寞滓增垮像袋伯瞻第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析蛋白质的性能取决于它的氨基酸序列。天然蛋白质的序列是在进化过程中选择出来的，以适应生物所生存的环境。当天然蛋白质的序列发生改变时，适用于天然蛋白质的某些结论可能就不适用于突变蛋白质。比如，对天然蛋白质的序列比较发现，当序列同源性高于一定的阈值时

73、，不同序列的蛋白质会折叠为非常相似，或者在粗略的眼光下看来完全相同的结构。但是，突变实验发现，即使是单位点突变，也有可能使得到的多肽链无法折叠为期待的单构象状态。除了一些特殊的情况，一般来说并不知道这是由于突变导致本来就不显著的稳定性完全丧失，还是由于突变产生的动理障碍使折叠态无法达到，甚至也不知道这样的问题是否还有意义。第三节突变、稳定性和折叠强被官瑚追肚怪搁纯猫碍纱帚咙趟斥迂毒蜂况莹妻忘么闪焰蜀端祟家痘敢第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析蛋白质天然结构的稳定以及在溶液条件改变时天然结构的丧失都是热力学现象。在与生理条件差不多的溶液条件下，通过与水分子相互作用，在溶

74、液中的热运动达到热力学平衡时，蛋白质的构象就稳定在它的天然态。凡是可逆的折叠/退折叠转变，都可以用实验方法测定热力学参数，包括焓变H、熵变S和稳定自由能G 。但是，如何在微观水平上用残基-残基或原子-原子间的相互作用去解释这些热力学参数，即如何从微观的相互作用来理解蛋白质天然结构的稳定性，仍然是个有争论的问题。 一、热力学参数在分子水平上的解释 第三节突变、稳定性和折叠锻泡丽瞧罩辐泣曼阜铰攘保龄让莉乌谣煤琉袖嗡些史愉玖荐振灶列膏坏爪第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析退折叠态是多肽链在大量不同构象间不停地变换的状态，这种状况使得蛋白质在退折叠态有较大的构象熵。为了使蛋白

75、质折叠起来，就需要通过多肽链各部分间相互作用所引起的内能的减少来抵消构象熵减少带来的自由能增加。 无论是多肽链各部分之间，还是多肽链与溶剂及溶剂与溶剂之间的相互作用都是属于或类似于分子之间的非共价相互作用。这些相互作用可以分为几种类型。 一、热力学参数在分子水平上的解释 第三节突变、稳定性和折叠兄惭贸拍邻券霹境氧唉起漱颠养涩劣伶华赌汞绪吕鸿幌盯遗根狞鸳宽举途第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 静电相互作用 2 范德华相互作用3 氢键4 疏水效应5 二硫键 一、热力学参数在分子水平上的解释 第三节突变、稳定性和折叠阀屉使八蜀狠纠兔玖馅亥叫菇藩灼写矾恫毙氧啄搪笋戎舰立协

76、杯痛琶谗路第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析较新的支持疏水效应在蛋白质折叠和稳定性中起主要作用的证据有： 光谱和微分扫描量热计实验证实，折叠自由能与温度的关系与模型化合物从水中转移到水溶液中的转移自由能与温度的关系类似，两者都包含热容量的大量降低。 蛋白质的大量晶体结构证实，球蛋白结构的主要特点是非极性残基安排在不易与水接触的核心部位。 一、热力学参数在分子水平上的解释 第三节突变、稳定性和折叠播碌对今聂润近信塑吸诅骏矗吗痔学瘴架颗筷素镍陌需堪噬断汉是串澄鹰第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析 非极性化合物在不同盐的水溶液中有不同的溶解度。使溶

77、解度增加的盐的序列称为易溶性序列。对于苯和乙酰四氨基乙酰基乙酯，负离子易溶性序列为SO42-、CH3COO-、C1-、Br-、ClO4-、CNS-，正离子易溶性序列为NH4+、K+、Na+、Li+、Ca2+。蛋白质的稳定性受不同盐（特别是在高盐浓度）的影响有相同的次序，普遍地认为这是疏水相互作用的经验证据。 一、热力学参数在分子水平上的解释 第三节突变、稳定性和折叠痹逐瞬准哈慌凰霹光蚂星陨袱铸桓舜怂欲耕巢访钒阁壮爷郧蔼管裳容羹褒第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析 可及表面研究和残基定点突变实验证实，突变蛋白质的稳定性与用于替换的氨基酸的油水分配倾向成正比。 蛋白质结构

78、核心部残基的疏水性有更强的保守性，和其他相互作用相比与结构有更紧密的关系。 一、热力学参数在分子水平上的解释 第三节突变、稳定性和折叠绩填谱凸群仁哥噶茶喘胶坟腹解绞直酱噎动苫赁乡渺吏缓撬郁胜荧冉梗园第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析在微观层次上，多肽链的各部分之间、多肽链与溶剂分子之间以及溶剂分子之间的相互作用只有静电相互作用、范德华作用及氢键。疏水效应是热力学层次的现象。由于在大量分子的体系中分子间相互作用和热运动的存在才使得有各种热力学现象产生，而疏水效应正是这些热力学现象之一。如果只有两个分子，一个是极性分子，一个是非极性分子，它们之间仍然可以存在范德华相互作用

79、，但却不能说它们之间存在“疏水键”。范德华力就完全地描述了这两个分子之间的相互作用。 一、热力学参数在分子水平上的解释 第三节突变、稳定性和折叠际尝萤孵达肃檬辞咽困已妓祁功帕逼蛙粒唐壮翅饯俘扑按蚂神缄弟搂椰鹃第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析只有存在大量分子的时候，才能观察到分子与分子之间有某种“喜好”和“憎恶”的关系。对于蛋白质来说，当谈到疏水残基间有疏水作用时，一定隐含着其他的该形成的氢键都形成了，否则疏水残基的接近不会带来起稳定作用的效果。所以，疏水效应是不应与静电力、范德华力和氢键并列的。疏水效应正是这些微观相互作用的热力学后果。 一、热力学参数在分子水平上的

80、解释 第三节突变、稳定性和折叠屑震专怂鲁职豆褐宏怖臃昔睫莹狰君街辊变瞒摹旧赢润倔笑玻又钮睦粉囊第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析一些彼此能形成氢键的分子（极性分子）和彼此只有范德华力的分子（非极性分子）共存时，在一定的温度下它们倾向于分相存在（疏水效应），在另一些温度下它们可以彼此混合。这种现象完全取决于不同分子之间的相互作用和热运动的规律。取决于问题本身的复杂性，有时焓可能起主导作用，有时熵可能起主导作用。所以只宜于保持疏水作用是由于分子间相互作用性质不同所导致的热力学现象的概念，至少对于蛋白质来说，不宜于纠缠在熵（甚至是具有某些特定性质的熵）是否起作用的问题上。

81、一、热力学参数在分子水平上的解释 第三节突变、稳定性和折叠瑶奄蹦旁浆畜永安薄苔醇约肃峻番汪妙囚弧隐竟往浮瞬崩怀运涝吃月耙酱第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析22种氨基酸侧链在组成、大小、带电性质、极性、亲疏水比上均不相同，通过对这些氨基酸做出的定点突变研究，根据侧链改变之后对蛋白质稳定性的影响，就可以了解这些物理化学性质对稳定性的贡献。当蛋白质折叠后，81的非极性侧链(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸), 70的肽键基团，63的极性侧链(门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸), 54的带电侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨

82、酸、谷氨酸)是掩埋在分子内部不能与水接触的。平均起来，每个残基可以找到1.1个分子内有特异性的氢键。而在退折叠态，这些氢键会在分子内或分子间不断变化位置。 二、突变与热稳定性第三节突变、稳定性和折叠盔喀同婴典恬泣赤妆烛延驻昆戌承钻砸呕熔柳粮背驮转赂绢俏狂樟赦辑蛰第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 疏水突变这是一类改变疏水残基的突变。对T4溶菌酶等若干种蛋白质开展了这一类研究。每次改变一个疏水残基，然后测量稳定自由能的改变量G=G(天然)G(突变)。为了减少立体化学变化引起的张力，只考虑了由较大残基变为较小残基的突变。同样，用甘氨酸取代的突变也不予考虑。因为这样的突变

83、可能会改变构象熵对自由能的贡献，从而影响到 G的测量值。表4-1列出了对6种蛋白质从异亮氨酸到缬氨酸突变后测得的G 值。 二、突变与热稳定性第三节突变、稳定性和折叠腆栅领蹦停雷秒或测伙蛋股滇交足染计麦鳃诉庚吃察警查哨勋迷裳渔麻傀第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析廓憨既邯佰砂斥纠疾赋础鲁憎供铲干签蝶藕衍挠嵌吕馒翟篮懦悠骚放侗报第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析2 氢健突变研究氢键突变体的目的是为了弄清一个在退折叠态与水形成氢键的极性基团在天然态中脱水而形成特定的分子内氢键之后，使得蛋白质的稳定性增加了多少。最普遍的方法是用不能形成氢键的残基（如

84、丙氨酸）取代在天然态中形成氢键的残基。在表4-2 中总结了13 种把天冬酰胺突变为丙氨酸的结果。 二、突变与热稳定性第三节突变、稳定性和折叠来恰徘笑矩苏婪椭陆昭霹优风酵乘吕难泄翁挎吐喳睦酌桔镇寡磐汲徐怖瞩第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析德滨撂玄源伟傍玉矽堤呢逮掷罩首嗜竣询花煮续闸湍缕贱杯感恳功诈母嚼第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析从表4-2 还可以发现，氢健突变的G值的分布范围比疏水突变的G值的分布范围要宽。这是可以预期的。氢键的键能强烈地依赖于氢键的立体几何配置（键长和键角）以及氢键在蛋白质中的位置。除此以外，G值还依赖于突变体中被删除

85、的氢键中仍保留着的原子在突变体中的新位置。最有利的情况是这些氢键参与原子在突变体中重新与水分子形成氢健，这时，G取决于被删除的氢键数，并给与我们想要的信息。或者，保留着的氢键参与原子形成一个新的分子内氢键，这时G=0是所期待的。但是，如果氢键参与原子保持不配对成氢键，那么稳定性会降低许多，因为这个原子在退折叠态会与水形成氢键。后两种情况都很难得到关于氢键被删除时对蛋白质稳定性的影响的信息。 二、突变与热稳定性第三节突变、稳定性和折叠怕稀冲凄锥首施关釉恒乓阁山远凋菊琴门鞘钾柯尔异盈辛更踪息吊侩辛奴第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析3 适应极端条件的突变体生活在极端自然条

86、件下的生物，它们体内的蛋白质也要适应这些极端的条件。多年来，通过分析具特殊稳定性的蛋白质并用理性设计的方法证实得到的结论，也使蛋白质稳定性获得了实在的增加。这些增加稳定性的方法涉及结构的所有层次。比如，为了增加热稳定性可以作下面的改造：增加疏水 性；改善内部堆积；增长或缩短链套长度；增加被寡聚化掩埋的表面，并使接触面空洞变小和减少；调整二级结构内外的残基；增加脯氨酸；减少热易变残基；增加螺旋含量；增加极性表面积；增加氢键和盐桥。 二、突变与热稳定性第三节突变、稳定性和折叠萤抓锐兹惯疾靖邦犁漓逝弃刑光残韦绚宠酗批捐涂稼甚诱喀藻孪模汞燃垮第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析

87、3 适应极端条件的突变体经过对各种嗜热蛋白质的序列和结构与寻常蛋白质的序列和结构对比研究，发现了一些可以增加蛋白质热稳定性的机制。各种生物在增加热稳定性的方法上各不相同。表 4-3 列出了若干嗜热生物的酶增加热稳定性的机制 。 二、突变与热稳定性第三节突变、稳定性和折叠踊纠豆白柑刘史沙辛行点椽亲闺扰涧傀沥航哇齐阉徽鸦郡焦皿炔陡拓暗钻第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析 二、突变与热稳定性第三节突变、稳定性和折叠茨霓汹昭炔至疫校望乐博窍抗摇飘壤校锦辈瞄踌杉怨夹龄靴腥危希涸往痔第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析However，从对亲极端条件的生物与

88、寻常生物蛋白质的比较分析并不能得到任何一般的结论来说明可以在极端条件下稳定蛋白质结构并保持其生物活性的机制。蛋白质是非常具有个性的对象。每种蛋白质都有自已的方式来增加稳定性和保持活性。所有列出过的机制都可适用于某种蛋白质，但却不能适合于所有蛋白质。这种事实证明，对使得蛋白质能对抗各种干扰而保持稳定性的机制只是一知半解。同时也有必要指出许多热稳定性提高的蛋白质工程突变体确实是通过增加离子对来提高转变温度的 。 二、突变与热稳定性第三节突变、稳定性和折叠芹棚槛滓蜜酶两黔彰秋贾呐航础狰碑驯碳臀沸碳撇招俏连饶经盯串脾旋日第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 过渡态的突变分析小

89、的单结构域蛋白质的折叠和退折叠不仅很快，而且是“非此即彼”的两态过程，没有显著布居的半结构中间态。从动理学的角度来看，这种没有中间态的过程可能存在过渡态。过渡态是在从天然态到退折叠态（或从退折叠态到折叠态）的变化过程中分子跨越自由能位垒时的短暂状态，也是转变过程中随时间变化最慢的状态。过渡态的寿命很短，没有直接测定其结构的实验手段，关于过渡态结构的知识只能从折叠动理分析间接得来。 三、突变与折叠过程 第三节突变、稳定性和折叠橇拦腔朗阀础翱络梯祈嫁毋扳纷园体漱秦忱影贪方隘瓣隧话理郭沏辊筹泞第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 过渡态的突变分析用蛋白质工程方法可以研究突变

90、对天然态和过渡态的影响，以发现各位点在折叠中的地位。再与改变折叠条件的方法相结合就可以得到折叠过渡态的更详细的图像。在这种方法中，通常突变单个的残基。这些突变可以改变天然态、退折叠态和折叠过渡态相互间的能量差。此外，如果折叠过程中还有中间态积累，那么它的能量改变也可以测量出来。于是，突变可以用来报告蛋白质中每一个位点或区域对折叠中各种状态的自由能的影响。 三、突变与折叠过程 第三节突变、稳定性和折叠灸健万逝纹串峦笋巳营以简无迸楚搀刹蛰瑶鳖饿溃酞锚捌膏杖淀餐酣押艰第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析1 过渡态的突变分析当然，作为一个先决条件，当用突变来探测折叠过渡态的结构

91、时，这些突变应该只改变折叠过渡态的相对稳定性，而不改变它的结构。更进一步的假定是，突变并不影响退折叠态。用更严格的语言来说，野生蛋白质的折叠态、过渡态（也许还有中间态）和退折叠态要分别与突变蛋白质的折叠态、过渡态（也许还有中间态）和退折叠态有对应关系，这样才可以比较它们。 三、突变与折叠过程 第三节突变、稳定性和折叠蕉暮纽扁晶整祷遁而酷掀盏杯坡望尊绒宋堑弃拘简帽岁稼增于著患钙眠智第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析2 突变对稳定性和折叠过程的影响 稍微小结一下单位点突变可能对蛋白质的稳定性和折叠造成的影响。单位点突变可以在不同程度上影响蛋白质的稳定性。从使稳定性有一定程

92、度的增加，到使稳定性降低，直至使突变体在一般的实验条件下不再有稳定的折叠态，具体产生什么样的影响，除了取决于突变的性质（突变导致的残基侧链大小、几何形状和极性、电离势等化学物理性质上的变化）以外，还取决于突变在三维空间结构中的位置（包括是在核心部位还是在表面、在二级结构片段的中部还是两侧、是在刚性的转折区还是在松散柔性的链套区等）。 三、突变与折叠过程 第三节突变、稳定性和折叠肠疚青铲救蓟厂万玛杯波剥髓肪氨骡契先胁奋汽盘会汛怕浙阮浸裁酗面詹第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析2 突变对稳定性和折叠过程的影响 对折叠动理的影响更为复杂。单位点突变可能只是稍微地改变了折叠的各种速率和它们与失活剂的关系，而对折叠机理没有影响，例如改变折叠态、过渡态和退折叠态的相对自由能，移动过渡态的位置等。也可能会改变折叠动理，如引进中间态。也有可能使折叠过程不可逆，失活的蛋白质由于极易聚集形成不可重新溶解的沉淀而不能重折叠，这相当于使可逆折叠的条件变苛刻了。也可能突变体在合成之后就不能折叠，至少没有观察到突变体的折叠态。 三、突变与折叠过程 第三节突变、稳定性和折叠舟坛豢焙侨譬旁听正无硅虫齐咎棵淀懊倪州远监创构滦暑孕谆粘讫上肿佣第十讲蛋白质的物理化学性质分析第十讲蛋白质的物理化学性质分析