《医学免疫学：实验3-（ELISA）3节课》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医学免疫学：实验3-（ELISA）3节课（31页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Medical Immunology免疫标记技术（immunolabelling technique） Medical Immunology基于抗原-抗体反应的检测方法凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 Medical Immunology定义：用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测技术。特点：灵敏度高、快速、可定性、定量、定位，无需特殊设备；目前应用最为广泛免疫标记技术免疫标记技术 immunolabelling techniqueMedical Immunology4免疫免疫标记技术=抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异
2、性标记免疫技术的主要特点：标记免疫技术的主要特点：高特异性高特异性、高灵敏性高灵敏性免疫技术免疫技术+ +标记技术标记技术免疫标记技术免疫标记技术Medical Immunology5免疫标记技术免疫标记技术常见技术常见技术n免疫荧光技术免疫荧光技术n酶免疫技术酶免疫技术n免疫组化技术免疫组化技术n放射免疫技术放射免疫技术n免疫胶体金技术免疫胶体金技术n化学发光免疫技术化学发光免疫技术n免疫印迹免疫印迹Medical Immunology1、免疫荧光法、免疫荧光法 (immunofluorescence，IF)Medical Immunology免疫荧光实验免疫荧光实验Medical Immu
3、nology82、免疫组化技术、免疫组化技术 用标记的特异性抗体与组织或细胞抗原反应，借用标记的特异性抗体与组织或细胞抗原反应，借助形态学观察，进行组织或细胞抗原的定性、定量和助形态学观察，进行组织或细胞抗原的定性、定量和定位检测。定位检测。分类分类n酶免疫组化酶免疫组化n免疫金组化免疫金组化n免疫电镜免疫电镜n免疫荧光组化免疫荧光组化Medical Immunology9酶免疫组化酶免疫组化主要流程主要流程n切片、爬片或滴片制备切片、爬片或滴片制备n检测抗体孵育检测抗体孵育n酶标抗体孵育酶标抗体孵育n底物显色底物显色n复染复染n制片观察制片观察Medical Immunology免疫组化技术
4、免疫组化技术定位、定性、定量检测定位、定性、定量检测Medical Immunology特定蛋白（抗原）可作为抗原的物质有：可作为抗原的物质有： 酶、酶、 受体、受体、 抗体、抗体、 细胞外基质细胞外基质 激素、激素、 细胞结构蛋白、病原体。细胞结构蛋白、病原体。Medical Immunology3、放射免疫测定法、放射免疫测定法 (radioimmunoassay， RIA) 放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。兼有放射性核素的高灵敏度和抗原兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应抗体反应的特异性，检测灵敏度达的特异性，检测灵敏度达pg水平。水平
5、。常用核素为常用核素为125I和和131I，分液相和固相两种方，分液相和固相两种方法。法。常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等。等。 Medical Immunology134、免疫印迹、免疫印迹 将凝胶电泳和固相免疫结合的检测技术将凝胶电泳和固相免疫结合的检测技术主要流程主要流程n提取蛋白样品提取蛋白样品n凝胶电泳分离凝胶电泳分离n转膜转膜n检测抗体孵育检测抗体孵育n标记抗体孵育标记抗体孵育n加反应底物加反应底物n成像分析成像分析Medical Immunology免免
6、 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图显色显色加底物显色加底物显色加酶标记抗体加酶标记抗体（二抗）孵育，（二抗）孵育，洗涤洗涤封闭后洗涤，封闭后洗涤，加特异性抗体加特异性抗体（一抗）孵育，（一抗）孵育，洗涤。洗涤。Medical Immunology5、酶联免疫吸附试验enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) Medical Immunology酶联免疫吸附试验enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，借助洗涤将固相上的抗原-抗体复合物与液相中游
7、离成分分离。最常用的酶-辣根过氧化物酶（HRP）底物为邻苯二胺反应显橙黄色灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平Medical Immunology间接法-检测抗体Medical Immunology双抗体夹心法 Medical ImmunologyELISAELISA试剂盒：试剂盒：Medical Immunology实验三实验三 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验-人人IgG的测定的测定（enzyme linked immunosobent assay, ELISA）Medical Immunology基本原理双抗体夹心法主要用于检测未知双抗体夹心法主要用于检测未知抗原抗原，原理：将已知原理：
8、将已知抗体抗体吸附于固相载体上、洗涤后吸附于固相载体上、洗涤后加入加入待测抗原待测抗原溶液，然后洗涤去除未结合的抗溶液，然后洗涤去除未结合的抗原，加入原，加入酶标特异性抗体酶标特异性抗体，洗涤并加入酶作用，洗涤并加入酶作用底物底物使显色、终止反应再检测有色产物。检测使显色、终止反应再检测有色产物。检测的吸光度值和所测定的抗原在一定范围内呈线的吸光度值和所测定的抗原在一定范围内呈线性关系，利用此特点不仅可对未知抗原定性，性关系，利用此特点不仅可对未知抗原定性，还可定量检测。还可定量检测。Medical Immunology主要器材 自动酶联检测仪、洗板机、恒温水浴箱、微量自动酶联检测仪、洗板机、
9、恒温水浴箱、微量移液器、移液器、Tip头、废液缸、吸水纸若干、头、废液缸、吸水纸若干、96孔孔聚乙烯塑料反应板（每组聚乙烯塑料反应板（每组1条）。条）。Medical Immunology主要试剂1. 兔抗人兔抗人IgG抗体。抗体。2. 已知含量已知含量IgG参考蛋白。参考蛋白。3. 待检血清。待检血清。 4. 辣根过氧化物酶标记兔抗人辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体。抗体。5. 包被液：包被液：PH9.6的的0.05M碳酸盐缓冲液。碳酸盐缓冲液。6. 封闭液：含封闭液：含5%脱脂奶粉的包被液。脱脂奶粉的包被液。Medical Immunology主要试剂7. 待检标本及酶标抗体稀释液：待检
10、标本及酶标抗体稀释液：0.02M PBS-T加终浓度加终浓度0.1%的的BSA或或5小牛小牛血清。血清。8. 洗涤液：含去污剂洗涤液：含去污剂0.05吐温吐温20的的pH7.4的的0.15M磷酸盐缓冲液（防止非磷酸盐缓冲液（防止非特异性吸附）。特异性吸附）。9. 底物溶液：临用前新鲜配制，为邻苯二底物溶液：临用前新鲜配制，为邻苯二胺（胺（OPD） OPD-H2O2， 底物对光敏感，底物对光敏感，需避光并立即使用。需避光并立即使用。 10.终止液：终止液：2mol/L H2SO4。Medical Immunology实验步骤1.包被包被-已知抗体吸附于固相载体：已知抗体吸附于固相载体：包被液稀释
11、兔抗人包被液稀释兔抗人IgGIgG抗体至蛋白含抗体至蛋白含量量1-10g/ml1-10g/ml。反应板每孔加。反应板每孔加100l100l，置，置3737孵育孵育2h2h后后44过夜。过夜。2.洗涤洗涤- 倾去包被液，用洗涤液加满各孔，静置倾去包被液，用洗涤液加满各孔，静置3 min3 min，倾去，反复，倾去，反复3 3次。次。3.封闭封闭加封闭液，加封闭液， 3737孵育孵育60 min60 min，倾去，洗涤，倾去，洗涤3 3次。次。4.加样加样-加待测标本，同时作加待测标本，同时作空白、阴空白、阴/ /阳性对照：阳性对照： (1) (1) 稀释的稀释的IgG IgG 参考蛋白作阳性对照
12、，每孔参考蛋白作阳性对照，每孔100l100l，做双复孔（，做双复孔（1 1、2 2孔）。孔）。 (2) (2) 待检血清每孔待检血清每孔100l100l，做双复孔（，做双复孔（3 3、4 4孔）。孔）。 (3) (3) 阴性对照血清每孔阴性对照血清每孔100l100l，做双复孔（，做双复孔（5 5、6 6孔）。孔）。 (4) (4) 洗涤液每孔洗涤液每孔100l100l，做双复孔，作空白对照（，做双复孔，作空白对照（7 7、8 8孔）。加样后，孔）。加样后，9696孔板置孔板置3737孵育孵育1h1h。 1 2 3 4 5 6 7 8阳性对照阳性对照待检血清待检血清空白对照空白对照阴性对照阴
13、性对照 标记标记Medical Immunology实验步骤5、洗涤、洗涤3次次（同上）。（同上）。6. 加辣根过氧化物酶标记的抗人加辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体抗体（1 1：20002000）每）每孔孔100l100l。7. 37孵育孵育30min。8. 洗涤洗涤3次次（同上）。（同上）。9. 显色：加新鲜配制的底物溶液显色：加新鲜配制的底物溶液，每孔，每孔100l100l，在室温下，在室温下避光放置避光放置10-15min10-15min。10. 终止反应终止反应：每孔加：每孔加2mol/L H2mol/L H2 2S0S04 4 50l 50l。11. 结果判定结果判定酶标仪检测反
14、应物吸光值，分析结果：酶标仪检测反应物吸光值，分析结果： 以以酶标光度计酶标光度计450nm或或495nm滤光片测各孔滤光片测各孔OD值值。 1 2 3 4 5 6 7 8阳性对照阳性对照待检血清待检血清空白对照空白对照阴性对照阴性对照 标记标记Medical Immunology过程检测检测终止终止洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤E-Ab底物底物加样加样包被与洗涤包被与洗涤和封闭和封闭显色显色Medical Immunology阳性阳性待检待检阴性阴性空白空白包被抗体包被抗体+-抗原抗原+?-酶标抗体酶标抗体+-最终值最终值(OD1+OD2)/2-OD空白（均）空白（均）(OD4+OD5)/2-OD
15、空白（均）空白（均）(OD7+OD8)/2-OD空白（均）空白（均）(OD10+OD11)/2 1 2 3 4 5 6 7 8阳性对照阳性对照待检血清待检血清空白对照空白对照阴性对照阴性对照 标记标记Medical Immunology结果观察与分析 空白对照及阴性对照应无色或浅色阳性对照和阳性反应孔呈棕黄色结果判断 在阳性标本/阴性对照OD值的比值2.1的基 础上； 待检标本OD值/阴性对照OD值的比值2.1， 则判为阳性。Medical Immunology注意事项应将试剂加到孔板底部，避免加在孔壁；液体注意不要溅出，不可产生气泡；吸取不同试剂应更换枪头，以免交叉污染。Medical Immunology下一次实验酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）的后半部分）的后半部分
