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1、第四章 基因工程的主要技术与原理周毅峰2013.03核酸的提取与纯化核酸的提取与纯化核酸电泳核酸电泳分子杂交分子杂交PCR技术技术DNA序列分析序列分析大分子相互作用大分子相互作用1、核酸的提取与纯化、核酸的提取与纯化破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放材料准备材料准备核酸分离、纯化核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中2060bp1.1、基因组、基因组DNA的提取与纯化的提取与纯化DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂DNA钠盐比游离态更易溶于水钠盐比游离态更易溶于
2、水DNP在在0.14mol/LNaCl中的溶解度是水中的中的溶解度是水中的1%DNP在在1mol/LNaCl中的溶解度是水中的中的溶解度是水中的2倍倍生物材料的准备生物材料的准备新鲜，或者冻存的样品液氮中研磨加缓冲液EDTA螯合Mg2+、Ca2+SDS变性蛋白质-巯基乙醇、DTT打开二硫键和抗氧化PVP与酚和多糖结合及抗氧化裂解细胞裂解细胞除杂除杂加CTAB或SDS结合多糖和蛋白加酚仿去蛋白纯化与保存纯化与保存加乙醇或异丙醇沉淀加乙醇反洗涤吹干水或TE溶解20保存基因组基因组DNA的提取的提取-酚抽提法酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀血基因组血基因组DNA试剂盒试
3、剂盒酵母基因组酵母基因组DNA试剂盒试剂盒细菌基因组细菌基因组DNA试剂盒试剂盒细胞基因组细胞基因组DNA试剂盒试剂盒qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDSSDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例） 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白
4、变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物浓盐法：浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：核酸分离、纯化q蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。高盐可溶解多糖。用多
5、糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积体积)，氯苯可以与多糖的，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖羟基作用，从而去除多糖 。用用PEG8000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNA：在：在500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG8000 (含含1.2 M NaCl) ，冰浴冰浴20min。核酸分离、纯化q多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入
6、易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合核酸分离、纯化q盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤CTAB溶液配制好备用，65水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 65水浴一个小时 氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 ，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3
7、-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存 猕猴桃DNA提取实例qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入猕猴桃基因组猕猴桃基因组DNA闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；在变性后不会分离，复性快；原理1.2、碱裂解法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性染色体染色体线性线性DNA和或和
8、或有缺口有缺口的质粒的质粒DNA变性后双链分离，难以复性变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起；当复合物结合在一起；当K+取代取代Na+时时,生成不溶的生成不溶的PDS， 这些复合物从溶液中这些复合物从溶液中沉淀沉淀下来。下来。变性变性利用宿主菌线状染色体利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒与闭环双链质粒DNA的结构的结构状态的差异来提取质粒状态的差异来提取质粒DNA。当同时当同时碱变性碱变性时，时，线状线状基因组基因组DNA变性充分而质粒变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分
9、开。 当条件恢复时（当条件恢复时（酸中和酸中和），质粒），质粒DNA迅速准确配置重新迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。包盖。当当K+取代取代Na+时时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。在细胞碎片上一起被离心除去。 碱裂解法碱裂解法所用的试剂作用所用的试剂作用 葡萄糖葡萄糖增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防止DNA受机械力（震荡）的作用而受机械力（震荡
10、）的作用而降解。降解。 EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶酶的活性，防止的活性，防止DNA被酶降解。被酶降解。 NaOH-SDSNaOH：强碱，提供强碱，提供pH12的碱性条件，使的碱性条件，使DNA双链双链变性变性。SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白蛋白SDS”复合物复合物，使蛋白质（包括使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。冰醋酸把醋酸钾溶液的冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到调到4.8。用来中和用来中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的K+置换置换Na+，生成不溶的生成
11、不溶的PDS用于沉淀用于沉淀DNA。 乙醇乙醇DNA分子以水合状态分子以水合状态“溶于溶于”水里，乙醇能夺去水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。KAc-HAc缓冲液缓冲液 RNase A降解降解RNA渣滓。渣滓。以免提取后的以免提取后的DNA中含有小分子的中含有小分子的RNA。 TE缓冲液缓冲液DNA保存液。保存液。由由Tris-HCl和和EDTA配制。配制。 Tris-HCl维持溶液中维持溶液中pH值相对稳定；值相对稳定；EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，防止DNA被酶降解。被酶降解。蛋白变性剂，进一步抽提蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。溶液中的蛋白质
12、，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在但苯酚会残留在DNA溶液中。溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 酚酚-氯仿氯仿选用选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。碱抽提法提取质粒碱抽提法提取质粒DNA的步骤的步骤 Solution I 的配制：的配制：使用使用“溶液溶液”悬浮菌体。悬浮菌体。第一步：悬浮菌体第一步：悬浮菌体25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA溶液溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。变性。第二步：破膜，蛋白质和第二步：破膜，蛋白质和DNA变性变性Soluti
13、on II 的配制：的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS第三步：中和第三步：中和溶液溶液III使使DNA复性、并促使蛋白质复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体复合物和染色体DNA沉淀。沉淀。Solution III的配制：的配制：5M 乙酸钾（用冰醋酸调乙酸钾（用冰醋酸调pH至至4.8）上清液中含有闭合质粒上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。倍体积的乙醇。第五步：纯化第五步：纯化DNA上清液过柱或酚上清液过柱或酚-氯仿抽提。氯仿抽提。第六步：沉淀第六步：沉淀DNA材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的
14、最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要选时，要选择有核细胞（白细胞）择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否组培细胞培养时间不能过长，否则会造成则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少，含量较少，提取前先富集提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失体易污染，质粒易丢失
15、尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用拷贝或大质粒，则应加大菌体用量量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提
16、取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5分钟），分钟），否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有复性时间也不宜过长，否则会有基因组基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，
17、但动作氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕猕猴桃大提，猴桃大提，10000转转20min）针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），），有利于有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后应用沉淀后应
18、用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADN
19、A中残留有金属离中残留有金属离子子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）质（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）DNA提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。 原原因因对对策策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DN
20、ADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存
21、于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融DNA提取常见问题q问题二：问题二：DNADNA降解。降解。对对策策 原原因因1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PKPK的用
22、量）的用量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒DNA提取常见问题q问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。对对策策 原原因因1.2、RNA的提取与纯化的提取与纯化细胞RNA的含量每个细胞的每个细胞的RNA量约为量约为10-5g80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA液氮中研磨液氮中研磨加蛋白变性剂加蛋白变性剂去除去除DNA和蛋白和蛋白提供超低温抵制酶活性提供超低温抵制酶
23、活性异硫氰酸胍、异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠使蛋白和核酸分离十二烷基肌氨酸钠使蛋白和核酸分离异硫氰酸胍、异硫氰酸胍、-巯基乙醇抑制巯基乙醇抑制RNase活性活性LiCl2沉淀沉淀RNA酚仿或水饱和酚抽提酚仿或水饱和酚抽提DNA和蛋白，将和蛋白，将RNA留水相中留水相中乙醇洗涤杂质，乙醇或异丙醇沉淀乙醇洗涤杂质，乙醇或异丙醇沉淀RNA纯化和沉淀纯化和沉淀RNAq异硫氰酸胍异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 原理：原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；性，核酸释放；释放出来的释放出来的DNADNA和
24、和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而分别位于整个体下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNARNA。 步骤步骤: :材料准备：材料准备：尽量新鲜。尽量新鲜。器具准备：器具准备：0.1%DEPC0.1%DEPC处理处理2424小时，灭菌；小时，灭菌；裂解变性裂解变性：异硫氰酸胍异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌氨酸等）。月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARNA，有效抑制核酸酶。有
25、效抑制核酸酶。纯化分离：纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除杂物。氯仿可抽提去除杂物。洗涤：洗涤：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：异丙醇、无水乙醇。异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（乙酸钠（pH4.0pH4.0）：）：维持变性的细胞裂解液的维持变性的细胞裂解液的pHpH值，沉淀值，沉淀RNARNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA。影响影响RNA提取的因素提取的因素q 材料材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮如若材料来源困难，且实验需要一定的时间
26、间隔。可以先将材料贮存在存在TRIzolTRIzol或或样品贮存液中，于样品贮存液中，于7070或或2020保存保存如要多次提取，请分成多份保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，液氮长期保存，7070短期保存短期保存q 样品破碎及裂解样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：酵母和细菌：一般一般TRIzolTRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁酶或者机械方法破壁动植物组织：动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解
27、液裂解。期间动作快速，先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解样品量适当，保证充分裂解为减少为减少DNADNA污染，可适当加大裂解液的用量污染，可适当加大裂解液的用量q 纯化：纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiClLiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成造成 RNA RNA 降解；降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA R
28、NA 后续酶反后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素1.3 核酸的纯度与浓度鉴定核酸的纯度与浓度鉴定紫外分光光度法紫外分光光度法核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱可通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与降低均提示不纯 判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0纯纯DNA 比值比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染苯酚污染纯纯RNA
29、 比值比值2.0， Hairpin and Cross DimerDimer得到产物的机率，应大于50%PCR反应条件的选择反应条件的选择 温度与时间的设置温度与时间的设置 三温度点法三温度点法 双链双链DNA在在9095变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至快速升温至7075，在，在Taq DNA 聚合酶的聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸作用下，使引物链沿模板延伸 (标准反应标准反应) 二温度点法二温度点法 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用般采用94变
30、性，变性，65左右退火与延伸左右退火与延伸(此温度此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性酶仍有较高的催化活性)。 较短靶基因较短靶基因(长度为长度为100300bp)时时变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一失败的最主要原因。一般情况下，般情况下，9394 1min足以使模板足以使模板DNA变性，若低于变性，若低于93则则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变产物完全变性，就会导致性，就会导致PCR失败。失
31、败。 变性温度与时间变性温度与时间退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至温度快速冷却至4060，可使引物和模板发，可使引物和模板发生结合。由于模板生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于度。对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引物，的引物，5
32、5为选择为选择最适退火温度的起点较为理想。最适退火温度的起点较为理想。 退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值值(解链温度解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度复性温度=Tm值值-(510)在在Tm值允许范围内，值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一反应的特异性。复性时间一般为般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。，足以使引物与模板之间完全结合
33、。 Taq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子70 60核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子高于高于90时，时， DNA合成几乎不能进行。合成几乎不能进行。延伸温度与时间：延伸温度与时间： PCR反应的延伸温度一般选择在反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为之间，常用温度为72，过高，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般片段的长度而定，一般1Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间
34、片段，延伸时间1min是足够是足够 的。的。34kb的靶序列需的靶序列需34min；扩增；扩增10Kb需延伸至需延伸至15min。延伸进间过长会导致。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数决定循环次数决定PCR扩增程度。扩增程度。PCR循环次数主要取循环次数主要取决于模板决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在的浓度。一般的循环次数选在3040次之次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 循环次数循环次数PCR实验操作过程实验操作
35、过程PCR产物纯产物纯化化PCR产物纯化试剂盒产物纯化试剂盒PCR产物电产物电泳泳PCRPCR常见问题常见问题常见问题常见问题正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无原因：原因：该该Buffer对样品不合适对样品不合适引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低反应条件：退火温度太高，延伸时间太短反应条件：退火温度太高，延伸时间太短优化优化纯化模板或者使用试剂盒提取模板纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA更换更换Buffer或调整浓度或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）构）或者换
36、一管新引物或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间非特异性扩增非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带原因：1.引物特异性差引物特异性差2.酶纯度不高酶纯度不高3.Mg2+浓度偏高浓度偏高4.退火温度偏低退火温度偏低5.Buffer不合适不合适6.循环次数过多循环次数过多解决：1.重新设计引物或者使用巢式重新设计引物或者使用巢式PCR2.换用高纯度的酶换用高纯度的酶3.降低镁离子浓度降低镁离子浓度4.适当提高退火温度或使用二阶段温适当提高退火温度或使用二阶段温度法度法5.更换更换Buffer6.减
37、少循环次数减少循环次数 拖尾拖尾现象：产物在凝胶上呈现象：产物在凝胶上呈Smear状态状态原因：原因：1.1.酶量过多酶量过多2.2.模板不纯模板不纯3.3.循环次数过多循环次数过多4.4.dNTPdNTP、Mg2+Mg2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.BufferBuffer不合适不合适解决：解决：1.1.适量用酶适量用酶2.2.纯化模板纯化模板3.3.减少循环次数减少循环次数4.4.适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的和镁离子的浓度浓度5.5.适当提高退火温度适当提高退火温度6.6.更换更换BufferBuffer假阳性假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物空
38、白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。双脱氧法测序双脱氧法测序(Sangerdideoxyprocedure )5DNA序列的测定序列的测定(Sangerdideoxyprocedure )大规模测序的策略和测序技术的大规模测序的策略和测序技术的发展发展化学法测序化学法测序(Maxam-Gilbertprocedure) Frederick Sange
39、rDNA的合成过程中，在合成的的合成过程中，在合成的DNA链的链的3末端，依据碱基配对的原则，通末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的过生成新的3，5-磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的链合成终止，产生短的DNA链。产链。产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。链。5.1双脱氧法测序双脱氧法测序(Sangerdideoxyprocedure )双脱氧法测序双脱氧法测序原理原理双双脱脱氧氧法法测测序序基基本本过过程程自动测序电泳装置自动测序电泳装置An example of a portion of a chromatogram
40、 from automated sequencing Automatedsequencingisbasedonthedideoxymethodology,butfourdifferentfluorescentdye-labelledddNTPsareused.Thuseachfluorescentlabelcanbedetectedbyitscharacteristicspectrum.Theproductsareseparatedbyautomatedelectrophoresisandthebandsdetectedbyfluorescencespectroscopy.Sanger测序仪采
41、用测序仪采用96个毛细电泳管的阵个毛细电泳管的阵列，可以同时进行列，可以同时进行96个这样的测序反应，每个这样的测序反应，每个反应得到的个反应得到的Read长度可以达到长度可以达到1000bp以以上上 MEGABACE1000 DNA测序测序仪 多多道道移移液液器器96孔反应板孔反应板双脱氧法测序双脱氧法测序程序程序将待测基因序列打断成较将待测基因序列打断成较短重叠的短重叠的DNA片段群片段群DNA片段连入载体，在片段连入载体，在E.coli体内扩增，挑取单菌落，分离体内扩增，挑取单菌落，分离纯化重组载体测序纯化重组载体测序加入加入DNA聚合酶，聚合酶，dNTP以及带有荧以及带有荧光标记的双脱
42、氧核光标记的双脱氧核苷酸苷酸ddNTP凝胶电泳，检测标记过的核凝胶电泳，检测标记过的核苷酸片段的荧光信号。根据苷酸片段的荧光信号。根据重叠序列，通过软件处理，重叠序列，通过软件处理，DNA序列信息序列信息测序载体测序载体pUC：双链质粒载体，衍生的载体很多，不同商业公司有所：双链质粒载体，衍生的载体很多，不同商业公司有所不同，但基本均由不同，但基本均由pUC衍生而来，使用时需先变性衍生而来，使用时需先变性M13系列和系列和pUC系列的测序载体的使用避免了使用物理方法系列的测序载体的使用避免了使用物理方法分离大量的分离大量的DNAM13：单链噬菌体载体，目前很少采用：单链噬菌体载体，目前很少采用
43、测序测序DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段53的聚合酶活性，的聚合酶活性，35的外切酶活性的外切酶活性持续合成能力不强，不能复制富含二级结构的模板区持续合成能力不强，不能复制富含二级结构的模板区以以ddNTP为底物的能力远比在为底物的能力远比在dNTP低低易受易受DNA制备时经常产生的污染物的影响，且只对单链模板有效制备时经常产生的污染物的影响，且只对单链模板有效T7噬菌体聚合酶噬菌体聚合酶(测序酶测序酶)是一种经过修饰的是一种经过修饰的T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶，缺乏聚合酶，缺乏35外切酶活性外切酶活性能产生出非常漂亮的能产生出非常漂亮的DNA梯带，每条带都具有相似的
44、强度，可读的梯带，每条带都具有相似的强度，可读的DNA序列可覆盖凝胶的全长序列可覆盖凝胶的全长测序酶催化测序酶催化ddNTP结合的速率是结合的速率是dNTP的的33%具有具有1.0和和2.0两个版本，两个版本，2.0取代了取代了1.0，能对折叠成二级结构的模板起，能对折叠成二级结构的模板起作用作用测序酶测序酶526位氨基酸为位氨基酸为Tyr，若换成，若换成Phe，结合，结合ddNTP的能力下降的能力下降2000倍，将倍，将E.coliDNAPol或或TaqdnaPol类似氨基酸换面类似氨基酸换面Tyr其结其结合合ddNTP的能力提高的能力提高8000倍倍TaqDNA聚合酶聚合酶它在高温下（它在
45、高温下（70）进行终止链反应的能力可减少测序反应中由于模板）进行终止链反应的能力可减少测序反应中由于模板DNA上引物假结合位点与引物退火错配产生的相关问题上引物假结合位点与引物退火错配产生的相关问题在测序凝胶的放射自显影片上条带间的强度不同，从顶部到底部条带在测序凝胶的放射自显影片上条带间的强度不同，从顶部到底部条带逐渐减弱，出现阴影。逐渐减弱，出现阴影。可用于富含二级结构的模板可用于富含二级结构的模板催化催化ddNTP结合的与该区模板结合的与该区模板DNA序列的影响序列的影响TaqDNAPol和和PfuPol催化催化ddNTP结合的速率比结合结合的速率比结合dNTP的速率低的速率低两个数量级
46、两个数量级通用引物的使用避免了合成不同引物的麻烦通用引物的使用避免了合成不同引物的麻烦（M13正反向，正反向，T7，SP6等）等）M13Primers（TaKaRa公司）公司）M13Primer各引物位各引物位置图置图碱基序列：碱基序列：5-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3SP6PromoterPrimer形态形态 冻结干燥品。可用灭菌水或冻结干燥品。可用灭菌水或TE Buffer (pH 7.58.0) 溶解后使用溶解后使用用途用途 作为具有作为具有SP6 Promoter载体的测序用引物或载体的测序用引物或PCR用引物用引物 5.2化学法测序化学法测序(Maxam-Gi
47、lbertprocedure) 经经凝胶电泳凝胶电泳按大小分离和放射自显影后，根据按大小分离和放射自显影后，根据X光片所显现的相光片所显现的相应条带，直接读出待测应条带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序片段的核苷酸顺序是一个是一个DNA化学降解的过程，而不是生物合成过程化学降解的过程，而不是生物合成过程化学试剂处理具有化学试剂处理具有末端标记末端标记的的DNA片段，造成碱基的片段，造成碱基的特异性切割特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物链的反应混合物注意：只能标记一个碱基，多碱基标记会产生错误。注意：只能标记一个碱基，多碱基标记会产生错
48、误。 标记方式：标记方式： 羟基磷酸化反应羟基磷酸化反应 、 大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶I Klenow片段及片段及-32P dNTP标记标记 、 用末端转移酶标记用末端转移酶标记DNA片段的片段的3端端 G系统；系统； pH 8.0 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 G m7G C8N9断裂断裂 脱脱G A+G系统；系统；pH 2.0 哌啶甲酸（哌啶甲酸（pidine） 嘌呤环嘌呤环 N质子化质子化 脱嘌呤脱嘌呤C系统；系统；1.5 mol/L NaCl（高盐）（高盐） C + 肼（肼（hydrazine） 脱脱C T + C系统（非高盐条件）系统（非高盐条件） 肼肼(hydrazine) 打开嘧啶打
49、开嘧啶环环 重新重新5C环化环化脱嘧啶脱嘧啶化化学学降降解解法法测测序序基基本本过过程程生物信息分析生物信息分析普通的序列分析软件普通的序列分析软件 序列的拼装：序列的拼装： CAP（contig assembling programme） 同源性的比较：同源性的比较： BLAST ， ClustalW等。等。集成软件：如集成软件：如BioEdit等。等。 提供如少数序列的拼装，同源性的比较，开放阅读框的查提供如少数序列的拼装，同源性的比较，开放阅读框的查找，酶切位点的查找等功能。找，酶切位点的查找等功能。学会利用丰富的网上资源。学会利用丰富的网上资源。测序技术的发展测序技术的发展双脱氧末端终
50、止法双脱氧末端终止法(Sanger测序法测序法)1970s同位素标记，手工同位素标记，手工1980s荧光标记，自动荧光标记，自动1990s毛细管电泳毛细管电泳合成测序法（第二代测序）合成测序法（第二代测序）焦磷酸测序（焦磷酸测序（Pyrosequencing,Roche/454）合成测序（合成测序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）连接测序（连接测序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）单分子测序技术（第三代测序）单分子测序技术（第三代测序）HelicosPacificBiosciencesOxfordNanopore
51、158SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。 第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列现有的技术平台主要包括Roche/454 FLXIllumina/Solexa Genome AnalyzerApplied Biosystems SOLID system454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bpSolexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10
