实验11食品中游离氨基酸的测定

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1、实验十一：食品中游离氨基酸的测定实验十一：食品中游离氨基酸的测定 （茚三酮法）（茚三酮法）1实验原理实验原理 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生酮共热时，产生紫色紫色化合物，最大吸收波长在化合物，最大吸收波长在570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。酸含量成正比，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：2. 实验材料、仪器与试剂实验材

2、料、仪器与试剂材料：材料：酱油酱油仪器：仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。移液管，具塞刻度试管。试剂：试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。试剂配制：试剂配制：（P64）（1）2%茚三酮溶液茚三酮溶液（2）pH8.04的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液（3）氨基酸标准溶液：）氨基酸标准溶液：200g/mL异亮异亮氨酸标准溶液。氨酸标准溶液。3. 实验步骤实验步骤（1）样品的处理：）样品的处理：准确吸取准确吸取0.5mL酱油于酱油于100mL烧杯

3、中，加入烧杯中，加入5g活性炭和活性炭和50mL蒸馏蒸馏水，置于水，置于80水浴锅中，保持半小时后过滤，水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣清洗数遍，收集滤液于用蒸馏水将滤渣清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至刻线，摇匀备用。容量瓶中，定容至刻线，摇匀备用。（2）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制管号管号1234567氨基酸标准溶液氨基酸标准溶液/mL00.50.60.70.80.91.0水水/mL1.61.11.00.90.80.70.6磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液/mL0.40.40.40.40.40.40.4茚三酮茚三酮/mL0.40.40.40.40.40.40.4氨基酸含量氨

4、基酸含量/g0100120140160180200各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至，取出冷却至室温后加水至室温后加水至10mL刻度线，静置刻度线，静置15min后，在后，在570nm处测定吸光度，处测定吸光度，以以氨基酸含量氨基酸含量(g)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（3）样品测定）样品测定管号管号891011样品溶液样品溶液/mL00.50.50.5水水/mL1.61.11.11.1磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液/mL0.40.40.40.4茚三酮茚三酮/mL0.40.40.40.

5、4按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标准曲线上查出氨基酸含量微克数。定样品的吸光度，并在标准曲线上查出氨基酸含量微克数。4.结果计算结果计算式中：式中： C从标准曲线上查得的氨基酸含量，从标准曲线上查得的氨基酸含量，g K稀释倍数稀释倍数 V测定时取样量，测定时取样量，mL氨基酸（氨基酸（g/100mL）=CK V1061005. 注意事项注意事项（1）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在色，最大吸收波长在440nm处。处。（2）有颜色的样品必需经脱色处理至无色）有颜色的样品必需经脱色处理至无色后方可使用。后方可使用。