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1、第十八讲 免疫学检测技术的基本原理2免疫学检测方法免疫学检测方法 应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。3第一节 体外抗原抗体结合反应体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素的特点及影响因素一、抗原抗体反应的特点一、抗原抗体反应的特点1、抗原抗体结合的特异性特异性2、抗原抗体结合的可逆性可逆性3、适宜的抗原抗体浓度和比例浓度和比例4、抗原抗体反应的两个阶段两个阶段4抗原抗体结合的抗原抗体结合的特异性特异性抗原抗体结合的特异性由抗原表位与抗体分子中的超变区互补结合所决定。互补程度越高，特异性越强，亲和力越高。亲和力指抗体分子单一抗原结合部位与一个相应抗原表位
2、之间互补结合的强度。用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。5抗原抗体结合的抗原抗体结合的可逆性可逆性非共价键结合，易解离非共价键结合，易解离 范德华力 静电引力 氢键 疏水键解离后抗原和抗体仍具有原来的特性解离度取决于 抗体亲和力的大小 环境因素：如温度、pH等6适宜的适宜的抗原抗体抗原抗体浓度和比例浓度和比例免疫复合物中抗原和抗体的量肉眼可见肉眼可见肉眼不可见肉眼不可见7抗原抗体反应的阶段性与可见性（1）特异性结合阶段反应迅速一般不出现肉眼可见的反应（2）可见反应阶段小的Ag-Ab复合物形成较大复合物的过程易受温度、电解质和酸碱度等影响8二、抗原抗体反应的主要影响因素电解质温度
3、 37pH 6-89三、抗原、抗体的制备、抗原制备 颗粒性抗原：细胞性抗原 可溶性抗原、抗体制备 多克隆抗体 单克隆抗体10四、体液免疫检测技术、传统的血清学方法1.1.凝集反应凝集反应 (Agglutination)颗粒性抗原颗粒性抗原抗体 凝集可溶性抗原可溶性抗原相应抗体 不 凝集可溶性抗原无关载体抗体 凝集常用载体 RBC 聚苯乙烯乳胶 活性碳 胶体金11 凝集反应的类型直接凝集反应：玻片法试管法微量凝集法 12凝集反应的类型间接凝集反应： 132.2.沉淀反应沉淀反应Precipitation可溶性抗原相应抗体 沉淀物方法：1、单向琼脂扩散2、火箭电泳单向琼脂扩散电场3、双向琼脂扩散4
4、、对流免疫电泳双向琼脂 扩散电泳5、散射比浊散射比浊 （ 敏感、精确、自动化）6、速率散射比浊141516171819第二节第二节 免疫标记技术免疫标记技术Immunolabelling technique用酶、荧光素、同位素等物质标记抗体或抗原进行抗原抗体反应，检测抗原或抗体的技术。1 1、常用标记物质、常用标记物质： 酶：HRP、AP 荧光素：FITC、RB200 放射性同位素 胶体金 电子致密物质:2 2、用途、用途：免疫组织化学技术：用于 抗原定位（组织切片、 细胞涂片、活体定位），在细胞或亚细胞水平上观察鉴定抗原、抗体、受体等。免疫定量测定：用于液体标本中抗原或抗体含量的测定。20一
5、、免疫荧光技术、荧光素：1、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光） fluorescein isothiocyanate,FITC, 495nm2、罗丹明（红色荧光） Lissamine rhodamine B,RB200,3、R藻红蛋白 R-pheoerythin, R-PE、荧光显微镜21、常见免疫荧光技术的方法1.荧光抗体染色技术 直接荧光法 间接荧光法2.荧光免疫测定技术 时间分辩荧光免疫测定（time resoloved fluorescence immunoassay, TR-FIA）22Pemphigus vulgarisIntercellular IgGstaining2324二、免疫酶
6、标记技术Immunoenzymatic technique用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应，以底物被酶分解后的显色深浅来反应待检样品中抗原或抗体的含量。1、常用酶常用酶： 辣根过氧化物酶 （Horseradish peroxidase, HRP） 碱性磷酸酶 （Alkaline phosphatase, AKP）2.2.常用方法：常用方法： 免疫组织化学技术 酶联免疫吸附试验25、酶免疫组织化学技术Normal islet of LangerhanInsulitis - Pre type1 diabetesAlpha cells(Glucagon)Beta dells(Insulin)A
7、utoimmunity: Diabetes26 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验Enzyme Lined Immunasorbent Assay，ELISA原理：一种固相免疫酶技术 固相载体的种类： 聚苯乙烯板 聚苯乙烯小珠基本方法：、间接法、双抗体夹心法、抗原竞争法检测仪器2728三、放射免疫分析法三、放射免疫分析法Radioimmunoassay,RIA同位素分析的灵敏性 抗原抗体反应的特异性 优点： 灵敏度高 特异性强 精确性好 样品用量少 测定方法规范、自动化常用同位素： 125I、131I、 3H、14C、32P 29常用抗原抗体反应的相对敏感度 反应名称反应名称 敏感度敏感度 （/
8、L）血清蛋白电泳（区带电泳） 1000mg免疫电泳 50100mg单向免疫扩散 1020mg双向免疫扩散 10mg火箭电泳 5.0mg对流免疫电泳 1.0mg免疫比浊 1.0mg补体结合反应 10ug凝集反应 10ugELISA 10ugRIA 10ug30第三节第三节 免疫细胞及其功能检测免疫细胞及其功能检测一、免疫细胞的分离一、免疫细胞的分离选择性分离细胞的依据：选择性分离细胞的依据：细胞大小、密度、表面电荷、粘附能力、细胞吞噬能力、细胞膜上的特异性标志等；31、外周血中单个核细胞分离单个核细胞淋巴细胞单核细胞细胞分离液： Ficoll-hypaque密度梯度离心法 Percoll不连续密
9、度梯度法32、T、B淋巴细胞分离1、免疫磁性微珠分离法 （Immunomagnetic beads,IMB) 用包被用抗体或抗原的可磁化颗粒（Fe3O4 + 大分子材料）作为免疫反应的载体，快速高效的分离，无需离心沉淀分离技术；33、T、B淋巴细胞分离5、荧光激活细胞分离仪分离法 流式细胞术流式细胞术（Flow cytometry , FCM） 将光学流体力学、电子学和计算机等多种技术综合为一体， 对单个细胞进行快速、灵敏、多参数的定量测定，并进行综合分析的一项技术。 荧光激活细胞分离器（Fluorescence activated cell sorter, FACS ）34荧光激活细胞分离器
10、组成部分：气控单细胞层流系统激光光源系统光检测及信息处理系统细胞分离纯化系统35流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能36、淋巴细胞体外增殖试验1、淋巴细胞转化试验 形态学方法：淋巴母细胞计数 3H胸腺嘧啶核苷 掺入法 MTT检测法： 线粒体脱氢酶 四甲基偶氮唑蓝 蓝黑色甲潜 活细胞 （MTT） （formazan） 570nm测吸光值37、细胞毒性试验1、抗体依赖性细胞介导的细胞毒试验 （ADCC）2、NK细胞活性检测：靶细胞K562、YAC-13、细胞毒性T 细胞活性检测（CTL、LAK 、TIL） 检测方法：同位素释放法 Na51CrO4酶释放法（LDH）溶解百分率 （实验组CPM-自发释放组CPM） 100% （最大释放组CPM-自发释放组CPM）38抗原肽-MHC分子四聚体
