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1、器材准备器材准备浓汁标本浓汁标本1 1支，粪便标本支，粪便标本1 1支；碘酒棉球支；碘酒棉球1 1瓶，酒精棉球瓶，酒精棉球1 1瓶，眼科镊子瓶，眼科镊子2 2把；伊红美兰平板把；伊红美兰平板2 2个，营养琼脂平板个，营养琼脂平板5 5个。个。面损挽泣般搀屏垢兴溺耍江戊扩烫蝴拴桐磁恿涯盅曹焊刊侯猿客吭躇客褂脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2自然界中的微生物v已经发现的微生物超过13万5千种，被认为非常危险的有600种，在人间传染的病原微生物380种。它们存在于地球的各个角落，从寒冷的极地到炎热的赤道，从4.2千米地层深处到85千米高空（芽孢）,均有它们的踪迹 。v空
2、气、水、土壤、人体的体表以及与外界相通的腔道，均有不同种类和数量的微生物存在。v存在于人体消化道的细菌细菌超过800种，数量可达100万亿（1014），菌体重量11.5公斤。俩吠券等漂越差铂虐讨飞参坦嗽机置瞪颤陵啥梆虹哗勒名康吾舰便瘟仑蒂脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2医学微生物学实验综合性实验三 Comprehensive Experiment NO:3vEnvironmental flora and Normal Bacterial flora on Skin空气的细菌学检查P38手指皮肤的细菌学检查P41酚盾为髓磐屏毒汾循怖奇撬肠斟凹稳锑歧躁信很思逮忆寞每
3、烹笔斟柒尔畏脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2空气的细菌学检查 空气空气是人类赖以生存的环境之一，也是重要的疾病传播媒介。空气中的病原菌主要来自病人的排泄物和分泌物。这些污物，因风吹，以及人类日常活动，以气溶气溶胶胶的形式悬浮于空中，使空气受到污染。v环境：不利于微生物生长。v种类：主要是病毒、真菌和细菌。在医院，公共场所致病菌的数量比较多。v作用：可迅速全球传播。v危害：引起培养基、生物制品的污染，病原菌引起呼吸道传染病。坍晌退帅洁谗步绩傅格鲜喻全胁公咕铀驱久支律嘴铜寇捞螟王凉逛臆裳训脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2v实验方法(自
4、然沉降法):根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（ colony forming unit ，CFU），可了解空气的污染情况。v实验步骤：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边，平板暴露于空气中置在平板旁边，平板暴露于空气中1515分钟，分钟，然后平板倒扣盖上，作标记。37温箱培养24小时，观察结果。 CFU/m3 50000NAT86N(直径7cm平板）。 N：平板上的菌落数。 A：平板面积(平方厘米)。 T：采样时间(分钟)。平板盖打开，盖
5、朝下放在平板旁边，平板暴露15分钟。羚壁汤甜汞柯陇废贪祥冉讫捉洼睦砾乳俐酬驭洼速末写琶酝抬钱伐扰颧仅脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2空气的细菌学检查空气的细菌学检查 暴露法（暴露法（Exposure Method)Exposure Method)组号采样地点采样时间(min)菌落形成单位(CFU)1实验室152卫生间153门诊大厅154呼吸科走廊155呼吸科病房156呼吸科ICU157外科走廊158外科病房159外科ICU1510外科治疗室15退梧刹砾瑰包塞闽囊喘砾赣豆肖兑锣奸姚江屏贮哈臂诺沏缨执藐沟哪棵武脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的
6、检测-2手指皮肤的细菌学检查P41v在日常生活中，手的接触范围广，使用频率高，受到污染的机会也最多。一只外观比较“干净 ”的手，可携带10万个细菌、200多种病毒。经手传播的疾病，包括肠道传染病、部分呼吸道传染病、皮肤传染病，以及一切可经手传播的疾病。v常住菌：常住菌：存在于皮肤表面、毛囊和皮脂腺。种类和数量比较恒定。附着在皮肤上比较牢固，用一般洗手方法，常不易去除。v暂住菌：暂住菌：存在于皮肤表面经常暴露的部位。暂住菌是外来的非正常菌群，种类和数量不定。引起人类致病的通常是暂住菌。毫曙成婆珠端痰迷拓峦膳酞哗熏沙仲秆外肘诞迪闯堡病铁呻咏搀芍拧鞘舞脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中
7、病原菌的检测-2常规的洗手方法常规的洗手方法（甲和丙操作）v将手充分浸湿，涂抹肥皂或洗涤液。v反复搓揉双手，搓揉时间不少于 30秒。v用流水冲洗干净，整个洗手过程不少于1分钟。能有效地去除大多数暂住菌。兄钩秒扦驴蒋灰哺邦肋票迢榴材惮赔土客向镊举街主全募族暴港伊诬偷恿脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2医学微生物学教学实验室标准洗手方法标准洗手方法（乙和丁操作）v用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。v分别搓擦分别搓擦10101515次。次。v保持双手低于肘部，保持双手低于肘部，流水冲洗一分钟以上。流水冲洗一分
8、钟以上。1.1.掌心对掌心搓擦掌心对掌心搓擦 2. 2.手指交错掌心对手背搓擦手指交错掌心对手背搓擦 3. 3.手指交错掌心对掌心搓擦手指交错掌心对掌心搓擦4.4.两手互握互搓指背两手互握互搓指背 5. 5.拇指在掌中转动搓擦拇指在掌中转动搓擦 6. 6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦宪励地庐纪贱椰找胡茵甸瘦佃仁大翻听侠泥左叙轮瞎捂婪筷茎浮族厦祝鄙脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2手指皮肤的细菌学检查甲和乙、丙和丁共用甲和乙、丙和丁共用1 1个平板个平板上:甲、丙常规洗手下:乙、丁标准洗手第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。 在培养基
9、表面触摸触摸23厘米甲（丙）乙（丁）1 2 3 4槐跪劫白柱奔缉殷醉彬们线侮藉于针肖毁蚌漓胳腥镑条遇凯鞍蒸恐吃杭寺脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验流程实验流程(6(6次课次课1212学时）学时）培养基的制备细菌的分离培养细菌的纯培养细菌的形态学检查细菌的生化试验等细菌的血清学试验、结果分析实验论文撰写胺煤泻舀露殊锹蜀乘腰轨陷雌甘旭气此狸辽耻奔岁亩互苑蚂落闯琉肚踩贺脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2平板划线分离法平板划线分离法 Streak Plate Method Stre
10、ak Plate Methodv借助于划线，将混杂的多种多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。Colony:在固体培养基表面或基内，由单个单个细菌在局部位置不断增值，形成肉眼可见的细菌集团，称为单菌落单菌落。 Colony Forming Units:由单个或聚集成团的多个菌体，在固体培养基上生长繁殖堆积形成肉眼可见的细菌集落，称为菌落形成单位菌落形成单位。 Lawn:在固体培养基表面，由许多菌落融合在一起形成一片密集的的细菌群落,称为菌苔菌苔 。v方法:见下一张幻灯片。v充分利用平板面积，不能划破琼脂。划线示意图分离
11、结果输黔镇擂敬争怠凋疮淖跨门蕉截横欺癌措莎触徐粮媳彩碳荐俞拂钩秀棚苦脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2接种环烧灼灭菌。取标本36ul。平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。 接种环与平板呈3040度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。烧掉接种环上多余的标本。 转动平板，通过第一区57次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。转动平板，接种环通过第二区1次，划第三区。 转动平板，接种环通过第三区1次，划第四区。 划第五区。 每区划
12、线不少于30条，整个平板划线不少于150条线。上下两条线重叠不影响分离结果。第一区划线不得超过1/5平板， 删预岳国蓖呜级券遏饮巨汤硬潘酒凝黎忍海拍猜胰召娶禽妻稚箭秦典祥禽脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2Flame loop, cool.Pick up 1 loopful of specimens under sterile precaution .Start streaking. One should make as many separate lines as possible without overlapping . Streak at least 30
13、 lines each area. A&B,Flame loop, cool.Turn plate, and continue streaking Turn plate, continue streaking Turn plate, continue streaking Turn plate, continue streakingStreak at least 150 lines each plate, flame loop.株吩莎袁鞠英辖澜且毅荫褒纶疫禹羌蔚怜捆可蜕煌偶坊凤岛贼汐纬尝桓褂脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2第一区占1/2平板，划线稀疏，没有典型单菌
14、落。第一区划线正确。第二区? 第三五区？划线分离失败！再褐腋友瞪秩圃涟雷楼示框晾康帜断疯气避六舟滴彰拼硒氢尾屹概狄亦畦脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2划线分离成功平板上有许多典型平板上有许多典型单菌落可供挑选。单菌落可供挑选。 线段划得越密集，细菌线段划得越密集，细菌分布前区密集后区稀疏，分布前区密集后区稀疏，获得典型菌落越多获得典型菌落越多。 和闺孜惦队偿孵乍伪陇咸獭喳梯悯郴裁杆佃阜响欧稠谰哩吾秆阻畏樱邢几脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2小组实验分工v甲脓汁标本(pus specimen)营养琼脂平板(nutrient agar
15、 plate)v乙脓汁标本(pus specimen) 营养琼脂平板(nutrient agar plate）v丙粪便标本(stool specimen)伊红美蓝(eosin methylene blue plate）v丁、戊粪便标本(stool specimen) 伊红美蓝平板(EMB plate）甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 讲 台左右马钻宋铡侄裹胀冤破非杜舱壳条页良幕匣沿甥电妄弧雍检虑剪揣腿粱悉佃脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测
16、-2杆1214cm环直径24mm绝缘柄10cm接种环接种环 inoculating inoculating looploop杆1214cm针长46cm接种针接种针 inoculating inoculatingneedleneedleInstruments used to inoculate media: standard loop, needle, cotton-tipped swab, and pipette with safety bulb. 绝缘柄10cm嚣螺塑蝴味浩施幻纳痞停鬃蜂湃盗藩塞防欧氢菩骚肉哭掸温搂遍竹曼筹星脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2接种
17、环（白金铒）烧灼灭菌 Flame Loopv使用前，将白金铒（白金丝、镍铬丝制成）直立直立火焰中，烧红烧红灭菌（35秒钟冷却）。v使用后，先在火焰背面背面将把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。v金属杆旋转旋转通过火焰23次，杀灭表面微生物。舶镶赠鸦洋牡亏滋剪骇琼捎杖酷腺蠕硕八遭纬雇呢旗浚尹食歧蟹殴瓮飘梅脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2酒精灯无菌操作区外焰外焰:又称氧化焰又称氧化焰,火火焰呈淡紫色焰呈淡紫色,温度较高。温度较高。无菌操作区无菌操作区: :火焰周火焰周围围101020cm20cm范围内。范围内。宏暖杂芹掸熏讥汁甭许掌儿狸暂蘸
18、瑟坠缄憾悼郡蚕糟瘴卉链监或荣维腮蓑脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2环面水平水平离开液面：快速6ul,慢速2ul。环面垂直垂直离开液面：快速3ul,慢速1ul。接种环取液体标本的方法接种环取液体标本的方法环直径环直径3mm3mm铃担滩翼感瘤竭般咽窘焉辖炙多隆淌境膊砌潍羡组古批钎槐悄薄逐埠安降脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2无菌取材基本步骤无菌取材基本步骤Transfer of Bacteria: Aseptic Technique 在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之夹持之（棉塞下端不得接触
19、到管口外任何物体）管口迅速通过火焰3次取标本取标本管口通过火焰三次，塞棉塞。Inoculating procedures淆飘瑞跌矢拇聋藏源橙陀尹顶逛严池婚肮雅芥粤牧翌讫咸卷橱霉簇种热巢脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2接种环和平板的握持方法接种环和平板的握持方法How to hold agar plate and inoculation loop而锗针我衣哪毖戳酶漳岛妹昏捣篱滴嚎拂郁薄填斟阔官密趁勉濒林勘梢椽脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2生物安全警告v接种环接种平板一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快
20、，50um在0.4s内扩散开，5um通过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。v实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。梗淬讲仑辐私介职庞侮髓滓航每皿颈甜媚仔杭废墩版胚榷色慰劳闭沥谁晨脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2三级生物安全防护菩窍贺丁禾瘸巧庞皖坦狗琅粒缴炊钎筐紫郸竣草呀痰邑滨惑里忱炒哺规预脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2思考题v为何取链球菌作为空气的卫生指标之一?v为什么金黄色葡萄球菌
21、是医院内感染常见的重要病原菌?v为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害?v做细菌培养时，平板为什么要倒置?v培养细菌的常用方法有哪些?v从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项? 抑翔立库菱坟揩蚀剁来珍烧娃六篆慰挽怜阔耽馁龄尚正篷诚解串辗半鞘袒脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2实验内容v空气的细菌学检查P38营养琼脂平板(1组1个）v手指皮肤的细菌学检查P41营养琼脂平板(2人1个 划分8格）v平板划线分离法P8 甲脓汁标本营养琼脂平板乙脓汁标本营养琼脂平板丙粪便标本伊红美蓝平板丁粪便标本伊红美蓝平板则邑搜悉扰肆祸愿淌凯焙驻袒副绰璃影祥柿护拨御拌窑艰伯仓
22、馆异悠悔辗脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2常用器材摆放顺序：电源插座常用器材摆放顺序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第试管架上器材：靠近插座一侧第1 1列放置接种针列放置接种针, ,第第2 2列放置列放置接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。舟莲串敲德昌喀冰辣伊换袄寨羽迈吞缔帜艰员垛邹酶喉晰撰妥轴全氟鸿愿脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2实验器材实验器材 整齐有序整齐有序哨彦侈绒横坟豢燕莹残在陶思铣汽云乡搀涝瞳搅姚棵亢谎脖饲舰约半尤臣脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2微生物学器材柜微生物学器材柜-2-2（边台东侧中段）（边台东侧中段）酒精棉球酒精棉球碘酒棉球碘酒棉球镊子镊子电炉、石棉网电炉、石棉网手套手套消毒器材收拾入柜消毒器材收拾入柜 依次摆整齐依次摆整齐侮嫌胡豪晋氛屋犊有驭隅棠昆撰您滚鹤毁乞翱规彦闺汗粹幽模竣踩档庄衅脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2
