《生物化学：动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学：动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、动物基因组动物基因组DNA、总、总RNA的提取及含量测定的提取及含量测定生物化学实验生物化学实验II目的要求目的要求l学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术；技术；l了解提取了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点；的几种方法，原理和优缺点；l学习测定学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。含量的基本原理及具体方法。理论基础理论基础l核酸核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；l按化学组成可以将核酸分成两大类：按化学组成
2、可以将核酸分成两大类： 含脱氧核糖核酸（含脱氧核糖核酸（DNA）；）； 含核糖核酸（含核糖核酸（RNA）；）；在生物体中核酸以结合成在生物体中核酸以结合成核蛋白核蛋白的形式存的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化物理、化学因素学因素和和酶酶的作用下都很易降解。的作用下都很易降解。l核酸的分布：细胞核、线粒体、叶绿体、核核酸的分布：细胞核、线粒体、叶绿体、核糖体、游离。糖体、游离。核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则在生物体中核酸以结合成在生物体中核酸以结合成核蛋白核蛋白的形式存在，但核的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因
3、素物理、化学因素和和酶酶的作的作用下都很易降解。用下都很易降解。l保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性意义：意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式形式以及和其他生物大分子结合的方式。l排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染；l无杂核酸分子的污染（如纯化无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除分子时应去除RNA分子）。分子）。核酸的测定方法核酸的测定方法l核酸是由糖（核糖和脱氧核糖）、磷酸以及含氮碱基（嘌呤
4、、嘧啶）核酸是由糖（核糖和脱氧核糖）、磷酸以及含氮碱基（嘌呤、嘧啶）所组成的。测定核酸制品中的糖、磷、氮的含量即可计算出核酸的所组成的。测定核酸制品中的糖、磷、氮的含量即可计算出核酸的含量及纯度。含量及纯度。l糖：糖：地衣酚法，二苯胺法地衣酚法，二苯胺法l磷酸：磷酸：钼蓝反应钼蓝反应l碱基：碱基：微量凯氏定氮法，紫外吸收法，热变性法（微量凯氏定氮法，紫外吸收法，热变性法（GC含量测定），含量测定），HPLC法。法。l地衣酚地衣酚(orcinol)，又称又称“3，5-二羟基甲苯二羟基甲苯”、“5-甲基间苯二酚甲基间苯二酚”、“苔黑酚苔黑酚”。化学式。化学式C7H8O2.H2O。l原理：原理：当当
5、RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛糠醛，后者与地衣酚反应，在后者与地衣酚反应，在Fe3+或或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，处有最大吸收峰，RNA浓度在浓度在20200g/mL范围内，光吸收与范围内，光吸收与RNA浓度成正比。浓度成正比。干扰：干扰：与与戊糖戊糖均有反应，均有反应，DNA及其它及其它干扰物也能给出类似颜色，故测定前干扰物也能给出类似颜色，故测定前尽量去除。尽量去除。地衣酚试剂要使用前配制。地衣酚试剂要使用前配制。地衣酚地衣酚法测定法测定RNA
6、含量含量（本次试验）（本次试验）RNA含量测定含量测定 管号试剂 123456789RNA标准溶液（100ug/ml）00.61.21.82.43.0000蒸馏水3.02.41.81.20.602.92.82.7地衣酚试剂3.03.03.03.03.03.03.03.03.0RNA待测液0.10.20.3摇匀，100摄氏度水浴保温25min，670nm处测量OD值OD670RNA含量（ug）060120180240300二苯胺法二苯胺法测定测定DNA含量含量-本实验本实验l原理：原理：DNA分子中的分子中的2-脱氧核糖在酸性环境中变成脱氧核糖在酸性环境中变成-羟基羟基-酮基戊醛酮基戊醛，与二苯
7、胺试，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（剂作用生成蓝色化合物（max=595nm）。）。DNA在在40400微克范围内，光吸收值微克范围内，光吸收值与与DNA的浓度成正比。的浓度成正比。乙醛可增加二苯胺法测定乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。显著提高测定的灵敏度。样品中含有少量样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能
8、干扰DNA定理。定理。DNA含量测定含量测定l1、DNA标准曲线的制定标准曲线的制定6支试管，依次加入支试管，依次加入0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6和和2.0mLDNA标准标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为溶液。添加蒸馏水，使之都成为2mL。然后各加入。然后各加入4mL二苯胺试剂，二苯胺试剂，混匀。于混匀。于60恒温水浴中保温恒温水浴中保温1h，冷却后于，冷却后于595nm处进行比色测定。处进行比色测定。以以DNA量量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。l2、制品的测定、制品的测定取取2支试管，各加支试管，各加0.3ml、0.6ml待测
9、液，加水至待测液，加水至2mL（内含（内含DNA应应在标准曲线的可范围之内）和在标准曲线的可范围之内）和4mL二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。准曲线的制作。l3、根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量的含量. 管号试剂 123456789DNA标准溶液（200ug/ml）00.40.81.01.21.62.000蒸馏水2.01.61.21.00.80.401.71.4二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.0DNA待测液00000000.30.6摇匀
10、，60摄氏度水浴保温60min，595nm处测量OD值OD595DNA含量（ug）080160200240320400DNA含量测定含量测定磷的测定磷的测定-钼蓝反应钼蓝反应lRNA含磷质量分数为9.0%；DNA含磷质量分数为9.2%，故测得磷的量，即可求得核酸量。 l生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。 原理：原理：无机磷在酸性条件下，与钼酸盐（常用钼酸铵或钼酸钠）反应生成磷钼酸盐络合物。用还原剂
11、处理，磷钼酸盐络合物被还原生成钼蓝，在660nm处有最大光吸收峰。在一定浓度范围内，颜色的深浅与磷含量成正比关系。紫外吸收法测定核酸的含量及纯度紫外吸收法测定核酸的含量及纯度l嘌呤和嘧啶环的共轭双键系统决定了其具有吸收紫外光的特性，其吸收峰为260 nmlDNA: 0.020 ug-1mllRNA: 0.022 ug-1mlDNA: 260/280=1.8RNA: 260/280=2.0l260/280比值与pH有关，在酸性条件下，比值降低0.2-0.3，碱性条件下，增加0.2-0.3l与碱基的组成相关。将样品配制成含将样品配制成含5 50g/mL核酸的溶液，于紫外分光光度计核酸的溶液，于紫外
12、分光光度计上测定上测定260nm吸收值（使用吸收值（使用石英比色杯石英比色杯），计算核酸浓度：），计算核酸浓度：核酸浓度（核酸浓度（g/mL）=式中：式中：O.D260为为260nm波长处吸收值；波长处吸收值；L为比色杯的厚度；为比色杯的厚度；E260nm为每毫升溶液内含为每毫升溶液内含1微克核酸的光吸收值，微克核酸的光吸收值，DNA为为0.020，RNA为为0.022；上述样品于上述样品于于紫外分光光度于紫外分光光度计上上测定定280nm吸收吸收值。核酸核酸纯度：度：O.D260/O.D280稀释倍数稀释倍数紫外吸收法测定核酸浓度与纯度紫外吸收法测定核酸浓度与纯度-选作选作DNA碱基比例的测
13、定碱基比例的测定-测测“GC比比” (G+C ) mol% = （G+C ）/（A+T+ G+C ） 100% 分类学上，用分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数占全部碱基的克分子百分数来表示各类生物的来表示各类生物的DNA碱基组成特征。碱基组成特征。 DNA碱基组成是各种生物的一个稳定特征，即使碱基组成是各种生物的一个稳定特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。l热变性法热变性法l浮力密度法浮力密度法l高效液相色谱法高效液相色谱法注意：注意：l在在低温低温下进行操作；下进行操作；l减少物理因素对核酸的减少物理因素对核酸的机械剪切力机械
14、剪切力；l防止过酸、过碱引起核酸降解，控制防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值值范围（范围（pH值值5-9），），并要保持一定并要保持一定离子强度离子强度；l防止核酸的生物降解；防止核酸的生物降解；细胞内或外来的各种细胞内或外来的各种核酸酶核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌高温灭菌，提，提取缓冲液中需加取缓冲液中需加核酸酶抑制剂，核酸酶抑制剂，如柠檬酸盐、氟化物、乙二胺四如柠檬酸盐、氟化物、乙二胺四乙酸盐（乙酸盐（EDTA）。）。进行核酸分离时最好进行核酸分离时最好新鲜
15、新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70冰箱中。冰箱中。1、RNA的提取与测定的提取与测定lRNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。l常见方法（依据常见方法（依据RNA的种类和来源）：的种类和来源）： 苯酚法（实验室最常用的方法）苯酚法（实验室最常用的方法）去污剂法去污剂法 盐酸胍法盐酸胍法l苯酚法：苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即即溶于上层溶于上层被苯酚饱被苯酚饱和的水相中，和的水相中，DN
16、A和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后，和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。即以白色絮状沉淀析出。优点：优点：较好除去较好除去DNA和蛋白质，且获得和蛋白质，且获得生物活性生物活性的的RNA。工业提取工业提取RNA的方法的方法l酵母细胞富含酵母细胞富含RNA，是工业上提取，是工业上提取RNA的主要原料。的主要原料。l工业上制备工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的多选用低成本、适于大规模操作的浓盐法浓盐法或稀碱法或稀碱法。这两种方法所提取的核酸均为变性的。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主，主要用作制备要用作制备单核苷酸单核苷酸的原料，其工
17、艺较简单。的原料，其工艺较简单。l浓浓盐盐法法：使使用用 10氯氯化化钠钠的的溶溶液液，同同时时在在 90摄摄氏氏度度热热处处理理3-4小小时时，以以改改变变细细胞胞壁壁的的通通透透性性，使使核核酸酸从从细细胞胞内内释释放放出出来来。经经冷冷却却，离离心心后后上上清清液液用用乙乙醇醇沉沉淀淀 RNA。l稀碱法：使用稀碱法：使用0.2氢氧化钠裂解氢氧化钠裂解酵母酵母，然后用酸中和，然后用酸中和，除去蛋白和菌体，上清液用乙醇沉淀除去蛋白和菌体，上清液用乙醇沉淀RNA，或调体系，或调体系pH值至值至RNA的等电点的等电点PI2.5，沉淀目的样品。，沉淀目的样品。工业提取工业提取RNA的方法的方法l原
18、理：原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于可溶于水或浓盐溶液（如水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠氯化钠盐盐溶液中溶解度溶液中溶解度最低最低，而核酸核蛋白，而核酸核蛋白（RNP）则在则在0.14mol/L氯氯化钠中溶解度化钠中溶解度最大最大，利用这一性质可将其分开。，利用这一性质可将其分开。l方法：方法：先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用0.14mol/L氯化钠溶液把细胞中的氯化钠溶液把细胞中的RNP提取出来，最后用酚提取出来，最后用酚将将RNA和蛋白质分
19、开和蛋白质分开。本实验提取本实验提取RNA的原理及方法的原理及方法RNA提取提取l匀浆：匀浆：称取（称取（3克？）牛肝剪碎，加克？）牛肝剪碎，加20mL0.14mol/L氯化钠溶液氯化钠溶液10000r/min左右匀浆左右匀浆1分钟左右；分钟左右；l离心：离心：匀浆后匀浆后4摄氏度下，溶液离心摄氏度下，溶液离心8000r/min（RCF？）？）离心离心7分钟，量分钟，量取上清液（体积？），沉淀物留做提取取上清液（体积？），沉淀物留做提取DNA（质量？）；（质量？）；l除杂质：除杂质：于上清液中加入等体积于上清液中加入等体积80苯酚苯酚溶液溶液（操作注意）（操作注意），搅拌充分混合，搅拌充分混合
20、10-15分钟，置冰箱分钟，置冰箱冷却冷却静止静止10-15分钟，离心取含有分钟，离心取含有RNA上层水相（颜色？），上层水相（颜色？），弃下层酚相（颜色？）弃下层酚相（颜色？）（操作注意）（操作注意）；l沉淀沉淀RNA：取上层水相含取上层水相含RNA溶液（体积？），加入溶液（体积？），加入2倍体积倍体积95冷乙醇，冷乙醇，搅拌搅拌（操作注意）（操作注意），充分混合，置冰箱中冷却，充分混合，置冰箱中冷却(约约10-15分钟分钟)，至出现白色絮状，至出现白色絮状物物RNA，8000r/min离心离心7分钟，取沉淀物；分钟，取沉淀物；l溶解：溶解：用少量去离子水（约用少量去离子水（约2毫升）溶解沉
21、淀物，用以测定其含量。毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。试剂和器材试剂和器材l材料：牛肝材料：牛肝l试剂：试剂：0.14mol/L氯化钠氯化钠标准标准RNA溶液：溶液：100g/mL地衣酚（地衣酚（3,5-二羟基甲苯）试剂二羟基甲苯）试剂（现用现配）（现用现配）80苯酚溶液苯酚溶液95乙醇乙醇l器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等思考题思考题vRNA提取方法有几种？有什么优缺点？提取方法有几种？有什么优缺点？vRNA提取过程中应注意什么？提取过程中应注意什么？DNA的提取及含量测定的提取及含量测定在在动动植植物物中中，小小牛牛胸胸
22、腺腺、动动物物肝肝脏脏、鱼鱼类类精精子子，植植物物种种子子的的胚中都含有丰富的胚中都含有丰富的DNA；微微生生物物中中，面面包包酵酵母母含含4%，啤啤酒酒酵酵母母含含6%，大大肠肠肝肝菌菌含含9%10%。本本实实验验：将将沉沉淀淀物物溶溶解解于于生生理理盐盐水水，加加入入去去污污剂剂十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠（SDS）溶溶液液，使使DNA与与蛋蛋白白质质分分离离开开。加加入入固固体体氯氯化化钠钠使使其其浓浓度度达达到到1mol/L，使使DNA溶溶解解。加加氯氯仿仿-异异戊戊醇醇去去除除蛋蛋白白质质，也也可可重重复复该该步步操操作作得得较较纯纯DNA。最最后后用用95%乙乙醇醇沉沉淀淀DNA。
23、去除蛋白的常用方法去除蛋白的常用方法l变性剂法：变性剂法：用用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取生物材料中提取DNA；l苯酚法：苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的缓和，可以得到较好的DNA制品；制品；l氯仿法：氯仿法：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将在上层水相，用
24、乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来。沉淀出来。DNA的提取的提取l溶解：溶解：将离心后除去将离心后除去RNA的沉淀的沉淀(质量？质量？)，用，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加一次。加4毫升毫升10SDS溶液溶液，使溶液的，使溶液的SDS浓度达到浓度达到1左右，边加边搅拌左右，边加边搅拌(溶液变得粘稠并略透明)，放置，放置60水浴保温水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠（质量（质量?），使溶液氯化钠浓度达到），使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌，充分搅拌10分钟（体积？）；分钟（体积？）；l除杂质
25、：除杂质：加等体积加等体积氯仿氯仿-异戊醇异戊醇混合液，充分震荡混合液，充分震荡10分钟分钟，8000r/min离心离心7分钟，分钟，取取上层上层液量好体积，倒入烧杯中（液量好体积，倒入烧杯中（离心管离心管）（现象？），加同体积的氯仿）（现象？），加同体积的氯仿-异戊醇混异戊醇混合液，合液，重复上次操作重复上次操作（现象？）。直至界面不出现蛋白凝胶为止；（现象？）。直至界面不出现蛋白凝胶为止；l沉淀：沉淀：准确量取上清液体积，准确量取上清液体积，(1/10体积体积3mol/LNaAC溶液溶液),加加2倍体积倍体积95冷乙醇，冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止搅拌后，置冰箱静止冷却冷却，待有白色丝状物出
26、现，约，待有白色丝状物出现，约10-15分钟分钟，离心，离心8000r/min离离心心7分钟，得白色沉淀（质量？）；分钟，得白色沉淀（质量？）；l溶解：溶解：将沉淀物用将沉淀物用0.1mol/LNaOH约约10毫升溶解。毫升溶解。试剂和器材试剂和器材l试剂：试剂：生理盐水生理盐水10SDS氯化钠氯化钠95乙醇乙醇氯仿氯仿-异戊醇混合液异戊醇混合液DNA标准溶液：用标准溶液：用0.01mol/LNaOH配成配成200g/mL溶液溶液二苯胺试剂（现用现配）二苯胺试剂（现用现配）l器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等思考题思考题l二苯胺法测定二苯胺法测定DNA，为
27、什么加乙醛，作用是什么？，为什么加乙醛，作用是什么？l除杂质常用那些方法？除杂质常用那些方法？lDNA浓度测定与浓度测定与RNA浓度测定实验中，核酸样品分浓度测定实验中，核酸样品分别用什么溶解？显色反应时，标准曲线组各样品的别用什么溶解？显色反应时，标准曲线组各样品的pH值是否相同？值是否相同？l按照实验操作流程图，说明每一步操作的实验目的、按照实验操作流程图，说明每一步操作的实验目的、现象、原理和进一步操作的依据。现象、原理和进一步操作的依据。工工艺艺图图3g肝脏肝脏+20mL0.14mol/L氯化钠氯化钠匀浆匀浆,1min离心离心8000r/min,7min等体积等体积80苯酚苯酚搅拌搅拌
28、10-20min，冰箱静置，冰箱静置30min8000rn/min，7min上清上清RNA、多糖、多糖沉淀沉淀DNA、蛋白、蛋白加加2 2倍体积倍体积9595冷乙醇冷乙醇冰箱至出现白色沉淀冰箱至出现白色沉淀离心离心沉沉淀淀离心离心冰箱至出现白色沉淀冰箱至出现白色沉淀加加2倍体积倍体积95冷乙醇冷乙醇等体积氯仿等体积氯仿/异戊醇，震荡异戊醇，震荡10min/离心离心加氯化钠至加氯化钠至1mol/L，搅拌，搅拌10min4ml10SDS，60，10min30ml生理盐水溶解生理盐水溶解上上清清DNARNA注意事项RNA最终用2ml去离子水溶解，加样量不变；DNA测定，加样量改为0.3ml、0.6m
29、l组织捣碎机的使用；苯酚、氯仿加入速度、有腐蚀性；沉淀和上清避免互相污染；移液管的使用；提取温度、冷却时间；二苯胺反应物及时清洗；地衣酚和二苯胺溶液倒入废液缸；记录数据、现象；改进加入EDTA标准曲线平行测定加3M NaAc紫外分光光度法测定核酸纯度DNA测定，样品用量0.3ml、0.6mldiscussion时间统筹（水浴锅）重复洗涤沉淀（0.14M NaCl预冷）加入乙二胺四乙酸EDTA（核酸酶抑制剂Mg2+、Mn2+）NaCl加入量计算核酸纯度氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。网络视频DNA RNA提取网络视频： http:/ 752N分光光度计使用网络视频： http:/ http:/
