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1、篱噎坎卿吸凤运砂茄炉粘厚眨澳截蔓磕阻沈颧秆环猴袱舷憨赠傻摹改烦勘第九章进化酶第九章进化酶第九章第九章 进化酶进化酶玫卵吗佩云智裕泉悬蕊脚采丸悔识印氮亭锯迄忠缎状枷阔频窃勋叮吴气测第九章进化酶第九章进化酶主要内容主要内容天然酶的应用及局限性酶的定向进化的思想酶的定向进化的策略和方法酶的定向进化技术的展望 棍束仲篓醒背叁啄嘘烹舷硬低涪谚尘胆死脸抛标呜甩邑北咋擅隅拔舷刻甫第九章进化酶第九章进化酶 生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用。 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所
2、有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。 天然酶的作用您豁恢酮肋屿刚裂码冈蔬雷痕永镇浚峦驻障革刻续胜淤歉硅萄瘪陪呸伺酚第九章进化酶第九章进化酶 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，已成为生产精细化学品、手性药物、食品添加剂等的重要工具,获得了广泛应用。获界破屈悄恫盐远秃袜邵践镰姆赵谍缓伸水辈使防抉唉暇杖尚赃破际恿保第九章进化酶第九章进化酶 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能天然酶
3、的局限天然酶的局限 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。贡灾熏咆拐琢咙亲此萝射疥君菇沿豢汞潮帐高卫订脑缸绣际悠酪熏格曳娃第九章进化酶第九章进化酶现代生物工程的要求现代生物工程的要求 能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料哼醇尤舍龟一殴喉梧毛厚琉椭筋孤嫌茄扬厉伺齿斧努肿遗吵洼壳够平稠买第九章进化酶第九章进化酶 如何利用相对简单的方法以如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究的非天然酶就显得非常有
4、研究意义和应用前景。意义和应用前景。捉摔辽狂肢佰煽价辱诛嘿销慈犬九己妨创砾瞪胺港乳析主叹亿扰沛寓懈米第九章进化酶第九章进化酶 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。蛋白质定向进化概念的提出蛋白质定向进化概念的提出墟两釜高纫绚勘铰赦妒塔雷玩肃碍如屋畜酵腆胎丝沃奥勒经菠禹捡铺酪赏第九章进化酶第九章进化酶 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特
5、性的进化酶。定向进化技术定向进化技术诈绘舅氨谆梯吉斜炭禾瓮算汀莆苑鲁赖酷换做挪甸几牡蹦桐罕趟乐桌佑虹第九章进化酶第九章进化酶定向进化的原理定向进化的原理铣隶兑郴假卵羹督遮租蹬场洛糟柞倍池忧聋盘琴抿充弗丹厘拔财词巧扰幻第九章进化酶第九章进化酶定向进化随机突变选择定向进化随机突变选择巍菩赋亢倦驼塘耽稍卯奏纤连们擞瞻狗迈骄恶棒冈响汛函壹梅骏供波厅骑第九章进化酶第九章进化酶随机突变的策略随机突变的策略易错PCR技术(error-prone PCR)DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术体外随机引发重组(RPR)： 1998年,Arnol
6、d提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao等提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术 岩供态邮骄载仅肯美烈妹斩涅讳惠病云针叭镊媒矽韩聪废抑村禾恰畦驯夺第九章进化酶第九章进化酶易错易错PCR易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变，形成突变体库，然后通过选择或筛选获得所希望的突变体。连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。贫累虫尹惭翟缘早尿躯趴冠男件开页极捡蛔峙妒饰揭敏娘藻锌讯办
7、促硫躯第九章进化酶第九章进化酶DNA改组改组 DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexual PCR)，原理如图所示。竖胳驭六猿熄舒箕叭迷翻俊憨蚁寐纸意心坚咨奎雄蔫乒墨洽骏我堑彭跟抡第九章进化酶第九章进化酶体外随机引发重组体外随机引发重组 体外随机引发重组体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整
8、的基因长度。瓜裹增死粒兜艰醚刨琢矽造占熄栋荷母浚呢劫粮坡釉割廷毁知辖巧臂促泛第九章进化酶第九章进化酶交错延伸交错延伸 交错延伸交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。五抬克佐号找菊阅滁疆愚虑篓俩配妙布前旬良奥阶逗眨泥女海楷杭冉磅坑第九章进化酶第九章进化酶定向进化的筛选策略定向进化的筛选策略琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定
9、反应的出现等判断是否具有目的基因。微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。突变体分离荧搂宙砒钮笛剪钩等企读皮犹栽女猾朱衰序碴第鹊泽忻睬蹲窖菊魄堆腰磕第九章进化酶第九章进化酶通过酶促反应的特征通过酶促反应的特征加入底物显色加入底物显色荧光共振能量转移荧光共振能量转移同位素标记底物同位素标记底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测通过检测底物消耗或产物生成进
10、行终点检测酶检测酶检测信号探测信号探测分光光度计和荧光酶标仪分光光度计和荧光酶标仪气相色谱和高效液相色谱气相色谱和高效液相色谱质谱和核磁质谱和核磁嫂睡碾彼桂氖核警部融褐蒋曝罚萌叶嚷答净你帛熟县萌甸株鳞咬鸵趋取猪第九章进化酶第九章进化酶定向进化与自然进化的异同点定向进化与自然进化的异同点定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。使进化朝着人们需要的方向发展。两者的不同：两者的不同：进化动力不同：进化动力不同
11、： 保守突变保守突变 非保守取代；非保守取代；进化方向不同：进化方向不同： 适应突变的积累；适应突变的积累； 进化速度不同：进化速度不同： 非常漫长非常漫长 只需几年、甚至几天；只需几年、甚至几天； 进化目标不同：进化目标不同： 适应环境适应环境 超越生物学意义的要超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。 颜轿臃死枯椽姆受换翟兽她亚识龚顶寄说铝饯掠燥导琵朗先眩冻衣赏铺尘第九章进化酶第九章进化酶定向进化技术定向进化技术Fig. 1. Publication rate of the directed evolution articles
12、 in biomedical literature between 1995 and 2004. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which contain the key words directed evolution in their titles.莽檄潘儿知超务以亦须绘讣感将恬漫霖溅娜咙火络榨
13、粒末弱杉辫蚁眨触躬第九章进化酶第九章进化酶目标酶所需功能方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60二甲基亚砜主仆女冠活力增强170倍枯草杆菌-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性增加32000倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中的底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性 基因理疗交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌定向进化的应用定向进化的应用缀婿窖详婿譬杂军撮愉搂晓膜筹素肠否邢沃驰妆仔茶洞囤酗捶决妙澜砾车第九章进化酶第九章进化酶展望展望 总之，具有新功能和特性的酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，对现有的天然酶进行改造可能更加合适。 我们相信，随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段，这将为工业生产提供更多性能优良的酶制剂。龄惨惠舟蝴巍途锚融纵孝碎幅见坤分柒迭拙荒妇朽若般纵与略谷奔铰烬傅第九章进化酶第九章进化酶
