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1、11、1.2DNA重组技术的基本重组技术的基本工具工具 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 （一轮复习课）（一轮复习课） 2011、1、7(1)基因工程的诞生（基因工程的诞生（A级要求）级要求）(2)基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术(A级要求）级要求）(3)基因工程的应用基因工程的应用(B级要求）级要求）(4)蛋白质工程蛋白质工程(A级要求）级要求）考纲要求：考纲要求：基因工程的概念n基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出
2、更符合人们需要的新的生物类型和遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。生物产品。 基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物优点：定向改造生物体的性状（目的性强）优点：定向改造生物体的性状（目的性强）育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍原理：基因重组原理：基因重组为什么基因工程能够成功呢？ 基因拼接的理论基础： 规则的双螺旋结构
3、规则的双螺旋结构 基本单位都是脱氧核苷酸基本单位都是脱氧核苷酸 遵循碱基互补配对原则遵循碱基互补配对原则外源基因在受体内表达的理论基础： 生物界共用一套遗传密码生物界共用一套遗传密码 DNA重组技术的基本工具 n限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀” nDNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针” n基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运分子运输车输车” 限制性核酸内切酶“分子手术刀”分布：分布：主要在原核生物中主要在原核生物中作用特点：作用特点：特异性，即识别特异性，即识别特定核苷酸序列，切特定核苷酸序列，切割特定切点割特定切点切点：切点：磷酸二酯键磷酸二酯键举
4、例：举例：EcoRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTC序列，并序列，并在在G和和A之间切开之间切开（黏性末端）（黏性末端） SmaI限制酶能识别限制酶能识别GGGCCC序列，并序列，并在在G和和C之间切开之间切开（平末端）（平末端）限制酶所识别的序列有什么特点 n限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱个碱基还是基还是4个碱基，都可以找到一条中个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的上的碱基是反向对称重复排列的。碱基是反向对称重复排列的。限制性内切酶EcoRI限制限制酶酶限制酶在原核生物中的作用 n限制酶在原核生物中主要起到切割外源
5、限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使、使之失效，从而达到保护自身的目的。之失效，从而达到保护自身的目的。n含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这分子中不具备这种限制酶的识别序列种限制酶的识别序列DNA连接酶常用的常用的DNA连接酶连接酶：DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键是否需模板不需要需要连接DNA链双链单链DNA连接酶DNA聚合酶作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片段的3端的羟基上，形成磷酸二酯键作用结果将存在的DNA片段连接成重组DNA分子合
6、成新的DNA分子基因的载体“分子运输车”载体的作用载体的作用： 1、将外源基因转移到受体细胞中去。、将外源基因转移到受体细胞中去。 2、利用运载体在受体细胞内，对外源基、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。因进行大量复制。常用的载体有：常用的载体有： 质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒噬菌体的衍生物，动植物病毒等等质粒 质粒是基因工质粒是基因工程最常用的运载体，程最常用的运载体，它广泛地存在于细它广泛地存在于细菌中，是细菌染色菌中，是细菌染色体外能够自主复制体外能够自主复制的很小的环状的很小的环状DNA分子，大小只有普分子，大小只有普通细菌拟核通细菌拟核DNA的的百分之一百分之
7、一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造 1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；连接； 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等反应的基因等 ） 4、对受体细胞无害、对受体细胞无害作为载体必须具备哪些条件作为载体必须具备哪些条件？原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构( (补充内容）补充内容）非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编
8、码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 , ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达, ,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子启动子启动子真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的
9、的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用, ,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非非编码序列：编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区
10、编码区非编码非编码1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）人工合成）人工合成（3 3）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因
11、什么是基因文库？什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？的基因？目的基因的有关信息与什么相联系？目的基因的有关信息与什么相联系？(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因概念：概念：基因文库基因文库 （gene library）基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNA文库）文库） 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体菌各个受体菌分别含有这种生物的不同的
12、基因分别含有这种生物的不同的基因,称为基因称为基因文库文库(gene library)基因组文库基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库这种基因文库叫做部分基因文库.基因组文基因组文库与部分库与部分基因文库基因文库的关系的关系基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR聚合
13、酶链式反应聚合酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技术技术。通过此技术，可。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取大量的目的基因。PCR技术技术n原理：原理：n前提：前提：n原料原料n方式方式PCR扩增仪扩增仪DNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增， 即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）指数指数2 2n n模板模板DNA；DNA引物；四种脱氧引物；四种脱氧核苷酸；热稳定核苷酸；热稳定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）；离子酶）；离子n 过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热
14、至加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性变性退火退火延伸延伸(3)PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等PCR技术DNA复制不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子二、二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心
15、核心（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程: :质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目
16、的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同一种同一种1.1.过程过程: :2、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。还需要有其他控
17、制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往
18、还要增加一些其他调控元件，如增强子等；他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。3.3.基因表达载体的基因表达载体的组成：组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是RNA聚合酶结合位聚合酶结合位点点位于基因的
19、末端位于基因的末端,终止终止转录转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对单子叶植物无感染能力单子叶植物无感染能力Ti质
20、粒质粒的的TDNA可转移至受体细可转移至受体细胞并整合到其染色体上胞并整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，
21、花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物3、将目的基因导入微
22、生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵
23、(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞检测检测表达检测表达检测方法方法转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交DNADNA分子杂交分子杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。返返返返 回回回回
