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1、DNA linking-enzymeDNA linking-enzymerestriction endonucleaserestriction endonucleaseDNA linking-enzymeDNA linking-enzyme利用基因工程原理让大肠杆菌生产人胰岛素利用基因工程原理让大肠杆菌生产人胰岛素又需要哪些基本操作步骤呢？又需要哪些基本操作步骤呢？1教育教学第二节第二节 基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术基因工程（将人胰岛素基因转入大肠杆菌基因工程（将人胰岛素基因转入大肠杆菌）胰岛素基因胰岛素基因人体细胞人体细胞大肠杆菌大肠杆菌随细菌的增殖，胰岛素随细菌的增殖，胰岛素基
2、因也同时复制基因也同时复制胰胰岛岛素素获取胰岛获取胰岛素基因的素基因的表达产物表达产物胰岛素胰岛素质粒质粒大肠杆菌大肠杆菌形成重组形成重组形成重组形成重组DNADNA分子分子分子分子 导入导入导入导入受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞目的基因目的基因目的基因目的基因检测与鉴定检测与鉴定检测与鉴定检测与鉴定获取获取获取获取目的基因目的基因目的基因目的基因2教育教学剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达（一）获得目的基因（一）获得目的基因（二）形成重组（二）形成重组DNA分子分子（三）将重组（三）将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞（四）目的基因的检测和表达（四）目的基因的检测和表达基因工程的基本
3、操作步骤（技术）基因工程的基本操作步骤（技术）1 1、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞2 2、目的基因的表达、目的基因的表达3教育教学问题：获取目的基因的方法有哪些？ 思考思考1 1：如果我们对目的基因的碱基序列完全如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，比如未知，比如: :如果我们对抗虫基因的碱基序列如果我们对抗虫基因的碱基序列完全不知道，怎样从完全不知道，怎样从苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌体内获体内获取目的基因（抗虫基因）？取目的基因（抗虫基因）？ 如何操作？如何操作？ 4教育教学大片段大片段DNA打成许多小片段打成许多小片段小片段小片段DNA目的基因目的基因载入运载体
4、载入运载体细菌细菌重组重组DNA分子分子重组重组DNA分子分子例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因如果运气不如果运气不好，在打成好，在打成小片段时，小片段时，有可能把抗有可能把抗虫基因打断虫基因打断基因组文库基因组文库5教育教学如何从基如何从基因文库中因文库中获取目的获取目的基因基因? ?大片段大片段DNA打成许多小片段打成许多小片段小片段小片段DNA目的基因目的基因载入运载体载入运载体细菌细菌重组重组DNA分子分子重组重组DNA分子分子基因组文库基因组文库对基因组文库对基因组文库的所有细菌进的所有细菌进行逐一筛查行逐一筛查找出有抗虫蛋找出有抗虫
5、蛋白的菌落白的菌落该菌落所携带该菌落所携带的基因片段就的基因片段就含有目的基因含有目的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因容易吗？容易吗？6教育教学构建基因组文库，获取目的基因构建基因组文库，获取目的基因7教育教学一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段形成重组形成重组DNA分子分子导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建基因组基因组文库文库1.1.从基因文库中获取从基因文库中获取8教育教学思考：从基因组文库中
6、获取人的胰岛素基因，导入大肠杆菌能否成功表达？为什么？9教育教学思考：能否根据能否根据mRNAmRNA合合成没有内含子的成没有内含子的胰岛素基因？胰岛素基因？10教育教学单链单链RNA（mRNA)mRNA)逆转录酶逆转录酶杂交杂交双链双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA逆（反）转录法合成目的基因：逆（反）转录法合成目的基因： cDNA cDNA文库的构建文库的构建RNA链链DNA链链水解水解RNA11教育教学一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶D
7、NADNA片段片段形成重组形成重组DNA分子分子导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建基因组基因组文库文库mRNAmRNA逆逆( (反）转录反）转录目的基因目的基因(cDNA)(cDNA)形成重组形成重组DNA分子分子导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建cDNAcDNA文库文库1.1.从基因文库中获取从基因文库中获取提取提取12教育教学13教育教学思考：思考：基因文库如同国家图书馆，而基因文库如同国家图书馆，而cDNAcDNA文库则像某文库则像某单位的图书馆，二者除了大小不同之外，还有哪些单位的图书馆，二者除了大小不同之外，还有哪些区别？区别？ 文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库
8、基因组文库文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中终止子基因中终止子基因多少基因多少小小大大无无 有有无无 有有部分基因部分基因全部基因全部基因思考：思考： 如果想知道一种生物在个体发育的如果想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达不同阶段表达的基因有什么不同，需要构建哪一种基因文库？的基因有什么不同，需要构建哪一种基因文库？14教育教学问题：获取目的基因的方法有哪些？ 思考思考1 1：如果我们对目的基因的碱基序列完如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？全未知，怎样办？如何操作？思考思考2 2：如果我们已知目的基因的碱基序列，如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？
9、可以怎样操作？ 15教育教学一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建基因组基因组文库文库mRNAmRNA反转录反转录目的基因目的基因(cDNA)(cDNA)导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建cDNAcDNA文库文库目的基因的核苷目的基因的核苷酸序列是已知酸序列是已知 化学合成法化学合成法目的基因目的基因1.1.从基因文库中获取从基因文库中获取2.2.化学合成法化学合成法提取提取形成重组形成重组DNA分子分子形成重组形成重
10、组DNA分子分子16教育教学问题：获取目的基因的方法有哪些？ 思考思考1 1：如果我们对目的基因的碱基序列完如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？全未知，怎样办？如何操作？思考思考2 2：如果我们已知目的基因的碱基序列，如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？可以怎样操作？思考思考3 3： 如果我们已知蛋白质的氨基酸序如果我们已知蛋白质的氨基酸序列，又可以怎样操作？列，又可以怎样操作？ 17教育教学思考：能否根据氨基酸的序列获得人胰岛能否根据氨基酸的序列获得人胰岛素基因的碱基序列？素基因的碱基序列？18教育教学化化学学合合成成法法19教育教学一一. .基因工程的基本操作
11、步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段形成重组形成重组DNA分子分子导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建基因组基因组文库文库mRNAmRNA反转录反转录目的基因目的基因(cDNA)(cDNA)形成重组形成重组DNA分子分子导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建cDNAcDNA文库文库目的基因的核苷酸序目的基因的核苷酸序列是已知列是已知 化学合成法化学合成法目的基因目的基因1.1.从基因文库中获取从基因文库中获取2.2.化学合成法化学合成法提取提取或可推测的或可推测的20教育教学问题：获
12、取目的基因的方法有哪些？ 思考思考1 1：如果我们对目的基因的碱基序列如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？完全未知，怎样办？如何操作？思考思考2 2：如果我们已知目的基因的碱基序如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？列，可以怎样操作？思考思考3 3： 如果我们已知蛋白质的氨基酸序如果我们已知蛋白质的氨基酸序列，又可以怎样操作？列，又可以怎样操作？思考思考4 4：如果我们知道目的基因两端的部如果我们知道目的基因两端的部分碱基序列，还可以怎样操作？分碱基序列，还可以怎样操作？21教育教学uu聚合酶链式反应（PCR技术）变性：变性：双链双链DNADNA解链解链成为单链成为
13、单链DNADNA复性（退火）复性（退火）：部分部分引物与模板的单链引物与模板的单链DNADNA的特定互补部位的特定互补部位相配对和结合相配对和结合延伸：延伸：以目的基因为以目的基因为模板，合成互补的模板，合成互补的新新DNADNA链链22教育教学双链双链DNA1.变性变性升温升温至至95单链单链DNA2.复性复性降温降温至至60引物与母引物与母链结合链结合3.延伸延伸升温升温至至72DNA聚合酶聚合酶解旋解旋PCRPCR技术与原理技术与原理Taq DNA聚合酶聚合酶有耐高温的特点有耐高温的特点23教育教学思考：思考：PCRPCR技术扩增目的基因，需要什么前提和技术扩增目的基因，需要什么前提和条
14、件？过程如何？原理是什么？条件？过程如何？原理是什么？聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR(PCR技术技术) )扩增扩增原理：原理：目的：目的：前提：前提：条件：条件：DNA复制复制获得大量的目的基因获得大量的目的基因有一段已知目的基因（两端）有一段已知目的基因（两端）的核苷酸序列的核苷酸序列,以便根据这一以便根据这一序列合成序列合成引物引物。模板模板DNA（目的基因）（目的基因）耐高温耐高温DNADNA聚合酶聚合酶(TaqDNA(TaqDNA聚合酶聚合酶) )四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸两种两种DNADNA引物引物24教育教学一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技
15、术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段形成重组形成重组DNA分子分子导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建基因组基因组文库文库mRNAmRNA反转录反转录目的基因目的基因(cDNA)(cDNA)形成重组形成重组DNA分子分子导入导入受体菌受体菌群体群体构建构建cDNAcDNA文库文库目的基因的核苷酸序目的基因的核苷酸序列是已知列是已知 化学合成法化学合成法3.3.利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增目的基因目的基因1.1.从基因文库中获取从基因文库中获取2.2.化学合成法化学合成法提取提取获取大量目的基因获取大量目的基因或
16、可推测的或可推测的25教育教学第第一一个个循循环环第二第二个循个循环环第第三三个个循循环环最快第几轮能得到目的基因？最快第几轮能得到目的基因？26教育教学体内体内DNADNA复制复制体外体外PCRPCR扩增扩增模板模板解旋解旋引物引物酶酶DNADNA分子分子目的基因目的基因解旋酶解旋酶高温（加热至高温（加热至9595）RNARNA引物引物DNADNA引物引物解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等聚合酶等TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶27教育教学 人工基因合成法人工基因合成法DNADNA合成仪合成仪PCRPCR扩增仪扩增仪28教育教学一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技
17、术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因问题：问题：怎样将目的基因与质粒进行重组？怎样将目的基因与质粒进行重组？29教育教学质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA30教育教学同一种限制酶切割同一种限制酶切割质粒质粒外源基因外源基因重组重组DNA分子分子（重组质粒）（重组质粒）DNA连接酶连接酶31教育教学32教育教学33教育教学问题问题2：形成的重组质粒导入受体细胞后，除了能形成的重组质粒导入受体细胞后，除了能够稳定存在外，并且可以遗传给下一代。同时，使够稳定存在外，并且可以遗传给下一代。同时，使目的基因在受体细胞中表达和发挥作用，需要对重目的基因在受
18、体细胞中表达和发挥作用，需要对重组质粒作怎样的修饰？组质粒作怎样的修饰？据图回答：据图回答：一个表达载体的组成，除了目的基一个表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有哪些基本元件？因外，还必须有哪些基本元件？34教育教学( (二二) )形成重组形成重组DNADNA分子（构建基因分子（构建基因表达载体表达载体) )基因表基因表达载体达载体的组成的组成启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子复制起点复制起点标记基因标记基因一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因通常用通常用同一种同一种限制酶切割目的基因和载体限制酶切割目的基因和
19、载体( (质粒质粒) )，形成相同，形成相同的粘性末端，再用的粘性末端，再用DNADNA连接酶将二者连接连接酶将二者连接, ,形成重组形成重组DNADNA分子分子（基因表达载体）。（基因表达载体）。35教育教学用BamH对胰岛素基因和质粒切割，加入DNA连接酶，得到的都是重组质粒吗？36教育教学含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段载体载体BamHBamHBamHBamH DNADNA连接酶连接酶重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连37教育教学 双酶切连接：思考：如何 避免质粒和目的基因的自身环化？1 1、避免载体和目的基因的自身环化、载体和目的基因间反向连、避免载体和
20、目的基因的自身环化、载体和目的基因间反向连接接2 2、提高重组、提高重组DNADNA分子的重组率分子的重组率38教育教学( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞( (二二) )形成重组形成重组DNADNA分子（构建基因表达载体分子（构建基因表达载体) )一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因常用的受体细胞常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。39教育教学重组质粒重组质粒大肠杆菌的拟核大肠杆菌的拟核目的基因目的基因
21、氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（标记基因）（标记基因）将细菌用将细菌用CaCl2处理，使处理，使细胞处于感受态，可促细胞处于感受态，可促进细胞吸收进细胞吸收DNA分子分子如果是导入微生物（如细菌）如果是导入微生物（如细菌）40教育教学 感受态感受态：细胞处于容易吸收外源性细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。的状态。 处于感受态的细胞称为处于感受态的细胞称为感受态细胞感受态细胞.CaClCaCl2 20重组载体重组载体重组载体重组载体感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞42如果是导入微生物（如细菌）如果是导入微生物（如细菌）41教育教学( (三三) )目的基因导入受体细胞目的基因导入受
22、体细胞1. 1. 转基因微生物转基因微生物重组重组DNADNA分子分子( (基因表达载体基因表达载体) )CaClCaCl2 2处理处理感受态细感受态细菌细胞菌细胞( (工程菌工程菌) ) 目的基目的基因随受因随受体细胞体细胞的繁殖的繁殖而复制而复制增大细胞壁通透性增大细胞壁通透性( (二二) )形成重组形成重组DNADNA分子（构建基因表达载体分子（构建基因表达载体) )一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因吸收吸收DNA分子分子重组重组 DNA进进入细菌细胞入细菌细胞42教育教学如果是导入动物细胞如果是导入动物细胞显微
23、注射仪显微注射仪受精卵受精卵思考：思考：培育转基因动物时，受培育转基因动物时，受体细胞能否采用动物体细胞能否采用动物体体细胞细胞？试说明理由。一？试说明理由。一般可以采用动物的什么般可以采用动物的什么细胞？细胞？用口径为用口径为用口径为用口径为1m1m1m1m的的的的DNADNADNADNA注射器注射器注射器注射器，将大，将大，将大，将大量的目的基因片段注入到量的目的基因片段注入到量的目的基因片段注入到量的目的基因片段注入到受精卵的受精卵的受精卵的受精卵的核核核核内，然后把经过注射的受精卵内，然后把经过注射的受精卵内，然后把经过注射的受精卵内，然后把经过注射的受精卵移移移移植植植植到另一只雌性
24、动物的到另一只雌性动物的到另一只雌性动物的到另一只雌性动物的子宫子宫子宫子宫内，使内，使内，使内，使受精卵发育受精卵发育受精卵发育受精卵发育为转基因动物为转基因动物为转基因动物为转基因动物。43教育教学( (三三) )目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞1. 1. 转基因微生物转基因微生物重组重组DNADNA分子分子( (基因表达载体基因表达载体) )CaClCaCl2 2处理处理感受态细感受态细菌细胞菌细胞( (工程菌工程菌) ) 目的基目的基因随受因随受体细胞体细胞的繁殖的繁殖而复制而复制增大细胞壁透性增大细胞壁透性2. 2. 转基因动物转基因动物重组重组DNADNA分子分子显微注射显
25、微注射受精卵受精卵或早或早期胚胎细胞期胚胎细胞( (整合到染色整合到染色体体DNADNA上上) )转基因转基因动动 物物动物细胞培养动物细胞培养胚胎移植胚胎移植( (二二) )形成重组形成重组DNADNA分子（构建基因表达载体分子（构建基因表达载体) )一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因吸收吸收DNA分子分子重组重组 DNA进入细菌进入细菌细胞细胞或病毒侵染或病毒侵染44教育教学思考：思考：1、如果是导入植物细胞，最好以什么细、如果是导入植物细胞，最好以什么细胞为受体细胞？一般采用的运载体又是胞为受体细胞？一般采用的运
26、载体又是什么？什么？2、比如：培育抗虫棉，怎样操作才能成、比如：培育抗虫棉，怎样操作才能成功导入？功导入？45教育教学农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌的农杆菌的TiTi质粒质粒T-DNAT-DNA：( (可转移的可转移的DNADNA） 可转移可转移（也可以将目的基因转移）（也可以将目的基因转移）至受体细胞至受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的中，并且整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。46教育教学农杆菌转化法农杆菌转化法47教育教学3. 3. 转基因植物转基因植物重组重组DNADNA分子分子农杆菌农杆菌植物体细胞植物体细胞( (整合到细胞整合到细胞染色体染色体DNADNA上上) )侵染侵
27、染植物组植物组织培养织培养转基因转基因植物植物农杆菌转化法农杆菌转化法48教育教学利用压缩气体产生的动利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒力，将包裹在金属颗粒（有钨粉粒子和金粉粒（有钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在子，粒子的直径一般在0.64um）表面的表达）表面的表达载体载体DNA打入受体细胞打入受体细胞中，使目的基因与其整中，使目的基因与其整合并表达的方法。合并表达的方法。 这是单子叶植物中常这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，用的一种基因转化方法，但是成本太高。但是成本太高。基因枪基因枪49教育教学花粉管花粉管卵细胞卵细胞花粉管通道法花粉管通道法受精后 花粉管通道法花粉管通道
28、法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的基（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。50教育教学3. 3. 转基因植物转基因植物重组重组DNADNA分子分子农杆菌农杆菌植物体细胞植物体细胞( (整合到细胞整合到细胞染色体染色体DNADNA上上) )侵染侵染植物组植物组织培养织培养转基因转基因植物植物基因枪或基因枪或花粉管通道法花粉管通道法农杆菌转化法农杆菌转化法51教育教学( (三三) )目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细
29、胞( (二二) )形成重组形成重组DNADNA分子（构建基因表达载体分子（构建基因表达载体) )一一. .基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤（技术）（技术）( (一一) )获得目的基因获得目的基因( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定问题问题1 1：根据中心法则，目的基因怎样根据中心法则，目的基因怎样表达？成功表达的标志是什么？表达？成功表达的标志是什么？52教育教学按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了检测目的基因是否已转录出了mRNAm
30、RNA检测目的基因是否已翻译出了蛋白质检测目的基因是否已翻译出了蛋白质检测个体是否具有目的基因所对应表现型检测个体是否具有目的基因所对应表现型如何检测如何检测 ？53教育教学思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？54教育教学没有质粒没有质粒含目的基含目的基因的质粒因的质粒正常质粒正常质粒55教育教学没有质粒没有质粒含目的基因的质粒含目的基因的质粒正常质粒正常质粒56教育教学DNA分子杂交法检测目的基因分子杂交法检测目的基因57教育教学DNADNA分子杂交法分子杂交法制作方法：制作方法： 化学合成或化学合成或PCRPCR法合成法合成特点：
31、特点：1.1.被放射性同位素标记被放射性同位素标记2.2.目的基因片段目的基因片段3.3.单链单链DNADNA原理：原理： 碱基互补配对，检测未知碱基互补配对，检测未知DNADNA分子分子用途：用途： 目的基因检测目的基因检测,DNA,DNA指纹指纹, ,亲缘关系测定亲缘关系测定, ,基因诊断。基因诊断。DNADNA分子探针法分子探针法58教育教学检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测转基因生物体内是否已含有目的基因同理：同理： 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关思考思考思考思考：受体细胞摄入目的基因后就说明目的基：受体细胞摄
32、入目的基因后就说明目的基：受体细胞摄入目的基因后就说明目的基：受体细胞摄入目的基因后就说明目的基因完成了表达吗？因完成了表达吗？因完成了表达吗？因完成了表达吗？检测目的基因是否已转录出了检测目的基因是否已转录出了mRNAmRNA59教育教学检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了检测目的基因是否已转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否已翻译出了检测目的基因是否已翻译出了蛋白质蛋白质利用利用抗原抗原-抗体抗体的特异性结合的特异性结合按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关问题：问题：如何运用抗原抗体特异性结合
33、的原理检测如何运用抗原抗体特异性结合的原理检测目的基因是否翻译出了蛋白质？目的基因是否翻译出了蛋白质？60教育教学检测目的基因是否已翻译出了检测目的基因是否已翻译出了蛋白质蛋白质利用利用抗原抗原-抗体抗体的特异性结合的特异性结合将目的基因表达出将目的基因表达出的蛋白质作为抗原的蛋白质作为抗原制备抗体制备抗体61教育教学检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了检测目的基因是否已转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否已翻译出了蛋白质检测目的基因是否已翻译出了蛋白质检测个体是否具有目的基因所对应表现型检测个体是否具有目的基因所对应表现型按照
34、基因表达顺序逐步检测，逐步过关按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关问题：问题：除了上述分子检测外，你能否在个体生物学水平上进行除了上述分子检测外，你能否在个体生物学水平上进行检测？例如，如何检测转基因抗虫棉具有抗虫特性？检测？例如，如何检测转基因抗虫棉具有抗虫特性？ 62教育教学转基因转基因抗虫植物抗虫植物用棉花叶片饲喂棉铃虫，用棉花叶片饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。得到表达。63教育教学( (四四
35、) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1.1.目的基因是否导入：目的基因是否导入：(1)(1)标记基因检测法。标记基因检测法。(2)DNA(2)DNA分子杂交法分子杂交法( (DNADNA探针检测法探针检测法) )2.2.目的基因是否表达：目的基因是否表达：(3)(3)是否出现目的基因所控制的性状是否出现目的基因所控制的性状: :(2)(2)是否翻译合成了蛋白质：是否翻译合成了蛋白质： 抗原抗体杂交检测法抗原抗体杂交检测法核酸分子杂交法核酸分子杂交法（1 1）是否转录出了信使）是否转录出了信使RNARNA：观察法观察法64教育教学65教育教学基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序
36、基因文库基因文库获取目的基因获取目的基因基因组文库基因组文库cDNAcDNA文库文库化学合成法化学合成法PCRPCR扩增法扩增法运载体（细菌质粒）运载体（细菌质粒）酶切、连接，构建酶切、连接，构建重组重组DNADNA（基因表达载体）（基因表达载体）受体细胞受体细胞导入导入筛选筛选动物受精卵动物受精卵植物体细胞植物体细胞细菌细胞细菌细胞组织培养组织培养发酵工程发酵工程胚胎移植胚胎移植表达产物表达产物转基因动物转基因动物转基因植物转基因植物目的基因的表达与鉴定目的基因的表达与鉴定总结：总结：66教育教学二二. .基因工程的原理基因工程的原理1.1.整体原理：整体原理：人工的基因重组人工的基因重组2
37、.2.各步骤原理：各步骤原理：（1 1）基因能转移：）基因能转移：基因是独立的遗传单位基因是独立的遗传单位（2 2）不同生物的基因能拼接：）不同生物的基因能拼接：不同生物的不同生物的DNADNA有着相同的双螺旋结构和碱基互补配对原则，有着相同的双螺旋结构和碱基互补配对原则，限制酶和连接酶的作用。限制酶和连接酶的作用。（3 3）同一基因在不同生物的细胞中合成相同的蛋白质：）同一基因在不同生物的细胞中合成相同的蛋白质：复制、转录和翻译过程相同，密码子具有通用性复制、转录和翻译过程相同，密码子具有通用性3.3.优点：优点：定向改变生物的遗传特性定向改变生物的遗传特性67教育教学例例1 1 科学工作者
38、分离得到了某真核生物的基因科学工作者分离得到了某真核生物的基因A A，将其解离成两条，将其解离成两条具有互补关系的单链，其中的一条与基因具有互补关系的单链，其中的一条与基因A A的信使的信使RNARNA进行配对，杂进行配对，杂交后可以观察到如图所示的结构对此结果的合理解释是（）交后可以观察到如图所示的结构对此结果的合理解释是（）A A1 1、3 3、5 5、7 7为为DNA/RNADNA/RNA的杂交体，的杂交体，2 2、4 4、6 6为单链为单链DNADNA部分部分B B1 1、3 3、5 5、7 7为为DNA/RNADNA/RNA的杂交体，的杂交体，2 2、4 4、6 6为单链为单链RNA
39、RNA部分部分C C1 1、3 3、5 5、7 7为双链为双链DNADNA部分，部分，2 2、4 4、6 6为为DNA/RNADNA/RNA的杂交体的杂交体D D1 1、3 3、5 5、7 7为单链为单链RNARNA部分，部分，2 2、4 4、6 6为为DNA/RNADNA/RNA的杂交体的杂交体A68教育教学例例2 2. .质粒是基因工程中最常用的运载体，质粒上有标记基因质粒是基因工程中最常用的运载体，质粒上有标记基因（如图所示），通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）（如图所示），通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上是否转移成功。外
40、源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同。右图表示外源基因插入位置（插入点有的生长情况也不同。右图表示外源基因插入位置（插入点有a a、b b、c c），请据下表细菌生长情况，推测），请据下表细菌生长情况，推测三种重组三种重组细菌与外源基因插入点相对应的一组是细菌与外源基因插入点相对应的一组是 重组重组细菌细菌含氨苄青霉含氨苄青霉素培养基素培养基含四环素的含四环素的培养基培养基能生长能生长能生长能生长能生长能生长不能生长不能生长不能生长不能生长能生长能生长A是是c、是是a 、是是 b B 是是c和和b、是是b、是是cC是是c和和b、是是c、是是b D 是是a、是是b、是是cbacA
41、bca69教育教学例例3.培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为）常作为标记基因标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程. 抗虫基因抗虫基因含含kankan质粒质粒重组质粒重组质粒土壤土壤农杆菌农杆菌含重组质粒含重组质粒土壤农杆菌土壤农杆菌A A构建构建C C诱导诱导选择选择导入导入转基因转基因抗虫植株抗虫植株再生植株再生植株愈伤愈伤组织组织离体棉花离体棉花叶片组织叶片组织侵染侵染B B培养培养选择选择
42、分分化化D D检测检测（1）A过程需要的酶有过程需要的酶有 _ 。（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备 的两个条件是的两个条件是_ 。（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入外，还必须加入_。限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶连接酶能够自我复制、具有标记基因能够自我复制、具有标记基因卡那霉素卡那霉素70教育教学4.如果利用如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用过程应该用_作为探针。作为探针。 5.科学家发现转基因
43、植株的卡那霉素抗性基因的传递符科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。合孟德尔遗传规律。将转基因植株与将转基因植株与_杂交，其后代杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为那霉素敏感型的数量比为_。若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_%。标记的目的基因标
44、记的目的基因非卡那霉素敏感型非卡那霉素敏感型3:110071教育教学 例例4.4.科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答问题选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答问题72教育教学典型例题典型例题1：（1 1）步骤）步骤和和中常用的工具酶是中常用的工具酶是和和。（2 2）图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基）图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因，经过因，经过和和步骤后，有些质粒上的步骤后，
45、有些质粒上的基因内插基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。分隔使得该抗性基因失活。（3 3）步骤）步骤是是的过程，为了促进该过程，应的过程，为了促进该过程，应该用该用处理大肠杆菌。处理大肠杆菌。（4 4）步骤）步骤将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基养基C C上培养，目的是筛选上培养，目的是筛选，能在，能在C C中生长的大中生长的大肠杆菌有肠杆菌有种。种。（5 5）步骤）步骤：用无菌牙签挑取：用无菌牙签挑取C C上的单个菌落，分别接上的单个菌落，分别接种到种到D D
46、（含氨苄青霉素和四环素）和（含氨苄青霉素和四环素）和E E（含四环素）两（含四环素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于况如图所示。含目的基因的菌落位于（D D、E E）上，）上，请在图中相应的位置上圈出来。请在图中相应的位置上圈出来。73教育教学答案（1）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶 DNA连接酶连接酶（2）氨苄青霉素抗性基因）氨苄青霉素抗性基因（3）将重组质粒（目的基因）导入大肠杆菌（受体细）将重组质粒（目的基因）导入大肠杆菌（受体细胞）胞） CaCl2溶液溶液（4）含四环素抗性基因的大肠杆菌（
47、含抗性基因的大）含四环素抗性基因的大肠杆菌（含抗性基因的大肠杆菌给分，回答含目的基因的大肠杆菌不给分）肠杆菌给分，回答含目的基因的大肠杆菌不给分） 2（5）E（评分标准：在两个菌落中圈一个也可给分（评分标准：在两个菌落中圈一个也可给分 ）74教育教学 把正常基因导入目标细胞，以纠正或补偿把正常基因导入目标细胞，以纠正或补偿基因缺陷，达到治疗的目的。基因缺陷，达到治疗的目的。 基因治疗基因治疗75教育教学蛋白质工程：蛋白质工程：基因基因DNA氨基酸序列氨基酸序列多肽链多肽链蛋白质蛋白质空间结空间结构构mRNA转录转录翻译翻译DNA合成合成生物生物功能功能预期预期功能功能点突变点突变分子分子设计设计折叠折叠原理：原理：改造基因（基因修饰或基因合成）改造基因（基因修饰或基因合成）目的：目的：定向改造或制造定向改造或制造自然界不存在自然界不存在的的 蛋白质蛋白质（以满足人类的生产和生活的需求以满足人类的生产和生活的需求）第二代基因工程第二代基因工程76教育教学例：例：T4T4溶菌酶溶菌酶异亮氨酸异亮氨酸半胱氨酸半胱氨酸二硫键的形成提高了二硫键的形成提高了T4T4溶溶菌酶的热稳定性菌酶的热稳定性77教育教学
