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1、水微生物检测南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生实验课时：实验课时：8 8学时学时课程类型：专业实验课课程类型：专业实验课课程要求：必修课程要求：必修每组人数：每组人数：2 2人人实验目的与要求掌握水样采集规则及注意事项。熟悉常用水卫生细菌学指标。熟悉菌落总数、大肠菌群的测定方法及检测意义。学会对所检测的水样作综合分析。水微生物检测的意义水体的微生物污染问题日趋严重。在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长。水体中微生物污染的来源：土壤，以及人类、动
2、物的排泄物污染。水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。水微生物检测可用于评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种可能存在的致病微生物一一进行检测。一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过对指示菌的检测，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。水微生物的检测指标菌落总数(aerobic bacterial count)是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生
3、物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。水质微生物的检测指标总大肠菌群(coliform bacteria)是指一群需氧及兼性厌氧的，37生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。实验内容水样采集；菌落总数的测定；总大肠菌群的测定。一、水样采集采样原则所采集的样品具有代表性。采样容器：选择硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待测组分；不与待测组分发生反应。保证
4、从采样到分析期间，样品各组分的浓度不发生改变。 必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5 min（经常用水的水龙头放水13min）后，采集水样于无菌锥形瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下1015cm采样。采样后，将瓶塞盖好，再从水中取出。注意事项严格无菌操作。做好标记：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目。从速送检。水样从采集到检验不应超过2h，在04下保存不应超过24h。二、菌落总数的测定 平板菌落计数法（一）生活饮用水器材与试剂
5、无菌1ml吸管1支/组，无菌平皿3个/组，营养琼脂。方法水样摇匀2025次，使细菌分散。倾注培养：无菌吸取1ml水样分别置于2个空平皿，另一个作空白对照。再倾注15ml琼脂（约45）于平皿中旋转，混匀待琼脂凝固后倒置3724h。菌落计数：用肉眼或放大镜检查，计数平皿内菌落数目。结果分析与报告计算平均菌落数：报告方式：菌落总数(cfu/ml)。 cfu：colony forming units当检样的菌落数为l100时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字报告。国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。（二）水源水器材与试剂 无菌1ml吸管6支/组，
6、无菌10ml吸管1支/组。无菌平皿9个/组，营养琼脂。90ml灭菌盐水1瓶（内置适量玻璃珠），9ml灭菌盐水管3支。方法 稀释水样：无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000, 1:10000水样。方法 倾注培养：用1ml无菌吸管吸取23个适当浓度的稀释液1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。菌落计数：方法同饮用水。菌落总数测定结果分析与报告计算不同稀释度的平均菌落数：稀释度的选择和菌落总数报告方式：首先选择平均菌落在
7、30300之间者进行计算。 计算方法和报告方式如表1所示。表1稀释度选择及菌落总数报告方式例例次次不同稀释度的平均菌落不同稀释度的平均菌落数数两稀释两稀释度菌落度菌落总数之总数之比比 菌落总数菌落总数 (cfucfum1) 报告方式报告方式 (cfucfum1) 10-1 10-2 10-312345678136527602890150多不可计多不可计27多不可计多不可计0 164 295 271 304650 1l305020466085135120 1.6 2.2 2 1640037750271001 5005130002703050011016000或或1.610438000或或3.81
8、0427000或或2.71041500或或1.5103510000或或5.1105270或或2.710231000或或3.110410由表2可判定水质被污染的程度。表2 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系 水的类别水的类别最清洁最清洁水水清洁水清洁水不太清洁不太清洁水水不清洁水不清洁水极不清洁极不清洁水水菌落总数菌落总数 cfucfum110100100100010001000010000100000100000注意事项菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行。（生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此可以直接吸取1毫升到平板进行培养）各稀释管、相应平皿做好标记。包括：水样名称、
9、稀释度、时间、小组。严格无菌操作。进行水样稀释时，每一稀释度均需更换吸管。倾注时，要注意营养琼脂的温度。倾入琼脂后要混匀，待琼脂凝固后倒置培养。三、总大肠菌群的测定多管发酵法分为三步：初发酵试验平板分离复发酵证实试验初发酵试验：采用乳糖蛋白胨培养液37培养24h，观察产酸产气情况。平板分离：对阳性管培养物，接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基，观察菌落特征，并进行革兰氏染色和镜检。复发酵证实试验：对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验，并根据标准所附检数表报告结果。 产气初发酵、复发酵试验结果初发酵、复发酵试验结果大肠菌群EMB上菌落特征大肠菌群革兰染色形态（一）生活
10、饮用水器材与试剂 2瓶50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液（内有导管）, 10支5ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液（内有导管）,10ml吸管1支,100ml量筒1支。EMB，革兰染液等。方法 初步发酵试验：接种水样总量为300ml（100ml 2份，10ml 10 份，12支发酵管） 。37培养24h。平板分离：将产酸产气及只产酸不产气(发酵乳糖)管接种EMB, 37培养24h，取典型菌落作革兰氏染色镜检。复发酵试验：革兰氏染色镜检为革兰阴性无芽胞杆菌，取该菌接种于普通浓度乳糖蛋白胨(每管接13个菌落), 37培养24h，有产酸产气者即证明有大肠杆菌的存在。 产酸产气产酸产气报告为大肠菌群阳性结果
11、分析与报告根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查接种水样总量为300ml检数表（表3）。报告每升水样中的大肠菌群数（MPN 值，Most Probable Number，最大可能数法）。国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水大肠菌数每升不得超过3个。 表3 大肠菌群数检数表接种水样总量300ml（100ml 2份，10ml 10 份）1010mlml水水量的阳量的阳性管数性管数100100 ml ml 水量的阳性管数水量的阳性管数012每升水样中大肠菌群每升水样中大肠菌群数数每升水样中大肠菌群每升水样中大肠菌群数数每升水样中大肠菌群每升水样中大肠菌群数数0l23456789103
12、3711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230230（二）水源水器材与试剂 1ml吸管3支/组，10ml吸管1支/组，10ml普通发酵管（内有导管）3支/组，5ml三倍发酵管（内有导管）1支/组。EMB，革兰染液等。方法稀释水样：水样做1:10及1:100稀释。方法同菌落总数测定。初发酵试验：接种水样总量11.11ml， 4支发酵管。取10ml原水样注入5ml三倍乳糖发酵管（内有导管）；取1ml原水样、1ml 1:10及1:100稀释水样分别注入10ml普通乳糖发酵管（内有导管），37培养24h。平板分离与复发酵试验：
13、同生活饮用水。结果分析与报告根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查接种水样总量为11.11ml检数表（表4），报告每升水样中的大肠菌群数。表4 大肠菌群数检数表接种水样总量11.11ml（10ml、1ml 、0.1ml、0.01ml 各1份）接种水样总量接种水样总量( (ml)每升水样中大肠每升水样中大肠菌群数菌群数10 110 10.1 0.010.1 0.01 地地 注意事项总大肠菌群的测定方法，由于饮用水和水源水可能的污染程度不同，因些采用不同的接种量，检数表也不相同。当接种量超过1毫升时，一般采用多倍浓度培养液。如配制3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液50mL，加入100mL水样后，总体积为150mL，培养液恢复到正常浓度。 做好标记。严格无菌操作。每一稀释度均需更换吸管。实验安排当日：水样采集、倾注培养、初发酵试验。第二日：菌落计数及结果报告、平板分离。第三日：涂片，革兰氏染色，镜检、复发酵试验。第四日：报告大肠菌群数。实验报告，并对所检测的水样进行综合分析。
