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1、重组重组DNA技术技术第二十章第二十章recombinant DNA technique 1科学出版社案例式教材生物化学课件基本概念基本概念克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。DNA克隆克隆2科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件基本概念基本概念技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）3科学出版社案例式教材生
2、物化学课件生物化学课件基本概念基本概念应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有 自自 我我 复复 制制 能能 力力 的的 DNA分分 子子 复复 制制 子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或重组或重组DNA (recom
3、binant DNA) 。 DNA克隆克隆4科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件基本概念基本概念 目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组又称重组DNA工艺学。工艺学。5科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件自然界自然界DNA重组和基因转移是经常发生的重组和基因转移是经常发生的 一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的
4、DNADNA重组方式重组方式二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组接合作用接合作用转化作用转化作用三、病毒的作用三、病毒的作用6科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件重组重组DNA技术的发展简史技术的发展简史19601970年重组年重组DNA工具的研究工具的研究90（载体、酶）。（载体、酶）。1972年，年，Berg 等第一次完成等第一次完成DNA体外重组实验。体外重组实验。1973年，年，N.Cohen、W.Boyer第一次完成克隆。第一次完成克隆。1980年，重组胰岛素进入市场。年，重组胰岛素进入市场。1985年，年，Mulis完成完成PCR技术。技术。1996年，克隆羊年
5、，克隆羊Dolly(1963童第周克隆鱼童第周克隆鱼)。20世纪世纪90年代启动人类基因组计划。年代启动人类基因组计划。7科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件第一节第一节 重组重组DNADNA技术的基本过程技术的基本过程 1.分分2.切切3.接接4.转转5.筛筛6.表达表达8科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件第二节第二节 重组重组DNA技术中常用工具酶技术中常用工具酶 工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNA连接酶连接酶催化催化DNADNA中相邻的中相邻的55磷酸基和磷酸基和33羟基末端之间形成磷酸
6、二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNADNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNADNA分子或片段连接分子或片段连接DNADNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNAcDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNADNA序列分析序列分析填补填补33末端末端KlenowKlenow片段片段又名又名DNADNA聚合酶聚合酶I I大片段，具有完整大片段，具有完整DNADNA聚合酶聚合酶I I的的5 53 3 聚合、聚合、3 35 5 外切活性，而无外切活性，而无5 53 3 外切活性。常用外切活性。常用于于cDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链D
7、NA 3DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNAcDNA替代替代DNADNA聚合酶聚合酶I I进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸55羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在33羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基9科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶概念：概念：是一类能识别双链是一类能识别双链DNA分子中的某些特分子中的某些特定核苷酸序列，并由
8、此切割定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核双链结构的核酸内切酶，又称为限制酶。酸内切酶，又称为限制酶。10科学出版社案例式教材生物化学课件（一）限制性核酸内切酶的命名（一）限制性核酸内切酶的命名 Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae Rd株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表菌株；第四个字母代表菌株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次
9、序。11科学出版社案例式教材生物化学课件（二）限制性核酸内切酶的类型（二）限制性核酸内切酶的类型 型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶（应用广泛）（应用广泛）型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶 作用作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA12科学出版社案例式教材生物化学课件（三）（三）型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶特点：特点：型限制酶识别双链型限制酶识别双链DNA中中48个核苷个核苷酸组成的特定序列，从其识别序列内切割酸组成的特定序列，从其识别序列内切割DNA分
10、子中的磷酸二酯键，产生含分子中的磷酸二酯键，产生含5-P和和3-OH的产生粘性末端或平末端。的产生粘性末端或平末端。功能：功能：根据需要在特定的位点精确切割双链根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子。分子。13科学出版社案例式教材生物化学课件 识别序列特点：识别序列特点： 回文结构回文结构(palindrome) GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG14科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件（1）产生产生5 突出突出粘性末端粘性末端 (sticky end)EcoR I*GAATTC*CTTAAG*553355 33*G*C T T A A 5533 3355 O
11、HPA A T T C* G*55 33 3355 P OH15科学出版社案例式教材生物化学课件（2）产生）产生3 突出突出粘性末端粘性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*5533553355 3333 55 OHP*C T G C A*G553333 55 OHPA C G T C*G*16科学出版社案例式教材生物化学课件（3）产生）产生平末端平末端 (blunt end)*GATATC*CTATAG*5533553355333355 OHP*GAT*CTA55333355 OHPATC*TAG*EcoR 17科学出版社案例式教材生物化学课件n同裂酶（同裂酶（isoschizomer
12、isoschizomer） 又称异源同工又称异源同工酶，指来源不同识别序列相同的酶酶，指来源不同识别序列相同的酶 n同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer） 识别序列与切识别序列与切割位点相互有关的一类酶割位点相互有关的一类酶 n可变酶可变酶 此类酶是此类酶是型限制酶的特例，识型限制酶的特例，识别别DNADNA序列中的一个或几个碱基是可变的，序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过并且识别序列往往超过6 6个核苷酸个核苷酸18科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件(四）限制酶作用的影响因素四）限制酶作用的影响因素 nDNA底物的纯度底物的纯度nDNA的甲
13、基化程度的甲基化程度nDNA分子的结构分子的结构n酶切反应的温度酶切反应的温度n酶切反应的时间酶切反应的时间n酶切反应的缓冲体系酶切反应的缓冲体系 19科学出版社案例式教材生物化学课件名称名称 识别序列及切割位点序列及切割位点名称名称识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产生生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3 AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3 CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3 GATC.3 Nde Nde 5GA
14、TATG.3TATG.3切割后切割后产生生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后切割后产生平末端生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶20科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件二、二、 连接酶连接酶(DNA ligase) 将两条双链将两条
15、双链DNA片段连接起来，实片段连接起来，实现现DNA的的体外重组体外重组功能：功能： 催化两条催化两条双链双链DNA分子的分子的互补粘性末互补粘性末端端或或平末端平末端的的5 磷酸磷酸基团与基团与3 羟基羟基形形成成磷酸二酯键磷酸二酯键21科学出版社案例式教材生物化学课件2223常用的常用的DNA连接酶连接酶1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 2.T4 DNA2.T4 DNA连接酶连接酶24科学出版社案例式教材生物化学课件DNA连接酶对黏性末端的连接效率远高于平末端连接酶对黏性末端的连接效率远高于平末端的连接效率。的连接效率。连接黏性末端的温度一般在连接黏性末端的温度一般在415
16、。连接酶的用量在平末端连接高于黏末端。连接酶的用量在平末端连接高于黏末端。ATP的反应浓度：的反应浓度：10mol/L1 mmol/L。载体与目标基因的摩尔数比值：载体与目标基因的摩尔数比值：1 101 3。影响影响DNA连接酶作用的因素连接酶作用的因素25科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件三、三、DNA聚合酶聚合酶 能够把脱氧核糖核苷酸能够把脱氧核糖核苷酸连续地连续地添加到双链添加到双链DNA分子引物链的分子引物链的3-OH末端末端，催化核苷酸的，催化核苷酸的聚合作用聚合作用类型：类型： 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 Klenow片段片段 Taq DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶
17、逆转录酶 26科学出版社案例式教材生物化学课件四、其它修饰酶四、其它修饰酶 1.末端脱氧核苷酸转移酶：末端脱氧核苷酸转移酶：主要作用是在外源主要作用是在外源DNA片段及载体分子片段及载体分子的的3-OH加上互补的同聚物尾巴，形成人工加上互补的同聚物尾巴，形成人工黏性末端黏性末端27科学出版社案例式教材生物化学课件28科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件2.多核苷酸激酶：多核苷酸激酶：在重组在重组DNA技术中，多核苷酸激酶技术中，多核苷酸激酶可用于标记可用于标记DNA的的5末端，也可使缺失末端，也可使缺失5-P末端的末端的DNA发生磷酸化作用。发生磷酸化作用。29科学出版社案例式教材生物
18、化学课件生物化学课件3.碱性磷酸酶：碱性磷酸酶：能特异地切除能特异地切除DNA、RNA和和dNTP上上5磷酸基团。在重组磷酸基团。在重组DNA技术中，用碱性磷酸技术中，用碱性磷酸酶去除载体分子或酶去除载体分子或DNA片段的片段的5-P，以防止，以防止发生自身连接。发生自身连接。30科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件31科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件32科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件第三节第三节 重组重组DNA技术中常用载技术中常用载体体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质
19、所采用的一些DNA分子。分子。 常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA33科学出版社案例式教材生物化学课件克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。34科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件作为基因工程载体所需具备的基本条件作为基因工程载体所需具备的基本条件
20、n能自主复制能自主复制n有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS），），利于外源利于外源DNA分子插入分子插入n具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定选和鉴定n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNAn拷贝数高拷贝数高 n具有较高的遗传稳定性具有较高的遗传稳定性35科学出版社案例式教材生物化学课件一、质粒载体一、质粒载体 质粒质粒 (plasmid)特特点点: : 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗传信息遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性
21、状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 36科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件（一）（一）pBR322pBR322质粒载体（克隆质粒载体（克隆6kb6kb） 37科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件（二）（二） pUC19 质粒载体质粒载体LacZ基因与基因与-半乳糖苷酶半乳糖苷酶X-gal，5-溴溴-4氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷MCS区段：来自区段：来自M13噬菌体噬菌体38科学出版社案例式教材生物化学课件二、噬菌体（二、噬菌体（bacteriophage）载体）载体 （一）（一） 噬菌体噬菌体 (phage)载体载体（二）粘粒（二）粘粒 (cosmid)载体载体（
22、三）（三）M13噬菌体载体噬菌体载体39科学出版社案例式教材生物化学课件 噬菌体插入较大外源噬菌体插入较大外源DNA片段（片段（23kb）40科学出版社案例式教材生物化学课件n与质粒载体相比，其突出优点是可插入较与质粒载体相比，其突出优点是可插入较大外源大外源DNA片段片段n噬菌体的感染效率远高于质粒载体的转化噬菌体的感染效率远高于质粒载体的转化效率效率41科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件三、病毒载体三、病毒载体质粒载体、噬菌体载体都是以原核细质粒载体、噬菌体载体都是以原核细胞（如大肠杆菌）作为宿主细胞。近年来胞（如大肠杆菌）作为宿主细胞。近年来为适应真核细胞重组为适应真核细胞重组
23、DNA技术的需要，特技术的需要，特别是为实现真核基因表达或基因治疗的需别是为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展出用动物病毒改造的病毒载体。要，已发展出用动物病毒改造的病毒载体。42科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类 逆转录病毒载体逆转录病毒载体 （整合型）（整合型）腺病毒载体腺病毒载体 （游离型）（游离型）43科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件病毒载体的改造病毒载体的改造带目标基因假病毒带目标基因假病毒包装细胞包装细胞目标基因目标基因44科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件三、人工染色
24、体载体三、人工染色体载体 酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（YACYAC）是第一个成功构建）是第一个成功构建的人工染色体载体，用于在酵母细胞中克隆大片段的人工染色体载体，用于在酵母细胞中克隆大片段外源外源DNADNA。YACYAC可接受可接受100kb100kb2 000kb2 000kb的外源的外源DNADNA片段片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。要载体。45科学出版社案例式教材生物化学课件人工染色体载体包含的调控元件人工染色体载体包含的调控元件 着丝粒：以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配着丝粒：以保证染色体在细胞分
25、裂过程中正确地分配到子代细胞。到子代细胞。端粒：作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体端粒：作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短。被核酸外切酶降解而缩短。复制起始点和限制性酶切位点。复制起始点和限制性酶切位点。YACYAC载体的两臂均带有选择标记。载体的两臂均带有选择标记。原核序列及调控元件：以便于在大肠杆菌中操作。原核序列及调控元件：以便于在大肠杆菌中操作。46科学出版社案例式教材生物化学课件第四节第四节 重组重组DNADNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克
26、隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 47科学出版社案例式教材生物化学课件一、目的基因的获得一、目的基因的获得（一）（一） 化学合成法化学合成法（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)（三）（三）从基因文库中筛选从基因文库中筛选48科学出版社案例式教材生物化学课件（一）（一） 化学合成法化学合成法要求：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列产物的氨基酸序列由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列49科学出版社案例
27、式教材生物化学课件（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应 PCR法法 RT-PCR法法（三）从基因文库中筛选（三）从基因文库中筛选 基因组基因组DNA文库文库 (genomic library) cDNA文库文库 (cDNA library)基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组所有基因组DNA的集合。的集合。50科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限
28、制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 51科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 52科学出版社案例式教材生物化学课
29、件生物化学课件二、克隆载体的选择和构建二、克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。载体的选择和改建方法也不同。 53科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件三、目的基因的体外重组三、目的基因的体外重组 DNA体外重组体外重组本质本质上是一个上是一个酶促反酶促反应应过程，在过程，在DNA连接酶的催化作用下，连接酶的催化作用下，将外源将外源DNA分子（目的基因）与载体分子（目的基因）与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程分子连接成一个重组分子的过程 54科学出版社案例式教材生物化学课件（一）黏性末端连接（一）黏性末端连接（二
30、）平末端连接（二）平末端连接（三）人工接头连接（三）人工接头连接（四）同聚物加尾连接（四）同聚物加尾连接55科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件（一）黏性末端连接（一）黏性末端连接基本方法：基本方法： 目的基因与载体分子经目的基因与载体分子经同一限制性同一限制性核酸内切酶核酸内切酶切割成具有切割成具有相同黏性末端相同黏性末端的的DNA片段后，可通过黏末端互补配对，片段后，可通过黏末端互补配对，再借助再借助DNA连接酶封闭缺口，形成完整连接酶封闭缺口，形成完整的重组的重组DNA分子分子 56科学出版社案例式教材生物化学课件Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA
31、连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接57不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体58（二）平末端连接（二）平末端连接限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端59科学出版社案例式教材生物化学课件目
32、的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连60识别序列外源DNA酶切位点酶切位点EcoR酶切Pvu酶切粘性末端粘性末端平末端平末端双酶切载体DNA连接酶61科学出版社案例式教材生物化学课件（三）人工接头连接（三）人工接头连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 62科学出版社案例式教材生物化学课件人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REc
33、o REco REco R63（四）同聚物加尾连接（四）同聚物加尾连接在在末末端端转转移移酶酶(terminal transferase) 的的作作用用下下，在在DNA片片段段末末端端加加上上同同聚聚物物序序列列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。64科学出版社案例式教材生物化学课件5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转
34、移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体565四、重组四、重组DNA分子的导入分子的导入宿主细胞应具备的条件宿主细胞应具备的条件n处于感受态处于感受态n对载体无严格限制对载体无严格限制 n限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷n不对外源不对外源DNA进行修饰进行修饰 n能表达重组体所提供表型特征能表达重组体所提供表型特征66科学出版社案例式教材生物化学课件磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE-葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔转染电穿孔转染脂质体转染脂质体转染显微注射显微注射转化转化 转染转染 感染感染67科学出版社案例式教材生物化学课
35、件生物化学课件（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（三）核酸分子杂交法（四）（四）PCR法法（五）免疫化学检测法（五）免疫化学检测法五、重组五、重组DNA分子的筛选与鉴定分子的筛选与鉴定68科学出版社案例式教材生物化学课件( (插插入入失失活活法法) ) 抗抗药药性性标标记记选选择择69筛选重组体筛选重组体pUC18 70科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件表达体系的建立：表达体系的建立： 表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达
36、产物的分离纯化六、克隆基因的表达六、克隆基因的表达71科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件其优点：其优点：简单、迅速、经济、适合大规模生产简单、迅速、经济、适合大规模生产 。 E.coli表达体系的不足：表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体；很难表达大量可溶性蛋白。很难表达大量可溶性蛋白。1. 原核表达体系原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用)72科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的
37、cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术难、费时、不经济操作技术难、费时、不经济2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）73科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件第五节重组第五节重组DNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。而认识疾病的分子机制。 疾病基因发现的两个典型例子疾
38、病基因发现的两个典型例子: 脆性脆性X综合征综合征Kallmann综合征综合征74科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件二、生二、生物制药物制药利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为有望成为2121世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。 美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组DNADNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有工程药物时代的开始。迄今为止，已有5
39、050多多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。估量的社会效益和经济效益。75科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化
40、刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱76科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件基基因因诊诊断断(genetic diagnosis
41、)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失失或或插插入入等等突突变变。又又称称DNA诊断诊断 。三、基因诊断与治疗三、基因诊断与治疗（一）基因诊断的概念（一）基因诊断的概念77科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件（二）基因治疗的概念（二）基因治疗的概念定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)78科学出版社案例式教材生物化学课件生物化学课件The End79科学出版社案例式教材生物化学课件
