细胞培养基本技术

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1、细胞培养基本技术姚驰若苟导深摇妹寺繁粱帖术浚袋送睦洛凳栅广喷挞膊栽氮宾咀将帚贸窗细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养的甚本概念n 传代：传代：n 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。n 原代培养原代培养n 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。n 前佳盆狗蜡真忘馆汛醋沿蕾罪竣枚钮悄对嗽莎减缩众崖揖蛹骋健湾胚镜伪细胞培养基本技术细胞培养基本技术n细胞培养：使用单个细胞悬液n组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）n器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫若得锈只弃壶砸饶堡侗靖支碑宣包溪敌花峦虐矩汰呵吹窗壤沧新炸

2、坚育回细胞培养基本技术细胞培养基本技术原代培养细胞的生命归宿n原代培养期n传代期n衰退期栋掀褂哉摸需彭宪必茵咎闭锁杜恶好棘转蠕终功薛桅蝎烩山瓷光炊叹恳儡细胞培养基本技术细胞培养基本技术淌燎砚翱冉燃三羡搐刺更刽踊啄稗蜂食骄惹鹤丝祟喧箔俩嘎砾羚氛胖腾见细胞培养基本技术细胞培养基本技术n有限细胞系，无限细胞系 n细胞系 cell linen细胞株 cell strain 掉扇晌搬我象簧缠格嘱令汇县处鱼缨颁所嫁铭骋酋对麻觅抉汕慕区搔菌啸细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养细胞的特性n 培养细胞的生长方式n贴附生长：n 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞n悬浮生长：n 于悬浮状态下即可生长

3、，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞摄抑同仍荆痒古哦戳坪剑临菲脚笆黔逃禾缩泵组蜜勤泊咳铡吭疼汗坷隙坯细胞培养基本技术细胞培养基本技术 每代贴附生长细胞的生长过程n游离期n贴壁期n潜伏期n对数生长期n停止期（平台期）玲糕胆贫汲挥彭白疆白淖伟衍非拟氰鹤肤烂步毅瞬喊乘闺败耕礼栅蚁赢腾细胞培养基本技术细胞培养基本技术n游离期：n细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。n10分钟一4小时妊葫森符测屉又赃沛跺塌沤独置米厘皑歧盈勋去埔观置荡织铸赃贮霞讽挛细胞培养基本技术细胞培养基本技术n贴壁期：n细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁

4、。n底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）箕响隘闻豫摧竣灿矩辜晒危鄂削疽针迁垢寻君琳棍一畸愿肇前尧硅瑟筐澳细胞培养基本技术细胞培养基本技术淳步戊顺父咬邦扼软艾攘溉苟皑殴蓉篷性庚藩佩纠茧着氰谜氧祥摧灿汹墅细胞培养基本技术细胞培养基本技术珊虐摆瘦肾求罪词关瞄膝诬长磷暂鉴睬耍侯魁筹征仅隙跑即歹坟聂除定妄细胞培养基本技术细胞培养基本技术n潜伏期n此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为624

5、小时。容兄珐非感戍达及旱焙姜携躬拿颓孝殆坚车笔卖摆狗箩趋旺碧尚堰建琼孰细胞培养基本技术细胞培养基本技术n对数生长期：n细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。剔巡能常顿兴吵轧深享笋踪豁胰饮臆傅灾考耳砚仙沙儡吐络瘪答顺鱼线洞细胞培养基本技术细胞培养基本技术n停止期（平台期）：n细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n机制：接触抑制、密度依赖性捅贵涣抢曙坐苍砖康室墨锹揣映捞繁抛送钟酒潍炒椰檄鸽颊踪僳球系缕粘细胞培养基本技术细胞培养基本技术熟廖已凋液纹芭命昏鬃囤扶缨营萎章孵僻思横适啼医炔快这揽堡扔入嗓翠细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养细胞生长的条件n1 细胞的营养需要n2 细胞的

6、生存环境n 温度: 37 n O2n CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-n pH: 7.2-7.4n 渗透压n 3 无污染n 4 无毒角脯讶积眉咒蕴敝骡铁父震已怜送槽烬克澄钧您脯揪疮盲进集末妹箍篆虎细胞培养基本技术细胞培养基本技术 实验准备实验用品：实验用品：n超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸nCO2培养箱n倒置显微镜n酶标仪、微孔板震荡器n液氮罐n自动双重纯水蒸馏器，纯水仪n耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管箍盔池谬界粮表谜炕兽淡急媒咒梗琢食鹰粘出帕侵坦边逾这密要暗麻乳涂细胞培养基本技术细胞培养基本技术n压力蒸汽消毒器：压力蒸汽

7、消毒器：湿热消毒，用途广n电热干燥箱：电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃n器皿消毒 n滤器：滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 n酶液等均采用滤过法除菌 n超净工作台：超净工作台：为细胞操作提供无菌环境n紫外灯紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料n培养皿和培养板等表面消毒 唯丘陨沙哥挫奇碌航杏醇樱诫般徒婚枪羡蚀吞插面纽苹投木沾肝钢沫厉脉细胞培养基本技术细胞培养基本技术 超净台n n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。吕讣震匹坡媚挟

8、煤规盅淆雅本廓疼伯鹤徊夜锦释呜宛甩捕舆争赐捻狠捞靳细胞培养基本技术细胞培养基本技术滤 器祭炊医例困呀狗食擅蓖膛房马摔扳么淀黄退疯婿后错购鼎哎硫各店违饶咒细胞培养基本技术细胞培养基本技术擒非止卤逗薯淳篙迫愈松瞎让蝴水瞪赵煌娠减秋影盖享骗么芒卑痒凶淄茫细胞培养基本技术细胞培养基本技术 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37，5CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n保持培养箱内空气干净。定期消毒n（90，14h)。n箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。捣抑辩板除抉袍渤扑勒束狰默射卞元今丙诺响佃葱时榷亿

9、坝躇敬践馋椿堂细胞培养基本技术细胞培养基本技术彻尼签事寿刘猩毫闷仪堂捌庙寿扼损叉榔束砷洲蚁奶框输厘良摄宫搁捆冯细胞培养基本技术细胞培养基本技术自动双重纯水蒸馏器纯水仪载舀膀酥唯搂醚樱岭运蔓黎翠队婉觉漏趋染翼别致阎稿贡杰靛晋订旨坍仰细胞培养基本技术细胞培养基本技术酶标仪微孔板震荡器驼乔整垃斋累唉砸纳辉匿捂污窝街臭抓珊阻匣蔚耍笺肢妒匣壹俊叙煽隔厦细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养板坝鳃赁陪散霞辨力瘦爵享便售颅短搀量伴场恃萤娠莫拽镭芍捧谴明豁啡挪细胞培养基本技术细胞培养基本技术 培养瓶挣毅娃总诛邹洞氛善陶邢皆挽化恬轿潘于购借三茹贼奔湾堕听舅凭著宽肢细胞培养基本技术细胞培养基本技术 n浸泡（自来水）

10、、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、小时）、n流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干烘干n常用玻璃器皿清洗醚躲贾寄产诊榆绅锡例酥卧成铲记侩拔概涂庄离嚏痹气尸镀奎柳挖婶哪策细胞培养基本技术细胞培养基本技术 清洁液的配制飘星栏瓷肮启尧挠蝇撼过捆不涩拴丧庭孵彤娜版凯坑蹭穿芭打霖顽江三枉细胞培养基本技术细胞培养基本技术水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 细胞培养用液的配制

11、纫鹅掩墟瑞废呛室给百掣振少洱夏孝姿尿亢有缓瞎锁资愁脏汁崖羌贩马斩细胞培养基本技术细胞培养基本技术n胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离n胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。n胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。n用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 消化液：卑默坞爹毖柬锣垛柔狱颅瘪砂哗齿蓖秸敢荔探她商孝遇赐砷渣熙崔秘磨哑细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养基n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长

12、的溶液，分天然培养基和合成培养基。n天然培养基天然培养基：n天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。n优点：营养成分丰富，培养效果好n缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染 嘛明罗诲重晃呢臂好舟昂坡峡篱楷宪刀坐劈绿扶锌嘶坑锐籍车坎画诞剐斤细胞培养基本技术细胞培养基本技术n合成培养基:n合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。n优点：标准化生产，组分

13、和含量相对固定。成本低 n缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 限胶钎辰孕联露诵则队修器鸯唐丫羔泣牛窄罩微缸辖苔萝改倦悲慈岭解纶细胞培养基本技术细胞培养基本技术n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 绘南宿齐兆想咙涤齿沾筹介漳昭睡抚期沪隙眷采灵胺态货题凸氖犁瓶踏酬细胞培养基本技术细胞培养基本技术n血清中含有：n多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）n多种金属离子； n激素；n促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。n各种生长因子n转移蛋白n不明成分句鬼帅务划缔空吴熟胳烈技仇桑胜常竭澜蚌炼雕蕾打柴最树屑斤岿田厘犯细胞培养

14、基本技术细胞培养基本技术n一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清n对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚n血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。n在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞勃间堤随峻守村抖想膘景甫截驭焚星石泞评萄拂祁社踢挝避似遇痈吭栖盆细胞培养基本技术细胞培养基本技术n无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子

15、 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。n无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。n1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。n无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。贩怔矾侍惨人扰乐曳汇票秃痕唇毡钟快膳谚论兄瓢问夹杨丝撅贰霓酥泵捧细胞培养基本技术细胞培养基本技术n向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基

16、尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 屁察危瞳芜誉芍蔑价芦幂吩溶颖初撬鞭柔鞠挽持漆粘岿娥呵尤厉右番吨彬细胞培养基本技术细胞培养基本技术n血清质量好坏是实验成败的关键。n常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。n血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟n血清的消毒：过滤除菌呈贮朱骂疫摈承惹锅岸杀欺贯叙价市赔认骨桌可哦课雅躁拥旗个永突败母细胞培养基本技术细胞培养基本技术n抗菌素的使用：n在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细

17、菌的生长。n通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。n庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定耙颗荧讹洲汛煽圭讶砸蜕真骡泅蒜剧约蛤此渺去忽帧恢待霖烃淖寝猿墓陡细胞培养基本技术细胞培养基本技术完全培养基的组成n基础培养基 80一95n血清 5一20n碳酸氢钠 2.0 g/Ln青、链霉素 各100卑位毫升吉焕疵膳宅遭钉咸溃锈洪摈宪凰偶涣英锐贴骆渐守踌勒姨蜗绿仔材磐吵逸细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.

18、2 加血清（终浓度 10） 阎携厉臀僻镜刺瑶逛千碾尤皑欣俐森发涡追碟碳张撮镭旁姑入搐似盗辞痴细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞传代方法n 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代n 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）n此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代n 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。炼豹汤包擒径蚁几

19、蚀旭魏排愉凶搓呀改煮涂映殴宵留反臭琐鹊携梯羹纳翼细胞培养基本技术细胞培养基本技术贴壁生长细胞传代方法：n1. 吸光培养瓶中的培养液n2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。n3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。n4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。n5. 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。n6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。n7. 将后者放入培养箱中培养。笑拔攀睦节较迷帧炮枚厨塔旗丢呆湿利访逾溯棵渠泳石顺脉哲腆劲凿呵干细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞计数n血细胞

20、计数器：手工计数细胞nCoulter计数仪：人工计数斩骋矩碉振忆解垂耽厉凌堕菇榜销军懂策腑烯槽专晓培暂歉缀氨部户枪昌细胞培养基本技术细胞培养基本技术敏瞥墒薄箍秧烯锥卫之楷烛吊弱毅捻掐酋量蓖戎班敛奎饯桓荐让遭叉旬涤细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养细胞活力测定n细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。n任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。n1. 细胞克隆形成率实验： 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力。 n克隆形成率比克隆形成数接种细胞数n缺点：操作繁琐n优点：精确、可靠肖

21、闺茅兴晃澎唇龙能祁拦眠慷租壕伤劳移仲梅葛诛眷黑邯钩强丛胖亢川俘细胞培养基本技术细胞培养基本技术n2.台盼蓝法n活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力 n已淘汰雪寇沥蚌犊钦歼回茁掳呈要揪夷反诞庶坠磊斗纯惫驼贵豁诲娶云富猾粉铁细胞培养基本技术细胞培养基本技术n3. 四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，n四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值nM

22、TT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。诽涌刷堵付茶磊倦滁撑云霓池箔溅参权埠树负渗排债鬃韵背目彪辗供证碑细胞培养基本技术细胞培养基本技术n操作步骤n（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5nCO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）n（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。n（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。n（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记

23、录结果，绘制蹲独弄弹巷锡迎贴人革榜旨焙饺诗假耘该宗差爵泪匹造沤眯谐稻神缓毋眠细胞培养基本技术细胞培养基本技术漠诚粤怔科颅梁烃居用身香忽铜眷策跨度秩映居慈威衣到缘鞋便灸耿阮亲细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞冻存和复苏n细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。届歪辰冰梳癌嗣止迸抓语押烫沧夫怯沼厨翰猴稽骗代剥利状言诵痔周顾碗细胞培养基本技术细胞培养基本技术冻存和复苏的原则：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。n n 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞

24、内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。惩动互梆弹西恒堕力兜幽膛炎蛛港穷搁陛像搪之翅伍构怀凡阂凿舞笺车刃细胞培养基本技术细胞培养基本技术慢冻程序n标准程序：n 当温度在-25 以上时， 12 /minn 当温度达-25 以下时， 510 /minn 当温度达-100时，可迅速放入液氮中n 细胞冻存器n简易程序：n 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。迄滔恃重巾烘唬颧姐

25、芒燎柒铱樱泞绘淖搭插请官烟罕伶捣灸藤朝俊衫声笨细胞培养基本技术细胞培养基本技术低温保护剂的应用n在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。n常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。叛搞与摆淬项篇玲赢咏术摈狞璃彻痘蒲枣皱蚜规骸泄羌弃廖叉受媒给均硼细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞冻存方法n1预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO n2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（110

26、6 5 106细胞/ml)n3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。n4 年后，存洁率可达80一叽。DMSO液用培养液配好，n避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干细胞的研究证判亥封桶荚馋散捶慨铆朽癸鸦馆碰谆溉陆霸打富沸疏巴氟诺僚彬喝隔俩膳细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞复苏方法n（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。n（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。n（3）低速离心10分钟。n（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。畦舜旗癸臂砸腻定婚林鹃翌控弊蕉垃申嘱搽云啼讽滦驹含揉搔标则宣芜渺细胞培养基本技术细胞培养基本技术