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1、第十章第十章蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第一节第一节概述概述一一一一. .蛋白质概况蛋白质概况蛋白质概况蛋白质概况 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是是是生生生生命命命命的的的的物物物物质质质质基基基基础础础础，是是是是构构构构成成成成生生生生物物物物体体体体细细细细胞胞胞胞组组组组织织织织的的的的重重重重要要要要成成成成分分分分，是是是是生生生生物物物物体体体体发发发发育育育育及及及及修修修修补补补补组组组组织织织织的的的的原原原原料料料料，一一一一切切切切有有有有生生生生命命命命的的的的活活活活体体体体都都都都含含含含有有有有不不不不同同同同类类类类型型型型的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质
2、质质质。人人人人体体体体内内内内的的的的酸酸酸酸碱碱碱碱平平平平衡衡衡衡、水水水水平平平平衡衡衡衡的的的的维维维维持持持持、遗遗遗遗传传传传信信信信息息息息的的的的传传传传递递递递、物物物物质质质质的的的的代代代代谢谢谢谢及及及及转转转转运运运运都都都都与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质有有有有关关关关。人人人人及及及及动动动动物物物物只只只只能能能能从从从从食食食食品品品品得得得得到到到到蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质及及及及其其其其分分分分解解解解物物物物，来来来来构构构构成成成成自自自自身身身身的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，故故故故蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是是是人人人人体体体体重重重重要要
3、要要的的的的营营营营养养养养物物物物质质质质，也也也也是是是是是是是是食食食食品品品品的的的的重重重重要要要要组组组组成成成成之之之之一一一一。一一一一个个个个食食食食品品品品的的的的营营营营养养养养高高高高低低低低，主主主主要要要要看看看看蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量的的的的高高高高低低低低。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质除除除除了了了了保保保保证证证证食食食食品品品品的的的的营营营营养养养养价价价价值值值值外外外外，在在在在决决决决定定定定食食食食品品品品的的的的色色色色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。香、味及结构等特征上也起着重要的作用。香、味及结构等特征上也起着重要的作用
4、。香、味及结构等特征上也起着重要的作用。夺鲜民僵查撩秸贱忆牌厉仁杨终坐迹不陀卑叁山姆身疡坯儿龋品擦绒娱川蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（一）蛋白质组成与分类（一）蛋白质组成与分类（一）蛋白质组成与分类（一）蛋白质组成与分类1.1.组成组成组成组成CompositionComposition蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结
5、合在一型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要组成元素是起的大分子化合物，它主要组成元素是起的大分子化合物，它主要组成元素是起的大分子化合物，它主要组成元素是CC、HH、OO、N N、S S、P P。另外还有一些微量元素。另外还有一些微量元素。另外还有一些微量元素。另外还有一些微量元素FeFe、ZnZn、I I、CuCu、MnMn。对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的元素组成百分比。数据可以得
6、到近似的蛋白质的元素组成百分比。数据可以得到近似的蛋白质的元素组成百分比。数据可以得到近似的蛋白质的元素组成百分比。元素组成百分比：元素元素组成百分比：元素元素组成百分比：元素元素组成百分比：元素CHONSPCHONSP百分比百分比百分比百分比50723160-30-350723160-30-3一般来说，蛋白质的平均含氮量为一般来说，蛋白质的平均含氮量为一般来说，蛋白质的平均含氮量为一般来说，蛋白质的平均含氮量为16%16%，所以在，所以在，所以在，所以在用凯氏定氮法定量蛋白质时，将测得的总氮用凯氏定氮法定量蛋白质时，将测得的总氮用凯氏定氮法定量蛋白质时，将测得的总氮用凯氏定氮法定量蛋白质时，
7、将测得的总氮%乘上蛋白乘上蛋白乘上蛋白乘上蛋白质的换算参数质的换算参数质的换算参数质的换算参数K=6.25K=6.25即为该物质的蛋白质含量。即为该物质的蛋白质含量。即为该物质的蛋白质含量。即为该物质的蛋白质含量。凤孽焦秘侨斧呜铀琶裙味阂戊诚详装迟姐跑返右磺醇硼辫矿札袋渠翟贰响蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定2. 2.按蛋白质的营养价值可将蛋白质分为以下三类：按蛋白质的营养价值可将蛋白质分为以下三类：按蛋白质的营养价值可将蛋白质分为以下三类：按蛋白质的营养价值可将蛋白质分为以下三类：完全蛋白质完全蛋白质完全蛋白质完全蛋白质：这是一种质量优良的蛋白质，含：这是一种质量优良的蛋白质，含：这
8、是一种质量优良的蛋白质，含：这是一种质量优良的蛋白质，含有人体必需氨基酸，并且所含种类齐全，数量有人体必需氨基酸，并且所含种类齐全，数量有人体必需氨基酸，并且所含种类齐全，数量有人体必需氨基酸，并且所含种类齐全，数量充足，比例合适，不但能够维持人的生命与健充足，比例合适，不但能够维持人的生命与健充足，比例合适，不但能够维持人的生命与健充足，比例合适，不但能够维持人的生命与健康，而且能促进婴幼儿的生长发育。如奶类中康，而且能促进婴幼儿的生长发育。如奶类中康，而且能促进婴幼儿的生长发育。如奶类中康，而且能促进婴幼儿的生长发育。如奶类中的酪蛋白、大豆蛋白及小麦中的麦谷蛋白等，的酪蛋白、大豆蛋白及小麦
9、中的麦谷蛋白等，的酪蛋白、大豆蛋白及小麦中的麦谷蛋白等，的酪蛋白、大豆蛋白及小麦中的麦谷蛋白等，都是人体所必须的完全蛋白质。都是人体所必须的完全蛋白质。都是人体所必须的完全蛋白质。都是人体所必须的完全蛋白质。半完全蛋白质半完全蛋白质半完全蛋白质半完全蛋白质：此类蛋白质中，所含必需氨基：此类蛋白质中，所含必需氨基：此类蛋白质中，所含必需氨基：此类蛋白质中，所含必需氨基酸种类比较齐全，但含量低，相互间的比例又酸种类比较齐全，但含量低，相互间的比例又酸种类比较齐全，但含量低，相互间的比例又酸种类比较齐全，但含量低，相互间的比例又不合适。如果在膳食中以它作为唯一的蛋白质不合适。如果在膳食中以它作为唯一
10、的蛋白质不合适。如果在膳食中以它作为唯一的蛋白质不合适。如果在膳食中以它作为唯一的蛋白质来源，可以维持生命，但不能促进机体的生长来源，可以维持生命，但不能促进机体的生长来源，可以维持生命，但不能促进机体的生长来源，可以维持生命，但不能促进机体的生长发育。例如大麦、小麦中的麦胶蛋白。发育。例如大麦、小麦中的麦胶蛋白。发育。例如大麦、小麦中的麦胶蛋白。发育。例如大麦、小麦中的麦胶蛋白。昆北罕增菲糠诊劳欢陇阔憨旅涤能斌拖拽毫求淹搜润辨寝葫盆澜嚣挑迸涝蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定不完全蛋白质不完全蛋白质不完全蛋白质不完全蛋白质：这类蛋白质中所含必需氨基酸：这类蛋白质中所含必需氨基酸：这类蛋
11、白质中所含必需氨基酸：这类蛋白质中所含必需氨基酸的种类不全，如果在膳食中把它作为唯一的蛋的种类不全，如果在膳食中把它作为唯一的蛋的种类不全，如果在膳食中把它作为唯一的蛋的种类不全，如果在膳食中把它作为唯一的蛋白质来源，既不能促进机体的生长发育，也难白质来源，既不能促进机体的生长发育，也难白质来源，既不能促进机体的生长发育，也难白质来源，既不能促进机体的生长发育，也难以维持生命。例如玉米中的玉米胶蛋白、豌豆以维持生命。例如玉米中的玉米胶蛋白、豌豆以维持生命。例如玉米中的玉米胶蛋白、豌豆以维持生命。例如玉米中的玉米胶蛋白、豌豆中的豆球蛋白，动物结缔组织和肉皮中的胶原中的豆球蛋白，动物结缔组织和肉皮
12、中的胶原中的豆球蛋白，动物结缔组织和肉皮中的胶原中的豆球蛋白，动物结缔组织和肉皮中的胶原蛋白等。蛋白等。蛋白等。蛋白等。3.3.食品中蛋白质的氨基酸组成食品中蛋白质的氨基酸组成食品中蛋白质的氨基酸组成食品中蛋白质的氨基酸组成上面我们已讲了蛋白质是由氨基酸组成的上面我们已讲了蛋白质是由氨基酸组成的上面我们已讲了蛋白质是由氨基酸组成的上面我们已讲了蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达高分子化合物，目前各种氨基酸已达高分子化合物，目前各种氨基酸已达高分子化合物，目前各种氨基酸已达175175种以种以种以种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的
13、上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的2020种，按照种，按照种，按照种，按照-氨基酸侧链氨基酸侧链氨基酸侧链氨基酸侧链R R R R基团的结构可分为：基团的结构可分为：基团的结构可分为：基团的结构可分为：拘氖牙各勺辐梨秘计震京烬翅豢抒阉伯丢沮庸亮键仆鹰芦戚琳饭兑景濒葫蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定脂肪族类：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脂肪族类：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。亮氨酸、异亮氨酸。羟基类：丝氨酸、苏氨酸羟基类：丝氨酸、苏氨酸酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸碱性氨基酸：赖
14、氨酸、精氨酸、组氨酸酰胺类：天冬酰胺、谷氨酰胺酰胺类：天冬酰胺、谷氨酰胺含硫类：半胱氨酸、蛋氨酸含硫类：半胱氨酸、蛋氨酸芳香族类：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸芳香族类：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸亚氨基酸：脯氨酸亚氨基酸：脯氨酸考涡右三通橱才损拱挪款屏孪遂靶锐蓖勃晃琶规阉膨献孝魏挪椭腿财央值蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定在构成构成蛋白质的氨基酸中，亮氨在构成构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠从食品摄酸在人体中不能合成，必须依靠从食品
15、摄入，故被称为必需氨基酸，它们对人体有入，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能。着极其重要的生理功能。限制氨基酸限制氨基酸：是指食物蛋白质中一种：是指食物蛋白质中一种或几种必需氨基酸缺少或数量不足，就会或几种必需氨基酸缺少或数量不足，就会使食物蛋白质合成为机体蛋白质的过程受使食物蛋白质合成为机体蛋白质的过程受到限制，亦即限制了此种蛋白质的营养价到限制，亦即限制了此种蛋白质的营养价值，这类氨基酸就称为。值，这类氨基酸就称为。顽液桥搞尼愧下磊戏以挡靶瞩震轰刚裁胳勤搂玉电侗马冲眷板险兔坚旅码蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定按易缺少数量多少的顺序排列，称按易缺少数量多少的顺序排
16、列，称为第一限制氨基酸、第二等等。如大为第一限制氨基酸、第二等等。如大豆第一限制氨基酸为蛋氨酸。大米第一豆第一限制氨基酸为蛋氨酸。大米第一限制氨基酸为限制氨基酸为lys，第二限制氨基酸为，第二限制氨基酸为thr.评价某种蛋白质的营养价值包括两评价某种蛋白质的营养价值包括两个方面：一是各种必需氨基酸含量是否个方面：一是各种必需氨基酸含量是否丰富，二是必需氨基酸的构成是否符合丰富，二是必需氨基酸的构成是否符合一定比例。一定比例。灭杖第安响驶哺鹃莲我角帕七卜魂妊览航攻饰滩暗惭梦霸毫萨璃毁彝脐印蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（二）各种食品中蛋白质的含量及测定意义（二）各种食品中蛋白质的含量及
17、测定意义1. 1.含量含量含量含量由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均匀的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动匀的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动匀的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动匀的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高，豆类含
18、蛋白质最高。含量高，豆类含蛋白质最高。含量高，豆类含蛋白质最高。含量高，豆类含蛋白质最高。如黄豆蛋白质含量在如黄豆蛋白质含量在如黄豆蛋白质含量在如黄豆蛋白质含量在40%40%。牛肉中蛋白质含量为牛肉中蛋白质含量为牛肉中蛋白质含量为牛肉中蛋白质含量为20.0%20.0%左右，左右，左右，左右，猪肉猪肉猪肉猪肉9.5%9.5%，兔肉兔肉兔肉兔肉21%21%，鸡肉鸡肉鸡肉鸡肉20%20%，牛乳牛乳牛乳牛乳3.5%3.5%，带鱼带鱼带鱼带鱼18.0%18.0%， 面粉面粉面粉面粉9.9%9.9%， 菠菜菠菜菠菜菠菜2.4%2.4%，黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜1.0%1.0%，苹果苹果苹果苹果1.4%1.4%缕讥
19、验遭丛潍滥孝砖宝忻坤托骡弃瘩飞戏撵辫疤学菏锈咆遂庭邯坠伎级诞蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定2.测定意义测定意义测定食品中蛋白质的含量，对于评测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有及指导经济核算及生产过程控制均具有及其重要的意义。其重要的意义。蛋白质蛋白质是评价食品质量高低的指标，是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。如果膳食中蛋白质还关系到人体健康。如果膳食中蛋白质长期不足，将出现负氮平衡，也就是说长期不足，将出现负氮平
20、衡，也就是说每天体内的排出氮大于抗体摄入氮，这每天体内的排出氮大于抗体摄入氮，这样造成消化吸收不良导致腹泻等。但是样造成消化吸收不良导致腹泻等。但是摄入量过多会引起机体肝、肾病变。摄入量过多会引起机体肝、肾病变。樊愉抓拍梁携靠害蹲圭暮酝哟拜反狰唬兵砷柠绑恿椿它诫键飘明骨验滨贩蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定盾著骑憎薄陀熙连沛体惑情瑶拙烩董娠赵溺铱锌噎宁被捶膨椅被背持易闪蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定二二二二. .蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的测测测测定定定定方方方方法法法法分分分分为为为为两两两两大大大大类类
21、类类：一一一一类类类类是是是是利利利利用用用用蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的共共共共性性性性，即即即即利利利利用用用用含含含含氮氮氮氮量量量量，肽肽肽肽键键键键等等等等测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量，另另另另一一一一类类类类是是是是利利利利用用用用蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质中中中中特特特特定定定定氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸残残残残基基基基、酸酸酸酸、碱碱碱碱性性性性基基基基团和芳香基团测定蛋白质含量。团和芳香基团测定蛋白质含量。团和芳香基团测定蛋白质含量。团和芳香基团测定蛋白质含量。 但但但但是是是是食食食食品品品品种种种种类类类类很很很很多多多多，食食食食品品品品中中
22、中中蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量又又又又不不不不同同同同，特特特特别别别别是是是是其其其其他他他他成成成成分分分分如如如如碳碳碳碳水水水水化化化化合合合合物物物物，脂脂脂脂肪肪肪肪和和和和维维维维生生生生素素素素等等等等干干干干扰扰扰扰成成成成分分分分很很很很多多多多，故故故故蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的测测测测定定定定最最最最常常常常用用用用的的的的方方方方法法法法是是是是凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮法法法法。它它它它是是是是测测测测定定定定总总总总有有有有机机机机氮氮氮氮的的的的最最最最准准准准确确确确和和和和操操操操作作作作较较较较简简简简便便便便的的的的方方方方法法
23、法法之之之之一一一一，在在在在国国国国内内内内外外外外应应应应用用用用普普普普遍遍遍遍。由由由由于于于于食食食食品品品品中中中中蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量不不不不同同同同又又又又分分分分为为为为凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮常常常常量量量量法法法法、半半半半微微微微量量量量法法法法和和和和微微微微量量量量法法法法，但但但但它它它它们的基本原理都是一样的。们的基本原理都是一样的。们的基本原理都是一样的。们的基本原理都是一样的。祈瞥蟹豫读忧泞绚银朽眯刮锰前经恰濒拍娄动境辫鸿男羚虎叛处屁肆淑耍蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般鉴于食品中氨基酸
24、成分的复杂性，在一般鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通常采用酸碱滴定法测定。常采用酸碱滴定法测定。常采用酸碱滴定法测定。常采用酸碱滴定法测定。色谱技术的发展则为各种氨基酸的分离、色谱技术的发展则为各种氨基酸的分离、色谱技术的发展则为各种氨基酸的分离、色谱技术的发展则为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力的工具，近年世界上已鉴定及定量提供了有力的工具，近年世界上已鉴定及定量提供了有力的工具，近年世界
25、上已鉴定及定量提供了有力的工具，近年世界上已出现多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定出现多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定出现多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定出现多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定量氨基酸的理想成为现实。另外利用近红外反量氨基酸的理想成为现实。另外利用近红外反量氨基酸的理想成为现实。另外利用近红外反量氨基酸的理想成为现实。另外利用近红外反射分析仪，输入各类氨基的软件，通过电脑控射分析仪，输入各类氨基的软件，通过电脑控射分析仪，输入各类氨基的软件，通过电脑控射分析仪，输入各类氨基的软件，通过电脑控制进行自动检测和计算，也可以快速、准确的制进行自动检测和计算，也可以快速、准
26、确的制进行自动检测和计算，也可以快速、准确的制进行自动检测和计算，也可以快速、准确的测出各种氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋测出各种氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋测出各种氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋测出各种氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测定方法。白质和氨基酸测定方法。白质和氨基酸测定方法。白质和氨基酸测定方法。溢陀宠舀湖阉来互而斋棘侈行执庐盲疫赘盆吮拓攫卖涉呈酗搁乡施拓限涩蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第二节第二节蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定关于氮关于氮-蛋白质换算系数蛋白质换算系数对于氮含量换算成蛋白质含量的系数，历来采用对于氮含量换算成蛋白质含量的系数，历
27、来采用6.25，这个数值是以蛋白质平均含氮而导出的数值，但是食品，这个数值是以蛋白质平均含氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，因食品种类不同，差别是很大的，我们在中含氮的比例，因食品种类不同，差别是很大的，我们在测定蛋白质时，应该是不同的食品采用不同的换算等数，测定蛋白质时，应该是不同的食品采用不同的换算等数，一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查，蛋一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查，蛋=6.25，肉，肉=6.25，牛乳，牛乳=6.38，稻米，稻米=5.95，大麦，大麦=5.83，玉米，玉米=6.25，小麦，小麦=5.83，麸皮，麸皮=6.31，面粉，面粉=5.70，如果手册上，如
28、果手册上查不到的样品则可用查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的，一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。换算等数以何物代替。对于用各种原料混合制成的食品，采用占总氮量多的对于用各种原料混合制成的食品，采用占总氮量多的原料为换算系数，对于一些组成成分不明确的食品可采用原料为换算系数，对于一些组成成分不明确的食品可采用6.25，我们在作实验报告时，一定要注明所用的换算系数。，我们在作实验报告时，一定要注明所用的换算系数。误巨锰齐无冀挛瑰吱挖易乱翁衅卷嫩蘑澳狂包肺刽疙醛邀孔哀繁里樱拾聋蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法一、凯氏定
29、氮法 由由由由KieldhlKieldhlKieldhlKieldhl于于于于1833183318331833年年年年提提提提出出出出，现现现现发发发发展展展展为为为为常常常常量量量量、微微微微量量量量、自自自自动动动动定定定定氮氮氮氮仪仪仪仪法法法法，半半半半微微微微量量量量法法法法及及及及改改改改良良良良凯凯凯凯氏氏氏氏法法法法, , , ,可可可可应应应应用用用用于于于于各各各各类类类类食食食食品品品品中中中中蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量的的的的测测测测定定定定。这这这这里里里里只只只只介介介介绍前三种。绍前三种。绍前三种。绍前三种。（一）常量凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法（
30、一）常量凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法1.1.原原原原理理理理：样样样样品品品品与与与与浓浓浓浓硫硫硫硫酸酸酸酸和和和和催催催催化化化化剂剂剂剂一一一一同同同同加加加加热热热热消消消消化化化化，使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分解解解解，其其其其中中中中碳碳碳碳和和和和氢氢氢氢被被被被氧氧氧氧化化化化为为为为二二二二氧氧氧氧化化化化碳碳碳碳和和和和水水水水逸逸逸逸出出出出，而而而而样样样样品品品品中中中中的的的的有有有有机机机机氮氮氮氮转转转转化化化化为为为为氨氨氨氨与与与与硫硫硫硫酸酸酸酸结结结结合合合合成成成成硫硫硫硫酸酸酸酸铵铵铵铵。然然然然后后后后加加加加碱碱碱碱蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏
31、，使使使使氨氨氨氨蒸蒸蒸蒸出出出出。再再再再用用用用HH3 3BOBO3 3吸吸吸吸收收收收后后后后再再再再以以以以标标标标准准准准HClHCl溶溶溶溶液液液液滴滴滴滴定定定定。根根根根据据据据标标标标准准准准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量酸消耗量可以计算出蛋白质的含量酸消耗量可以计算出蛋白质的含量酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。撅戈民操蹈漆瘩稍侩巨张蕾完隐恢痹缀怜瞄随赘碎栈涡透抉绵铸邻扁专荚蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 消化消化消
32、化消化总反应式：总反应式：总反应式：总反应式：2NH2NH2 2（CHCH2 2）2 2COOH+13HCOOH+13H2 2SOSO4 4 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4+6CO+6CO2 2+12SO+12SO2 2+16H+16H2 2OO 一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%98%），浓硫酸具有脱水性，使），浓硫酸具有脱水性，使），浓硫酸具有脱水性，使），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化浓硫
33、酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：2H2H2 2SOSO4 4+C+CCOCO2 2+2SO+2SO2 2+2H+2H2 2OO二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶氧化硫，氨随之
34、与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。液中。液中。液中。在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：消化时间，常加入下列物质：消化时间，常加入下列物质：消化时间，常加入下列物质：露幼截歧缺州转胸太啊瘟捡臀抉廉派羡谆壮旱隆事供擒忍虽消陋寓佯广纪蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定加硫酸钾加硫酸钾加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物作为增温剂，提高溶液沸点而加
35、快有机物作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸沸点一般纯硫酸沸点一般纯硫酸沸点一般纯硫酸沸点340340，加入硫酸钾（，加入硫酸钾（，加入硫酸钾（，加入硫酸钾（16891689）之后）之后）之后）之后可以提高至可以提高至可以提高至可以提高至400400以上。原因主要在于随着消化过程中以上。原因主要在于随着消化过程中以上。原因主要在于随着消化过程中以上。原因主要在于随着消化过程中硫酸不断的被分解，水分不断逸
36、出而使硫酸钾浓度增硫酸不断的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增硫酸不断的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增硫酸不断的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：大，故沸点升高，其反应式如下：大，故沸点升高，其反应式如下：大，故沸点升高，其反应式如下：KK2 2SOSO4 4+H2 2SO44=2KHSO4 42KHSO44KK2 2SOSO4 4+H+H2 2O+SOO+SO3 3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵
37、盐发生热分解放出氨而造成高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失：损失：损失：损失： （NH4NH4）2 2SOSO4 4 NHNH3 3+（NHNH4 4）HSOHSO4 4 想币锅类副捶周郎萌钳孪悸掉邪熬沾称岗鼠趟虾缓胳腋砷啼昌敖免柯锤属蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定2（NH4）HSO4NH3+SO3+H2O也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。果不如硫酸钾。加硫酸铜加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终作为催化剂。还可以作消化终点
38、指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。硫酸铜点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。硫酸铜的作用机理如下：的作用机理如下：C+2CuSO4Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+22SO42CuSO4+SO2+2H2O襟衣焕榔埠洼驹沮膜计扎刊奴硕真垣宿胺揽漱决曰里裴驳骸顷侥勉胁沙量蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定此反应不断进行，待有机物全部被消化完此反应不断进行，待有机物全部被消化完此反应不断进行，待有机物全部被消化完此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜生成（褐色），溶液呈现后，不再有硫酸亚铜生成（褐色），溶液呈现后，不再有硫酸亚铜生成（褐色），溶液呈现后，不再有硫酸亚铜生成（褐色
39、），溶液呈现清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。除硫酸铜外还可以加作为碱性反应的指示剂。除硫酸铜外还可以加作为碱性反应的指示剂。除硫酸铜外还可以加作为碱性反应的指示剂。除硫酸铜外还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧氧化汞、汞（均有毒，
40、价格贵）、硒粉、二氧氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛等，应用最广泛的是硫酸铜。化钛等，应用最广泛的是硫酸铜。化钛等，应用最广泛的是硫酸铜。化钛等，应用最广泛的是硫酸铜。加氧化剂加氧化剂加氧化剂加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。但要防止氨进一步氧化为氮。一物氧化速度。但要防止氨进一步氧化为氮。一物氧化速度。但要防止氨进一步氧化为氮。一物氧化速度。但要防止氨进一步氧化为氮。一般说来，若有足够的其他还原剂，如碳，则添般说来，若有足够的其他还原剂，如碳，则添般说来，若有足够的其他还原剂，如
41、碳，则添般说来，若有足够的其他还原剂，如碳，则添加氧化剂不致使测定结果偏低。目前使用双氧加氧化剂不致使测定结果偏低。目前使用双氧加氧化剂不致使测定结果偏低。目前使用双氧加氧化剂不致使测定结果偏低。目前使用双氧水较多，但必须注意须待消化液完全冷却后再水较多，但必须注意须待消化液完全冷却后再水较多，但必须注意须待消化液完全冷却后再水较多，但必须注意须待消化液完全冷却后再加入。加入。加入。加入。梢颐囱认谊沛他奢渝狐另身鄂葵厩足吮蹄傅浓掖摇冷历看障晾鳖鹰复递邓蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定仪器：凯氏消仪器：凯氏消化装置。化装置。100页页要防止要防止爆沸。爆沸。幻灯片21流札侵谋埠猜睦霞碎尔
42、唤串多苟勉灵尖壤酿滁承屯遵沁茫捎潮耶嘘绪蓟寺蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定2.2.蒸馏蒸馏消化液消化液+40%+40%氢氧化钠加热氢氧化钠加热蒸馏，放出氨蒸馏，放出氨气。气。幻灯片幻灯片2222逸耶盒凄属蚤谱恳穷秸沟那垃渴毋丹又鞠煮路绸遥趁睹欧摔湍晦凳童淡扎蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定3.3.吸收与滴定吸收与滴定吸收与滴定吸收与滴定用用用用4%4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红剂用混合指示剂（甲基红剂用混合指示剂（甲基红剂用混合指示剂（甲基红溴甲
43、基酚绿混合指溴甲基酚绿混合指溴甲基酚绿混合指溴甲基酚绿混合指示剂，国标用亚甲基兰示剂，国标用亚甲基兰示剂，国标用亚甲基兰示剂，国标用亚甲基兰+ +甲基红）。甲基红）。甲基红）。甲基红）。 指示剂指示剂指示剂指示剂 紫红色紫红色紫红色紫红色绿色绿色绿色绿色淡紫红淡紫红淡紫红淡紫红（酸）（酸）（酸）（酸）（碱）（碱）（碱）（碱）（酸）（酸）（酸）（酸）用过量的用过量的用过量的用过量的HH2 2SOSO44或或或或HClHCl标准溶液吸收，再标准溶液吸收，再标准溶液吸收，再标准溶液吸收，再用用用用NaOHNaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红标准溶液滴定过剩的酸液，
44、用甲基红标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。（指示剂。（指示剂。（指示剂。（pH4.8pH4.86.06.0红红红红黄黄黄黄 ）吸收吸收滴定滴定黎莲匀蛋毁埠谁养篙樱沁幸桔僻硅蜕涝依居住错扯淀版瓦判浴垫征渭咬找蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n n操作步骤：操作步骤：准确称取固体样品准确称取固体样品0.20-2.00g（半固（半固体体25g，液体样品，液体样品1020ml）于于500ml凯氏瓶中凯氏瓶中加加10g无水无水K2SO4加加0.5gCuSO4加加20mlH2SO4轻轻摇匀后轻轻摇匀后连接消化装置，在通风橱中先以小火加连接消化装置，在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火
45、力，消化至热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中炭粒溶于硫酸中继续消化继续消化至到样液至到样液呈蓝绿色透明时再消化呈蓝绿色透明时再消化30分钟，停止消分钟，停止消化，冷却化，冷却加加200ml水水幻灯片幻灯片18棍墩离乌态静袱道爸姆嵌氮丽待妹皆瞧苯删疡矮谤软乘匹接蜕箕夕缎赎戳蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定连接蒸馏装置连接蒸馏装置连接蒸馏装置连接蒸馏装置用硼酸作吸收液用硼酸作吸收液用硼酸作吸收液用硼酸作吸收液在在在在KK氏烧瓶氏烧瓶氏烧瓶氏烧瓶中加玻璃珠数粒和中加玻璃珠数粒和中加玻璃珠数粒和中加玻璃珠数粒和8
46、0ml40%NaOH80ml40%NaOH摇动凯氏摇动凯氏摇动凯氏摇动凯氏瓶至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再瓶至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再瓶至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再瓶至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再加入加入加入加入100ml100ml蒸馏水，夹紧夹子蒸馏水，夹紧夹子蒸馏水，夹紧夹子蒸馏水，夹紧夹子加热蒸馏加热蒸馏加热蒸馏加热蒸馏至至至至氨全部蒸出（馏出液约氨全部蒸出（馏出液约氨全部蒸出（馏出液约氨全部蒸出（馏出液约250ml250ml即可），将冷凝即可），将冷凝即可），将冷凝即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管
47、口，继续蒸管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏馏馏馏1 1分钟，以奈氏试剂检查馏出液，如无红棕分钟，以奈氏试剂检查馏出液，如无红棕分钟，以奈氏试剂检查馏出液，如无红棕分钟，以奈氏试剂检查馏出液，如无红棕色物生成，则蒸馏完毕，可停止加热色物生成，则蒸馏完毕，可停止加热色物生成，则蒸馏完毕，可停止加热色物生成，则蒸馏完毕，可停止加热用用用用0.1MHCl0.1MHCl滴定至蓝色变为微红色即为终点。滴定至蓝色变为微红色即为终点。滴定至蓝色变为微红色即为终点。滴定至蓝色变为微红色即为终点。n2.蒸馏消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。聚咒奴烦究剥豹豌
48、脾跺闽碰架武奈颈伦贞宇爹宝筛瘟狡肢熔颁阉偿况就梭蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定奈氏试剂奈氏试剂奈氏试剂奈氏试剂NesslerNessler试剂，试剂，试剂，试剂，KK2 2（HgIHgI4 4） 检验检验检验检验NHNHNHNH4 4 4 4+ + + +离子，遇铵根，离子析离子，遇铵根，离子析离子，遇铵根，离子析离子，遇铵根，离子析 出黄色或红棕色沉淀。出黄色或红棕色沉淀。出黄色或红棕色沉淀。出黄色或红棕色沉淀。配制配制配制配制方方方方法法法法1- 1- 1- 1- 3.5 3.5 3.5 3.5 g g g g KI KI KI KI + + + + 1.3 1.3 1.3 1.
49、3 g g g g HgClHgClHgClHgCl2 2 2 2 溶溶溶溶于于于于70 70 70 70 毫毫毫毫升升升升水水水水。加加加加30303030毫毫毫毫升升升升4 4 4 4 mol/Lmol/Lmol/Lmol/L氢氢氢氢氧氧氧氧化化化化钠钠钠钠（或或或或氢氢氢氢氧氧氧氧化化化化钾钾钾钾）溶溶溶溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。方方方方法法法法2- 2- 2- 2- 溶溶溶溶解解解解11.5 11.5 11.5 11.5 g g g g HgIHgIHgIHg
50、I2 2 2 2 + + + + KI KI KI KI 10 10 10 10 g g g g于于于于适适适适量量量量少少少少许许许许水水水水，后后后后加加加加水水水水稀稀稀稀释释释释至至至至50 50 50 50 ml,ml,ml,ml,静静静静置置置置后后后后，取取取取其其其其澄澄澄澄清清清清液液液液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。弃去沉淀，储存于棕色瓶中。弃去沉淀，储存于棕色瓶中。弃去沉淀，储存于棕色瓶中。普俱篆甚暇阅呈硒墙树凉等莽萤婶川冶逞痢谭汤糜钮乓媚呆牙兰柳各挂呼蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n n下面针对几点来说明影响氨化完全和速度快的因素下面针对几点来说明影响氨化完全和
51、速度快的因素下面针对几点来说明影响氨化完全和速度快的因素下面针对几点来说明影响氨化完全和速度快的因素（1 1）KK氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量如果称如果称如果称如果称1g1g以上的样品，就需要以上的样品，就需要以上的样品，就需要以上的样品，就需要KK氏烧瓶最小氏烧瓶最小氏烧瓶最小氏烧瓶最小500ml500ml，8001000ml8001000ml的更好，这样的的更好，这样的的更好，这样的的更好，这样的KK氏烧瓶对于缩氏烧瓶对于缩氏烧瓶对于缩氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。短氨化时间，加热的均匀性和完
52、全氨化效果最好。短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。（2 2）分解剂）分解剂）分解剂）分解剂AHAH2 2SOSO4 4和和和和KK2 2SOSO4 4的添加量的添加量的添加量的添加量有机物分解需要的有机物分解需要的有机物分解需要的有机物分解需要的HH2 2SOSO4 4量应根据有机物种类不量应根据有机物种类不量应根据有机物种类不量应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加HH2 2SOSO4 4多，为了提高分解温度，要大量添加多，为了提高分解温度，要
53、大量添加多，为了提高分解温度，要大量添加多，为了提高分解温度，要大量添加KK2 2SOSO4 4，但不能，但不能，但不能，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。太多，也不能太少，太少则氨化不充分。太多，也不能太少，太少则氨化不充分。太多，也不能太少，太少则氨化不充分。孤喷逾辟阔敬辞徐斥验怯此凸樱奥剪哑牡肛烫绚纤谊观韦硷象奏龚臂小铅蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定KK2 2SOSO4 4和和和和HH2 2SOSO4 4的添加比例是：的添加比例是：的添加比例是：的添加比例是：1g1g样品样品样品样品KK2 2SOSO4 4：HH2 2SOSO4 4=7g=7g：12ml12ml这种比例
54、在国内外都使用，是公认的这种比例在国内外都使用，是公认的这种比例在国内外都使用，是公认的这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例：还有一种比例：还有一种比例：还有一种比例：KK2 2SOSO4 4：HH2 2SOSO4 4=10g=10g：20ml20mlBB催化剂催化剂催化剂催化剂用作催化剂的有用作催化剂的有用作催化剂的有用作催化剂的有HgHg、HgOHgO、SeSe、CuSOCuSO4 4、TiOTiO2 2，对，对，对，对HgHg，HgOHgO有毒但效果好，有毒但效果好，有毒但效果好，有毒但效果好，SeSe与与与与CuSOCuSO4 4效效效效果相似，果相似，果相似，果相似，TiOT
55、iO2 2的结果偏低，采用不同的催化剂则的结果偏低，采用不同的催化剂则的结果偏低，采用不同的催化剂则的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同，消化时间不同，消化时间不同，消化时间不同，HgOHgO消化麦子为消化麦子为消化麦子为消化麦子为3838，SeSe与与与与CuSOCuSO4 4消化麦子消化麦子消化麦子消化麦子5555，TiOTiO2 2消化麦子消化麦子消化麦子消化麦子7070，所以在给出测定，所以在给出测定，所以在给出测定，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。结果时要注明催化剂的类型。结果时要注明催化剂的类型。结果时要注明催化剂的类型。逐盘尔墟曳倘夯迭宦纹渝舵臀损练钦块击序哈或坞吧
56、缝匀取袒椎遂歪糊架蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（3）热源的强度）热源的强度消化时热源的强度同迅速消化和完消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便全氨化关系很大，即便K2SO4加得多，如加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外损失，使氨回收率低，另外K氏烧瓶的容量大小，颈部的粗细和长短氏烧瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。等，也与热源的强度有关。形俱淤切茁赵娃蛆惫狐蓖雏理脂屁署洛膳劣桶另亚质仲抹窃挖傲颗户赏睁蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（4 4）氨的蒸馏和吸收及滴
57、定）氨的蒸馏和吸收及滴定）氨的蒸馏和吸收及滴定）氨的蒸馏和吸收及滴定蒸馏加蒸馏加蒸馏加蒸馏加NaOHNaOH是是是是40%40%，加的量为，加的量为，加的量为，加的量为HH2 2SOSO4 4量的量的量的量的3 3倍，硫酸倍，硫酸倍，硫酸倍，硫酸量为量为量为量为20ml20ml，则，则，则，则NaOHNaOH为为为为203=60ml203=60ml，而且一般高于这个理，而且一般高于这个理，而且一般高于这个理，而且一般高于这个理论值，即加到论值，即加到论值，即加到论值，即加到7080ml7080ml，如果，如果，如果，如果NaOHNaOH量加的不够就变成量加的不够就变成量加的不够就变成量加的不够
58、就变成HH2 2S S，HH2 2S S是强酸，使颜色变红。是强酸，使颜色变红。是强酸，使颜色变红。是强酸，使颜色变红。吸收液有：吸收液有：吸收液有：吸收液有：1 1标准标准标准标准HH2 2SOSO4 4 用标准碱反滴定，甲基红指示剂用标准碱反滴定，甲基红指示剂用标准碱反滴定，甲基红指示剂用标准碱反滴定，甲基红指示剂22硼酸硼酸硼酸硼酸 用用用用HClHCl进行滴定，混合指示剂进行滴定，混合指示剂进行滴定，混合指示剂进行滴定，混合指示剂目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替HH2 2SOSO4 4，这样可省，这
59、样可省，这样可省，这样可省略了反滴定，略了反滴定，略了反滴定，略了反滴定，HH2 2SOSO4 4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在度在度在度在3%3%以上可将氨完全吸收，为保险起见一般用以上可将氨完全吸收，为保险起见一般用以上可将氨完全吸收，为保险起见一般用以上可将氨完全吸收，为保险起见一般用4%4
60、%。台尝俺南末哦舍包衙任毛答探挨惯劈喻梭晋墙偏鞭碴蹄靠购阉邻追笺肺桂蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n n结果计算：结果计算：结果计算：结果计算：101101页页页页注意：注意：注意：注意：FF氮换算为蛋白质的系数，一般为氮换算为蛋白质的系数，一般为氮换算为蛋白质的系数，一般为氮换算为蛋白质的系数，一般为6.256.25也可查表。也可查表。也可查表。也可查表。n n说明：说明：说明：说明： 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消消消消化化化化时时时时不不不不要要要要用用用用强强强强火火火火，应应
61、应应保保保保持持持持和和和和缓缓缓缓沸沸沸沸腾腾腾腾，以以以以免免免免粘粘粘粘贴贴贴贴在在在在凯凯凯凯氏氏氏氏瓶瓶瓶瓶内内内内壁壁壁壁上上上上的的的的含含含含氮氮氮氮化化化化合合合合物物物物在在在在无无无无硫硫硫硫酸酸酸酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。存在的情况下消化不完全而造成氮损失。存在的情况下消化不完全而造成氮损失。存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 消消消消化化化化时时时时应应应应注注注注意意意意不不不不时时时时转转转转动动动动凯凯凯凯氏氏氏氏烧烧烧烧瓶瓶瓶瓶，以以以以便便便便利利利利用用用用冷冷冷冷凝凝凝凝酸酸酸酸液液液液将将将将附附附附在在在在瓶瓶瓶瓶壁壁壁壁上上上上的的的
62、的固固固固体体体体残残残残渣渣渣渣洗洗洗洗下下下下，并并并并促进其消化完全。促进其消化完全。促进其消化完全。促进其消化完全。误印刽其京履鞠激症砸蔼恍恒狙到代挣旱冒递庶宿憎卉碘帆鼓辙桥脱磨铅蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产大样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产大样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产大样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛应用小火加热，并时
63、时摇动；或者加入少量辛应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。热源强度。热源强度。热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入瓶冷却，加入瓶冷却，加入瓶冷却，加入3030过氧化氢过氧化氢过氧化氢过氧化氢23m123m1后再继续后再继续后再继续后再继续加热消化
64、加热消化加热消化加热消化。 若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过5g5g可按每克试可按每克试可按每克试可按每克试样样样样5m15m1的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。屑鳖趟巷瞬娱欺逗匙退馋水形逆北伸心殊溢证鬼音华撇扔戌欧祸酋岸栅闲蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化3030分钟即可，分钟即可，分钟即可，分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含但对于含有特别难以氨
65、化的氮化合物的样品如含但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。呈蓝色或浅绿色，
66、但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在氢氧化铜在氢氧化铜在氢氧化铜在70709090时发黑。时发黑。时发黑。时发黑。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗蒸馏完毕后，应先
67、将冷凝管下端提离液面清洗蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸管口，再蒸管口，再蒸管口，再蒸1 1分钟后关掉热源否则可能造成吸收分钟后关掉热源否则可能造成吸收分钟后关掉热源否则可能造成吸收分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。液倒吸。液倒吸。液倒吸。农殖痔懒肉父察唁钥聪锦褐虫贷湾创傲境的腐滴叼饱译被稼越遁哑炊舅囚蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定二、 微量凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2 2、与常量法不同点：、与常量法不同点：、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸量加入硼酸量加入硼酸量加入硼酸量有有有有5
68、0ml10ml,50ml10ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L,0.1mol/L0.01mol/L,凯氏烧瓶凯氏烧瓶凯氏烧瓶凯氏烧瓶100ml100ml可用微量滴定管。可用微量滴定管。可用微量滴定管。可用微量滴定管。3 3、蒸馏装置见、蒸馏装置见、蒸馏装置见、蒸馏装置见102102页图页图页图页图5-95-9。渠广凛怯贷掘稳牛泳蕴老汇蜂炬糊朽痈亥携狡涕名占仪药兢怒漏萄腻火滑蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定10-25-9夺紫段镐孜屋袄萧邀野砷电席浇少打媚蟹悸古榆玻款衬蛙泳撰门哦汀钓衬蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的
69、测定4.说明：说明：蒸馏前给水蒸气发生器内装水至蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3处，处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以使加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。氨被蒸出而影响测定结果。蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程不得停火断汽，否则将发生倒吸。程不得停火断汽，否则将发生倒吸。加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。水封措施，以免氨由此逸出损失。2硼酸吸收液每次用量为硼酸吸收液每次用量为25ml，用前，用前加入
70、甲基红加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂溴甲酚绿混合指示剂2滴。滴。链帜扬式小钡孪绒虏拄台纺派虎史梧虽洒锐物畔族奇截扼傻贫卓必亚泡首蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定三、三、 自动凯氏定氮法自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前原理及适用范围同前 2 2、特点：特点：（1 1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。外线加热的消化炉。外线加热的消化炉。外线加热的消化炉。（2 2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化）快速：一次可
71、同时消化8 8个样品，个样品，个样品，个样品，3030分钟可消分钟可消分钟可消分钟可消化完毕。化完毕。化完毕。化完毕。（3 3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，1212分钟完成分钟完成分钟完成分钟完成1 1个样。个样。个样。个样。旷弟挠俏掏弧态钧阐脾天幽尤栓确裹漆晌侍汛逼刃盐噬谊毡晶首伴酮严姨蛋白质和氨基
72、酸的测定蛋白质和氨基酸的测定北京福德泰和科技有限公司北京福德泰和科技有限公司产品名称：产品名称：全自动凯氏定氮仪全自动凯氏定氮仪涪隧老壁驰梳溯仕甭工副簿剿挑烃析债碰蛆彻歌务盎茧召受鸭渐漳铭伟营蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n半自动凯氏定氮仪叮晰馆淤娘做畔赵汽狄趁铭蛮碘取獭腥腐案荚爬榨帖布汾阳寂弘彭慕牟孜蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第三节第三节蛋白质的快速测定法蛋白质的快速测定法传传传传统统统统的的的的凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮法法法法应应应应用用用用范范范范围围围围广广广广，灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高、准准准准确确确确，不不不不要要要要大大大大仪仪仪仪器器器器
73、，但但但但除除除除自自自自动动动动凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮法法法法外外外外，均均均均操操操操作作作作费费费费时时时时，且且且且有有有有环环环环境污染，影响操作人员健康。境污染，影响操作人员健康。境污染，影响操作人员健康。境污染，影响操作人员健康。 为为为为满满满满足足足足生生生生产产产产单单单单位位位位对对对对工工工工艺艺艺艺过过过过程程程程的的的的快快快快速速速速控控控控制制制制分分分分析析析析，尽尽尽尽量量量量减减减减少少少少环环环环境境境境污污污污染染染染和和和和操操操操作作作作简简简简便便便便省省省省时时时时，因因因因此此此此又又又又陆陆陆陆续续续续创创创创立立立立了了了了不不
74、不不少少少少快快快快速速速速测定法。测定法。测定法。测定法。包括双缩脲法、包括双缩脲法、包括双缩脲法、包括双缩脲法、紫外分光光度法、紫外分光光度法、紫外分光光度法、紫外分光光度法、染料结合法、染料结合法、染料结合法、染料结合法、水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。菇陇敏毁戳志纺牌喂葛姬任哎迈嚏驹女灰避拯美病戳寇沽阶唬动他笆琅用蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定一一一一. .双缩脲法双缩脲法双缩脲法双缩脲法1. 1.原理原理原理原理脲脲脲脲（尿尿尿尿素素素素）NHNH2 2CONHCONH2 2 加加加加热热热热至至至至150160150160时时时时，两分子缩
75、和成双缩脲。两分子缩和成双缩脲。两分子缩和成双缩脲。两分子缩和成双缩脲。双双缩缩脲脲能能和和硫硫酸酸铜铜的的碱碱性性溶溶液液生生成成紫紫红红色色络络和和物物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有肽肽键键（CONH），与与双双缩缩脲脲结结构构相相似似。在在同同样样条条件件下下也也有有呈呈色色反反应应，在在一一定定条条件件下下，其其颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，可可用用分分光光光光度计来测其吸光度，确定含量。（度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2CONHCONH2+NH3NH2CONH2+NH2CO
76、NH2着违尝楷几军摆苦曙誓离貉赚薛刃篇菱贬屏诺侄海什掸抢献绦植倒颤毒庙蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化品不用消化2. 2. 方法特点及应用范围方法特点及应用范围方法特点及应用范围方法特点及应用范围 本本本本法法法法灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度较较较较低低低低，但但但但操操操操作作作作简简简简单单单单快快快快速速速速，故故故故在在在在生生生生物物物物化化化化学学学学领领领领域域域域中中中中测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量时时时时常常常常用用用用此此此此法法法法。本本本本法
77、法法法亦亦亦亦适适适适用用用用于于于于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。3.3.主要仪器：主要仪器：主要仪器：主要仪器： 分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（4000r/min4000r/min）4.4.试剂：试剂：试剂：试剂： (1)(1)碱性硫酸铜溶液碱性硫酸铜溶液碱性硫酸铜溶液碱性硫酸铜溶液 烁趴氢纯凰辣欧鸯祖眉忘岿甜啪恢厕蜕饺暑皿杆还畴甚拦酌汛充邑清鹅卞蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n n甘油
78、作为稳定剂：取甘油作为稳定剂：取甘油作为稳定剂：取甘油作为稳定剂：取10ml10mol/LKOH10ml10mol/LKOH溶液，溶液，溶液，溶液，3.0ml3.0ml甘油加到甘油加到甘油加到甘油加到937ml937ml水中，激烈搅拌，同时慢慢水中，激烈搅拌，同时慢慢水中，激烈搅拌，同时慢慢水中，激烈搅拌，同时慢慢加入加入加入加入50ml4%CuSO50ml4%CuSO4 4。n n酒石酸钠作稳定剂，吸酒石酸钠作稳定剂，吸酒石酸钠作稳定剂，吸酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10mol/LKOH10ml10mol/LKOH溶液溶液溶液溶液和和和和20ml25%20ml25%酒石酸钾钠溶液加到酒石酸钾
79、钠溶液加到酒石酸钾钠溶液加到酒石酸钾钠溶液加到930ml930ml水中，激水中，激水中，激水中，激烈搅拌，同时慢慢加入烈搅拌，同时慢慢加入烈搅拌，同时慢慢加入烈搅拌，同时慢慢加入4%CuSO4%CuSO4 4液液液液40ml40ml。配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。氧化铜生成，否则重配。氧化铜生成，否则重配。氧化铜生成，否则重配。(2)(2)四氯化碳四氯化碳四氯化碳四氯化碳谬轮编居搞城拌旨基渍刹永匠徐茄扛趁贫匠砌府陷泅辗虑誓代暇抄割艺肘蛋白质和氨基酸的测
80、定蛋白质和氨基酸的测定5 5操作方法：标准曲线绘制操作方法：标准曲线绘制操作方法：标准曲线绘制操作方法：标准曲线绘制准确称准确称准确称准确称0.6g0.6g样品样品样品样品使用试剂使用试剂使用试剂使用试剂准确称准确称准确称准确称0.5g0.5g样品样品样品样品使用试剂使用试剂使用试剂使用试剂假如用试剂假如用试剂假如用试剂假如用试剂（1 1）标准曲线绘制）标准曲线绘制）标准曲线绘制）标准曲线绘制按凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品为标按凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品为标按凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品为标按凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品为标样，根据样品中蛋白质含量，取离心澄清液样，根据样品中蛋白质含
81、量，取离心澄清液样，根据样品中蛋白质含量，取离心澄清液样，根据样品中蛋白质含量，取离心澄清液0.02.04.08.010.0ml0.02.04.08.010.0ml于于于于10ml10ml容量瓶中容量瓶中容量瓶中容量瓶中分别分别分别分别加水定容，在加水定容，在加水定容，在加水定容，在560nm560nm波长下测定其吸光度。波长下测定其吸光度。波长下测定其吸光度。波长下测定其吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度为以蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度为以蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度为以蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。纵坐标绘制标准曲线。纵坐标绘制标准曲线。纵坐标绘制标
82、准曲线。拣睫镐吱咯课糠问褐奖尧惮歉荡揍鞭珐芥羌辨伦祝平择筷平戈呀檀产晴崔蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（2）准确称样）准确称样0.5g于于80ml离心管离心管加加1mlClC4混合混合加加50ml酒石酸钾钠稳定酒石酸钾钠稳定剂剂盖上盖子离心盖上盖子离心10min（4000转转/分）分）放置放置1小时小时吸混合液吸混合液15ml于于20ml离离心管中心管中离心到完全透明离心到完全透明取上清夜取上清夜5ml于于10ml容量瓶容量瓶加水定容加水定容于于560nm处测定吸光度，从标准曲线上查出蛋白处测定吸光度，从标准曲线上查出蛋白质含量。质含量。十蔽状度甸础琢探霍铡戎药桅埂翟途片刁库朽翰御俘
83、嚎橙磕本皑基贴庄蛔蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定4计算：蛋白质%=（C/W）100C-从标准曲线上查得得蛋白质含量（mg）W-测定样液时相当于样品重量（mg）三紫外吸收法三紫外吸收法三紫外吸收法三紫外吸收法 1 1 1 1原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团，R R（ NHCHCO- NHCHCO-）在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在在280nm下，光吸收与蛋白质浓度下，光吸收与蛋白质浓度（38mg/ml）成直线关系，因此，通过测定蛋）成直线关系，因此，通过测
84、定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法分白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。孜撂俯齐雍窑垒锹伶渴础妥舟嫂鳞蹿扣似庙坤灯果聂郭夏抽虱正像觅撂竟蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定2 2 2 2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。故在食品分析领域应用不广泛。故在食品分析领域应用不广泛。故在食品分析领域应用不广泛。3 3 3 3
85、主要仪器：主要仪器：主要仪器：主要仪器： 紫外分光光度计紫外分光光度计紫外分光光度计紫外分光光度计 离心机（离心机（离心机（离心机（3000 5000 r/min3000 5000 r/min3000 5000 r/min3000 5000 r/min）4 4 4 4操作：操作：操作：操作：（1 1）标准曲线的绘制：准确称取样品）标准曲线的绘制：准确称取样品）标准曲线的绘制：准确称取样品）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g.2.00g，置于置于置于置于50ml50ml烧瓶中，加入烧瓶中，加入烧瓶中，加入烧瓶中，加入0.1mol/l0.1mol/l柠檬酸水溶液柠檬酸水溶液柠檬酸水溶液柠檬酸
86、水溶液30ml30ml，搅，搅，搅，搅拌拌拌拌3030分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每分钟中，以每分钟中，以每分钟中，以每分钟3000500030005000转的速度离心转的速度离心转的速度离心转的速度离心1010分钟，分别吸分钟，分别吸分钟，分别吸分钟，分别吸取上清夜取上清夜取上清夜取上清夜0.50.5，1.01.0，1.51.5，2.02.0，2.52.5，3.0ml3.0ml于于于于6 6个个个个10ml10ml容量容量容量容量瓶钟，每个
87、容量瓶各加入瓶钟，每个容量瓶各加入瓶钟，每个容量瓶各加入瓶钟，每个容量瓶各加入8mol/l8mol/l脲的氢氧化钠溶液至标脲的氢氧化钠溶液至标脲的氢氧化钠溶液至标脲的氢氧化钠溶液至标线，充分摇线，充分摇线，充分摇线，充分摇2 2分钟（如果混浊再次离心），取透明液于分钟（如果混浊再次离心），取透明液于分钟（如果混浊再次离心），取透明液于分钟（如果混浊再次离心），取透明液于比色皿中，在比色皿中，在比色皿中，在比色皿中，在280nm280nm下测定其吸光度。（做参比值）下测定其吸光度。（做参比值）下测定其吸光度。（做参比值）下测定其吸光度。（做参比值）蹈伸植亿搅间伍波裤沪帕展蒜熔柬沁秉泄股鬃奈辆卸涪
88、先告毒挽寄垂聘谎蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定以事先用凯氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量以事先用凯氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量以事先用凯氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量以事先用凯氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量为横坐标，上述的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。为横坐标，上述的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。为横坐标，上述的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。为横坐标，上述的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。（2 2）样品测定）样品测定）样品测定）样品测定准确称取试样准确称取试样准确称取试样准确称取试样1.00g1.00g于于于于50ml50ml烧杯中烧杯中烧杯中烧杯中加加加加0.1mol/l0.
89、1mol/l柠檬酸溶液柠檬酸溶液柠檬酸溶液柠檬酸溶液30ml30ml搅拌搅拌搅拌搅拌1010分钟分钟分钟分钟四层纱布过滤到离心四层纱布过滤到离心四层纱布过滤到离心四层纱布过滤到离心管中管中管中管中用用用用8mol/L8mol/L脲的脲的脲的脲的NaOHNaOH溶液定容，摇匀后于溶液定容，摇匀后于溶液定容，摇匀后于溶液定容，摇匀后于280nm280nm下测吸光度，从标准曲线上查出蛋白质的含量。下测吸光度，从标准曲线上查出蛋白质的含量。下测吸光度，从标准曲线上查出蛋白质的含量。下测吸光度，从标准曲线上查出蛋白质的含量。计算：计算：计算：计算： 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质=（C/WC/W）100100
90、C-C-从标准曲线上查得的蛋白质含量（从标准曲线上查得的蛋白质含量（从标准曲线上查得的蛋白质含量（从标准曲线上查得的蛋白质含量（mgmg）W-W-测定样品溶液相当于样品量（测定样品溶液相当于样品量（测定样品溶液相当于样品量（测定样品溶液相当于样品量（mgmg）说明：说明：说明：说明：a. a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性蛋白质此法运用于糕点，牛乳和可溶性蛋白质此法运用于糕点，牛乳和可溶性蛋白质此法运用于糕点，牛乳和可溶性蛋白质样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。b.b.温度对蛋温度对蛋温
91、度对蛋温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在白质水解有影响，操作温度应控制在白质水解有影响，操作温度应控制在白质水解有影响，操作温度应控制在20302030。享庆纂算袜竿钩秘朽潦表邪触淖犊贩稗鹅够落聚夕疙巫侵塔具见灼贴极湃蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定四四四四. .水扬酸比色法：水扬酸比色法：水扬酸比色法：水扬酸比色法：1. 1.原理：原理：原理：原理： 样品中的蛋白质经样品中的蛋白质经样品中的蛋白质经样品中的蛋白质经HH2 2SOSO4 4消化转化为铵盐溶液后，在消化转化为铵盐溶液后，在消化转化为铵盐溶液后，在消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成
92、有蓝一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有蓝一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有蓝一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有蓝色的化合物，可以在波长色的化合物，可以在波长色的化合物，可以在波长色的化合物，可以在波长660nm660nm处比色测定，求出样品含氮处比色测定，求出样品含氮处比色测定，求出样品含氮处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。量，计算蛋白质含量。量，计算蛋白质含量。量，计算蛋白质含量。2. 2.方法方法方法方法 （）标准曲线的绘制（）标准曲线的绘制（）标准曲线的绘制（）标准曲线的绘制取取取取6 6个个个个25ml25ml容量瓶编号容量瓶编号容量
93、瓶编号容量瓶编号01234560123456分别加空白酸液分别加空白酸液分别加空白酸液分别加空白酸液2ml2ml分别加磷酸盐缓冲液分别加磷酸盐缓冲液分别加磷酸盐缓冲液分别加磷酸盐缓冲液5ml5ml稀释至总体体积至稀释至总体体积至稀释至总体体积至稀释至总体体积至15ml15ml分别加水扬酸钠分别加水扬酸钠分别加水扬酸钠分别加水扬酸钠5ml5ml37C37C水浴水浴水浴水浴1515分钟分钟分钟分钟加入次氯酸钠加入次氯酸钠加入次氯酸钠加入次氯酸钠2.5ml2.5ml37C37C水浴水浴水浴水浴1515分钟分钟分钟分钟取出加水至标线，于取出加水至标线，于取出加水至标线，于取出加水至标线，于660nm6
94、60nm下进行比色测定，绘标准曲下进行比色测定，绘标准曲下进行比色测定，绘标准曲下进行比色测定，绘标准曲线线线线 辨患裕饮咆毯蔼坪交谐舵燎孩泵俯躲昧纂佰章在诬仓毁孰染睁慕剪滨滋褪蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（2 2）样品处理：）样品处理：）样品处理：）样品处理：准确称样准确称样准确称样准确称样0.201.00g0.201.00g于于于于KK氏瓶中氏瓶中氏瓶中氏瓶中加加加加15mlH15mlH2 2SOSO4 4和和和和5g5g催化剂催化剂催化剂催化剂电炉上加热到沸腾后电炉上加热到沸腾后电炉上加热到沸腾后电炉上加热到沸腾后加大火力消化加大火力消化加大火力消化加大火力消化直到出现暗绿色
95、时直到出现暗绿色时直到出现暗绿色时直到出现暗绿色时摇摇摇摇动瓶子动瓶子动瓶子动瓶子KK氏瓶全部消化后氏瓶全部消化后氏瓶全部消化后氏瓶全部消化后冷却冷却冷却冷却加水至加水至加水至加水至250ml250ml容量瓶。容量瓶。容量瓶。容量瓶。（3 3）样品测定：）样品测定：）样品测定：）样品测定：准确吸取上述消化溶液准确吸取上述消化溶液准确吸取上述消化溶液准确吸取上述消化溶液10ml10ml于于于于100ml100ml容量瓶中容量瓶中容量瓶中容量瓶中定容定容定容定容准确吸准确吸准确吸准确吸2ml2ml于于于于25ml25ml容量瓶中容量瓶中容量瓶中容量瓶中加加加加5ml5ml磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓
96、冲液磷酸缓冲液以下操作与标以下操作与标以下操作与标以下操作与标准曲线绘制的步骤相同准曲线绘制的步骤相同准曲线绘制的步骤相同准曲线绘制的步骤相同并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。其含氮量。其含氮量。其含氮量。（4 4）计算）计算）计算）计算CFCF 含氮含氮含氮含氮%=-100%=-100W10001000W10001000C-C-从标准曲线中查出测定样液的含氮量（从标准曲线中查出测定样液的含氮量（从标准曲线中查出
97、测定样液的含氮量（从标准曲线中查出测定样液的含氮量（gg）F-F-样品溶液的稀释倍数样品溶液的稀释倍数样品溶液的稀释倍数样品溶液的稀释倍数W-W-样品重量（样品重量（样品重量（样品重量（g g）蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质%=%=总氮总氮总氮总氮%K%K（KK可为可为可为可为6.256.25，也可查），也可查），也可查），也可查）痢相翠轰教辉阻结腿倘灭现厌努扦救铱阀馅螟鹏痔生夹怕吨慰重付咽樊到蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第四节第四节 氨基酸总量测定氨基酸总量测定 蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分，蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分，蛋白质经水解或酶解可由大分子
98、变成小的蛋白质成分，蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分，如水解后的产物经胨、肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成如水解后的产物经胨、肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成如水解后的产物经胨、肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成如水解后的产物经胨、肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成蛋白质最基本的物质。蛋白质最基本的物质。蛋白质最基本的物质。蛋白质最基本的物质。水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性，化学结水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性，化学结水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性，化学结水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性，化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的
99、构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。度，也就可以评价食品的营养价值。度，也就可以评价食品的营养价值。度，也就可以评价食品的营养价值。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测氨基酸不是单纯的一种
100、物质，用氨基酸分析仪可直接测氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出定出定出定出1717种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，屋穗朱漾歪匹榆了泌氧丘娩埂烛笺惫辐票湃饼枪跋吾赃者销榔征迭批腰散蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定所以需要测定
101、总的氨基酸量，它们不能以氨基酸所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含有一种氨基酸，如味精中的
102、谷氨酸，就可以从含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。氮量计算出氨基酸的含量。氮量计算出氨基酸的含量。氮量计算出氨基酸的含量。食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定蛋白质的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨蛋白质的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨蛋白质的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨蛋白质的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨基酸进行分离，鉴定，尤其对基酸进行分离，鉴定，尤其对基酸进行分离，鉴定，尤其对基酸进行分离，鉴定，尤其对8 8种人体必需氨基
103、种人体必需氨基种人体必需氨基种人体必需氨基酸进行定量定性分析。酸进行定量定性分析。酸进行定量定性分析。酸进行定量定性分析。膘埋桂再彻蜕索躁硝珍堵悍触撬最霜约幽徘扯碾魂谱棵傍旦拐玲糯筒禾却蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定一氨基酸的一般定量测定一氨基酸的一般定量测定（一）双指示剂甲醛滴定法（一）双指示剂甲醛滴定法1.1.1.1.原理：氨基酸本身有碱性原理：氨基酸本身有碱性原理：氨基酸本身有碱性原理：氨基酸本身有碱性 NH NH NH NH2 2 2 2 基，又有基，又有基，又有基，又有 酸性酸性酸性酸性 COOH COOH COOH COOH 基，它们相互作用而生成基，它们相互作用而生成基
104、，它们相互作用而生成基，它们相互作用而生成中性内盐，加入甲醛溶液后，与中性内盐，加入甲醛溶液后，与中性内盐，加入甲醛溶液后，与中性内盐，加入甲醛溶液后，与 NH NH NH NH2 2 2 2 结合，结合，结合，结合，碱性消失，再用强碱来滴定碱性消失，再用强碱来滴定碱性消失，再用强碱来滴定碱性消失，再用强碱来滴定 COOH COOH COOH COOH 基。基。基。基。2 2 2 2特点：此法简单易行、快速方便，与亚硝酸特点：此法简单易行、快速方便，与亚硝酸特点：此法简单易行、快速方便，与亚硝酸特点：此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用氮气容量法分析结果相近
105、。在发酵工业中常用氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。（适于食品此作为控制发酵生产的指标之一。（适于食品此作为控制发酵生产的指标之一。（适于食品此作为控制发酵生产的指标之一。（适于食品中游离氨基酸的测定）中
106、游离氨基酸的测定）中游离氨基酸的测定）中游离氨基酸的测定）瘩宿群垣针迂铱蒸荆堑译稍矩言膝团瓦鹃哼雍隶升聊条机嘲器辆腑饥谅锦蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 3 3 3 3双指示剂：双指示剂：双指示剂：双指示剂： 40% 40% 40% 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将氢氧化钠将氢氧化钠将氢氧化钠将40%40%40%40%甲醛中和至淡蓝色。甲醛中和至淡蓝色。甲醛中和至淡蓝色。甲醛中和至淡蓝色。 0.1% 0.1% 0.1% 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（百里酚酞
107、乙醇溶液，（百里酚酞乙醇溶液，（百里酚酞乙醇溶液，（9.49.49.49.410.610.610.610.6） 0.1% 0.1% 0.1% 0.1%中性红中性红中性红中性红 50% 50% 50% 50%乙醇溶液，（乙醇溶液，（乙醇溶液，（乙醇溶液，（6.86.86.86.88.08.08.08.0） 0.1 mol/L 0.1 mol/L 0.1 mol/L 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。4 4 4 4操作：操作：操作：操作： 取相同两份样品取相同两份样品取相同两份样品取相同两份样品202030mg30mg分别于分别于分别于分别
108、于250ml250ml三角瓶三角瓶三角瓶三角瓶各各各各加加加加50ml50ml蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水一份加中性红一份加中性红一份加中性红一份加中性红3 3滴滴滴滴用用用用0.1mol/LNaOH0.1mol/LNaOH滴滴滴滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞乙醇液乙醇液乙醇液乙醇液3 3滴加中性甲醛滴加中性甲醛滴加中性甲醛滴加中性甲醛20ml20ml摇匀摇匀摇匀摇匀用用用用0.1mol/LNaOH0.1mol/LNaOH滴滴滴
109、滴至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液mlml数。数。数。数。 杉尹澈鸳起祭选终醇暂诈殃棕闭要第叁姨续青豌恐池钞剥言炳吃哩炙孤柑蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定5.5.5.5.计算：计算：计算：计算： 氨基酸态氮氨基酸态氮氨基酸态氮氨基酸态氮= = = = cccc（V2-V2-V2-V2-V1V1V1V1）0.0141000.0141000.0141000.014100） /W100/W100/W100/W100 V1 V1 V1 V1用中性红为指示剂时，碱用中性红为指示剂时，碱用中性
110、红为指示剂时，碱用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积液所消耗的体积液所消耗的体积液所消耗的体积 V2 V2 V2 V2用百里酚酞乙醇液为指示用百里酚酞乙醇液为指示用百里酚酞乙醇液为指示用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量剂时标液消耗量剂时标液消耗量剂时标液消耗量0.0140.014氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/mmolg/mmol。（二）茚三酮的比色法（二）茚三酮的比色法（二）茚三酮的比色法（二）茚三酮的比色法1.原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，原理：氨基酸在一定条件下
111、与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。（生成蓝紫色化合物，可比色定量。（生成蓝紫色化合物，可比色定量。（生成蓝紫色化合物，可比色定量。（570nm570nm570nm570nm）蒜填滴捅谈佣嘶饲鹏朋贺欺越版汁僚镍遗雍仔哼译绸野恐章锌斧氮燥漫钢蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定2. 2.试剂：试剂：试剂：试剂：（1 1）磷酸缓冲液（）磷酸缓冲液（）磷酸缓冲液（）磷酸缓冲液（pH.8.04pH.8.04）制备方法如下：）制备方法如下：）制备方法如下：）制备方法如下：称磷酸二氢钾称磷酸二氢钾称磷酸二氢钾称磷酸二氢钾4.5350g4.5350g。溶解定容至。溶解定容至。溶解定容至。溶解定
112、容至500ml500ml称称称称NaHNaH2 2POPO4 412H12H2 2O11.9380gO11.9380g，溶解定容，溶解定容，溶解定容，溶解定容至至至至500ml500ml取上述配好的磷酸二氢钾取上述配好的磷酸二氢钾取上述配好的磷酸二氢钾取上述配好的磷酸二氢钾10ml10ml与磷酸氢二与磷酸氢二与磷酸氢二与磷酸氢二钠钠钠钠190ml190ml混合即为混合即为混合即为混合即为pH8.04pH8.04的缓冲液。的缓冲液。的缓冲液。的缓冲液。（2 2）2%2%茚三酮溶液：茚三酮溶液：茚三酮溶液：茚三酮溶液：称茚三酮称茚三酮称茚三酮称茚三酮1g1g溶于溶于溶于溶于35ml35ml热水热水
113、热水热水加入加入加入加入40mg40mg氯化亚锡（氯化亚锡（氯化亚锡（氯化亚锡（SnClSnCl2 2HH2 2OO）搅拌过滤（作防腐剂）搅拌过滤（作防腐剂）搅拌过滤（作防腐剂）搅拌过滤（作防腐剂）于冷暗处过夜于冷暗处过夜于冷暗处过夜于冷暗处过夜定容定容定容定容50ml50ml残汛直肉到晤哆袋淫猴种杨攻飘倔雪体狰叛摘侥惫顿翟翱滴诚瘴刷嘱韧焦蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（3 3） 氨基酸标液氨基酸标液氨基酸标液氨基酸标液称干燥氨基酸（如异亮氨酸）称干燥氨基酸（如异亮氨酸）称干燥氨基酸（如异亮氨酸）称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g0.2000g溶解定容溶解定容溶解定容溶解定容1
114、00ml100ml摇匀摇匀摇匀摇匀吸吸吸吸10ml10ml于另外于另外于另外于另外100ml100ml容容容容量瓶定容量瓶定容量瓶定容量瓶定容100ml100ml，即得，即得，即得，即得200200 g/mlg/ml标液标液标液标液3 3操作方法：操作方法：操作方法：操作方法：（1 1）绘制标准曲线：）绘制标准曲线：）绘制标准曲线：）绘制标准曲线：取取取取7 7个个个个25ml25ml容量瓶，吸取标液容量瓶，吸取标液容量瓶，吸取标液容量瓶，吸取标液00.51.000.51.01.52.02.53.0ml1.52.02.53.0ml于于于于7 7个个个个25ml25ml容量瓶，加水补容量瓶，加水
115、补容量瓶，加水补容量瓶，加水补充至容积为充至容积为充至容积为充至容积为4ml4ml，然后加茚三酮和缓冲液各，然后加茚三酮和缓冲液各，然后加茚三酮和缓冲液各，然后加茚三酮和缓冲液各1ml1ml，于水浴加热，于水浴加热，于水浴加热，于水浴加热1515分钟，冷却后定容分钟，冷却后定容分钟，冷却后定容分钟，冷却后定容25ml25ml，静置，静置，静置，静置1515分钟，在分钟，在分钟，在分钟，在570nm570nm下测消光值，绘制标准曲线。下测消光值，绘制标准曲线。下测消光值，绘制标准曲线。下测消光值，绘制标准曲线。箩瓷统谅鞍秘胖受浴丹吐暗鲜貉牛抿遍贤你蓄雨明傲摘究摆郊奴梭杉狰旋蛋白质和氨基酸的测定蛋
116、白质和氨基酸的测定（2）样品测定：）样品测定：取样品取样品5.0010.0g（液体样（液体样5-10ml）于烧杯中于烧杯中加加50ml水和活性碳水和活性碳约约5g加热过滤加热过滤用用3040ml热水洗涤热水洗涤活性炭活性炭吸澄清样液吸澄清样液14ml加茚三酮和加茚三酮和缓冲液各缓冲液各1ml水浴加热水浴加热15分钟，冷却定容，分钟，冷却定容，静置静置15分钟于分钟于570nm下测定消光值，按下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。下式计算氨基酸含量。禽钠霸号秀嘎参擞实捆拓恿掖芽述证法各昌疚绥灰涧丧懦膜闭漫伪彭跳迢蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定氨基酸含量（毫克氨基酸含量（毫克氨基酸含量（毫
117、克氨基酸含量（毫克/100/100克）克）克）克）=C100/=C100/（m1000m1000） CC从标准曲线上查得得氨基酸的量（从标准曲线上查得得氨基酸的量（从标准曲线上查得得氨基酸的量（从标准曲线上查得得氨基酸的量（ g g）mm测定得样品溶液相当于样品的量（测定得样品溶液相当于样品的量（测定得样品溶液相当于样品的量（测定得样品溶液相当于样品的量（g g）注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方
118、被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：取法如下：取法如下：取法如下：取10g10g茚三酮容于茚三酮容于茚三酮容于茚三酮容于40ml40ml热水中，加一克热水中，加一克热水中，加一克热水中，加一克活性炭，摇匀静置活性炭，摇匀静置活性炭，摇匀静置活性炭，摇匀静置3030分钟，过滤，将滤液放入冰分钟，过滤，将滤液放入冰分钟，过滤，将滤液放入冰分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml
119、2ml冷水冷水冷水冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。僳砰铣党附儿莹杆卯兜绑喷贯羡残愈窒古胁蒋缝坤地官什须呜朱酬农姥粹蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第五节第五节 氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法一薄层色谱法一薄层色谱法一薄层色谱法薄层层析法（薄层层析法（薄层层析法（薄层层析法（TLC TLC TLC TLC 法）法）法）法）Thin Layer ChromatographyThin Layer ChromatographyThin Layer Chroma
120、tographyThin Layer Chromatography简介：简介：简介：简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析近年来发展起来的一种微量而快速的层析近年来发展起来的一种微量而快速的层析近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的溶
121、剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。碾晴梗呐归垮
122、畏扶叶耽睫些佣鞘矮卡指竭剪磨涨鞘骏浊语陶炮橡窒隐哩粳蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（一）原理：（一）原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不值，不同成分则有不同的同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，的。然
123、后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。大致确定其含量。 行惕澜殴印茸烷摩吗脚辅遣惕宏警哺粱重旦惟边马誊久起扣娠炬沼鞭辩渝蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n nR R R Rf f f f = a / b = a / b = a / b = a / bab样点样点溶剂前沿溶剂前沿点样原点点样原点抚悟赢俏街晴缘氮承奴阳湍掀泣峻沮逃镀惫忽鹃腰谐圃可描纬道狡澄芹蠢蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n n优点：优点：优点：优点： 展开时间短，一般在展开时间短，一般在展开时间短，一般在展开
124、时间短，一般在2030203020302030分钟，展开距离分钟，展开距离分钟，展开距离分钟，展开距离通常只需通常只需通常只需通常只需10 cm10 cm10 cm10 cm，且分离效果好。，且分离效果好。，且分离效果好。，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。层析后得到的斑点小而清晰。层析后得到的斑点小而清晰。层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。能够使用多种显色剂。能够使用多种显色剂。能够使用多种显色剂。 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高点样量少，灵敏度高。（比纸层析高点样量少，灵敏度高。（比纸层析高点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10100101001010010100倍）
125、倍）倍）倍） 精确到精确到精确到精确到0.01ug0.01ug0.01ug0.01ug。 也可用于大量分离也可用于大量分离也可用于大量分离也可用于大量分离500 mg500 mg500 mg500 mg，作为样品制备，作为样品制备，作为样品制备，作为样品制备层析。层析。层析。层析。n n缺点：缺点：缺点：缺点：R R R Rf f f f值重现性比纸上层析差。值重现性比纸上层析差。值重现性比纸上层析差。值重现性比纸上层析差。n n分分分分类类类类：按按按按层层层层析析析析的的的的原原原原理理理理可可可可分分分分为为为为：吸吸吸吸附附附附、分分分分配配配配、离子交换、凝胶等。离子交换、凝胶等。离
126、子交换、凝胶等。离子交换、凝胶等。彰堤续月彻居乳茅眶感嗡融远寿勃被捂永闽戚眨排庙蛋产函排治窝胖嚎箭蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（三）操作方法：（三）操作方法： 薄层板制备：薄层板制备：p111 样品液制备样品液制备 点样：距薄板底端点样：距薄板底端2cm2cm处，用针画一标处，用针画一标记作为原点。再以点样距扳子宽窄可点几记作为原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时个点同时 展开，点与点之间间隔展开，点与点之间间隔1 12cm2cm。 可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一个点干了再点另一个点。射器。注意要等一个点干了再点另一个点。伏迸辨诧
127、馆围茶曝眩区内蜒匡草逢藉氏巷侗妮据怒哩恢邢烧安凶笛壮是仕蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 展展展展开开开开：点点点点样样样样完完完完了了了了，放放放放入入入入密密密密闭闭闭闭容容容容器器器器中中中中（展展展展开开开开槽槽槽槽），倾倾倾倾斜斜斜斜一一一一定定定定角角角角度度度度1010101030303030，下下下下端端端端浸浸浸浸入入入入展展展展开开开开剂剂剂剂1cm1cm1cm1cm，千千千千万万万万别别别别让让让让溶溶溶溶剂剂剂剂浸浸浸浸过过过过了了了了样样样样点点点点。到到到到离离离离顶顶顶顶端端端端一部分，取出样板、晾干、显色。一部分，取出样板、晾干、显色。一部分，取出样板、
128、晾干、显色。一部分，取出样板、晾干、显色。a.a.展展开开剂剂的的有有关关情情况况：主主要要是是低低沸沸点点的的2 23 3种种有有机机溶溶剂剂组组成成的的溶溶剂剂系系统统，分分离离效效果果主主要要决决定定于于展展开开剂剂的的选选择择，因因为为吸吸附附剂剂在在一一定定情情况况下下是是恒恒定定的的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。迹乐租类柠企炽辰菩锈甸掏蚀剔芳做专腥算签颤宝鳃蒙玲砂躯加鉴娱遍枚蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定b.b.展开剂的选择方法：展开剂的选择方法：样样品品极极性性小小，选选吸吸附附剂剂活活性性高高，展展开开剂剂极极性性低的。低
129、的。样样品品极极性性大大，选选吸吸附附剂剂活活性性低低，展展开开剂剂极极性性高。高。 n n有机溶剂极性由小到大为：有机溶剂极性由小到大为： 石石油油醚醚、环环己己烷烷、四四氯氯化化碳碳、三三氯氯乙乙烷烷、甲甲苯苯、苯苯、二二氯氯甲甲烷烷、氯氯仿仿、乙乙醚醚、乙乙酸酸乙乙酯酯、丙丙酮酮、正正丙丙醇醇、乙乙醇醇、甲甲醇醇、水水、吡啶、有机酸类等。吡啶、有机酸类等。字印愚绅枣劝娃唁毯赶身荆位寸蓄布庙常蚕抨察厚江修潮茶啤潜柜冠鹏报蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定c.c.c.c.展开的方式：展开的方式：展开的方式：展开的方式：上上上上行行行行法法法法、下下下下行行行行法法法法、双双双双向向向向
130、展展展展开开开开、单单单单向向向向多多多多次次次次展展展展开开开开、双双双双向多次展开。向多次展开。向多次展开。向多次展开。双向展开：双向展开：双向展开：双向展开：顶挨售啸妥患铆乘耸怔敖塑棍作添甘斥煞卡监坷疙走挪颧翌蔽烛九湘绅仅蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 显色：显色：显色：显色：a.a.a.a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。b.b.b.b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。喷
131、有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。c.c.c.c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。 （涂板时把（涂板时把（涂板时把（涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）荧光指示剂加入到固体吸附剂中）荧光指示剂加入到固体吸附剂中）荧光指示剂加入到固体吸附剂中）丝锁穷实蜕琉蒲塑锰受渭屯滚写壶贡伪贰硫补酿杯奇茹敦胆钙寄堑锑八针蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定定定定定性性性性：在在在在同同同同一一一一块块块块板板板板上上上上，同同同同等等等等条条条条件件件件下下下下操操
132、操操作作作作，被被被被测测测测样样样样与标准样同时展开、显色，同与标准样同时展开、显色，同与标准样同时展开、显色，同与标准样同时展开、显色，同 R R R Rf f f f 值即是；值即是；值即是；值即是； 查手册找相同的查手册找相同的查手册找相同的查手册找相同的 R R R Rf f f f 值。值。值。值。定定定定量量量量：a.a.a.a.目目目目视视视视定定定定量量量量法法法法：以以以以标标标标准准准准斑斑斑斑点点点点对对对对照照照照，相相相相当当当当于于于于样品斑点中含量样品斑点中含量样品斑点中含量样品斑点中含量ugugugug数。数。数。数。 b. b. b. b.斑点面积定量法。斑
133、点面积定量法。斑点面积定量法。斑点面积定量法。 c. c. c. c.将样点取下来，定容，离心，比色。将样点取下来，定容，离心，比色。将样点取下来，定容，离心，比色。将样点取下来，定容，离心，比色。 d. d. d. d.利用薄层色谱扫描仪：利用薄层色谱扫描仪：利用薄层色谱扫描仪：利用薄层色谱扫描仪： 例：日本岛津例：日本岛津例：日本岛津例：日本岛津 CS910 CS910 CS910 CS910 型双波长薄型双波长薄型双波长薄型双波长薄 层色谱扫描仪层色谱扫描仪层色谱扫描仪层色谱扫描仪 泛材结汾壳戴黑晕哗侧邪帜译蓝镀恭佣占史就垦隧黄待坏盔亢注尖脑蝴窿蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第
134、十章的重点第十章的重点1. 1.凯氏定氮法原理、测定方法。凯氏定氮法原理、测定方法。凯氏定氮法原理、测定方法。凯氏定氮法原理、测定方法。2. 2.硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？3. 3.双缩脲法测定原理。双缩脲法测定原理。双缩脲法测定原理。双缩脲法测定原理。4. 4.氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。5. 5.TLCTLC法原理、方法，法原理、方法，法原理、方法，法原理、方法，R Rf f值的作用及计算方法。值的作用及计算方法。值的作用及计算方
135、法。值的作用及计算方法。捅伏昏绵淫魁悸办旗贤盔棕鹊遏掠湘澳习愚伍甜丢肺饲跺辊蹈烹氛晶蓉咐蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n拿破仑的罪行一书中的记载，二氧化硫在19世纪早期被一些在海地的君主当作一种毒药来镇压奴隶的反抗。n易被湿润的粘膜表面吸收生成亚硫酸、硫酸。对眼及呼吸道粘膜有强烈的刺激作用。大量吸入可引起肺水肿、喉水肿、声带痉挛而致窒息。急性中毒：轻度中毒时，发生流泪、畏光、咳嗽，咽、喉灼痛等；严重中毒可在数小时内发生肺水肿；极高浓度吸入可引起反射性声门痉挛而致窒息。皮肤或眼接触发生炎症或灼伤。慢性影响：长期低浓度接触，可有头痛、头昏、乏力等全身症状以及慢性鼻炎、咽喉炎、支气管炎、嗅
136、觉及味觉减退等。少数工人有牙齿酸蚀症。环境危害：对大气可造成严重污染。眼曾瞩顷悠喳疤厚肘弗督寒陷目驶路萄霍唱降社资迁鹤斩钳咀酚捐稻亢促蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定n三氧化硫其毒性表现与硫酸同。对皮肤、粘膜等组织有强烈的刺激和腐蚀作用。可引起结膜炎、水肿。角膜混浊，以致失明；引起呼吸道刺激症状，重者发生呼吸困难和肺水肿；高浓度引起喉痉挛或声门水肿而死亡。口服后引起消化道的烧伤以至溃疡形成。严重者可能有胃穿孔、腹膜炎、喉痉挛和声门水肿、肾损害、休克等。慢性影响有牙齿酸蚀症、慢性支气管炎、肺气肿和肝硬变等。环境危害：对环境有危害，对大气可造成污染。赃合赌悟峻榔诫沏盔可丝蝇借趴症衙擅坯殃勒洛夏逢钢飞仗俞再檄镀宜月蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定
