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1、重重组人白介素人白介素-18(rhIL-18)基因基因工程菌的构建工程菌的构建分子生物学分子生物学分子生物学分子生物学实验实验- -实验实验操作操作操作操作基因、载体、受体菌株基因、载体、受体菌株基因基因载体载体菌株菌株质粒质粒酶切衔接酶切衔接转化转化质粒提取质粒提取PCRPCR实验实验技技技技术术要求要求要求要求v应掌握的实验技术应掌握的实验技术v酶切酶切,衔接衔接v凝胶回收凝胶回收v制备感受态细胞制备感受态细胞v质粒提取质粒提取vPCRv琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳v调查目的调查目的v电泳电泳v电泳电泳v感受态细胞转化率感受态细胞转化率v电泳电泳v电泳电泳v电泳电泳实验实验流程流程流程流程
2、: :第一天第一天第一天第一天rhIL-18rhIL-18基因的基因的PCRPCR产物产物质粒质粒pUC18pUC18BglBgl和和PstPst双双酶酶切切BamHBamH和和PstPst双双酶酶切切浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳凝胶回收凝胶回收配制配制 LB LB 液体与固体平板培育基液体与固体平板培育基灭菌灭菌实验实验流程流程流程流程: :第二天第二天第二天第二天凝胶回收与溶液回收凝胶回收与溶液回收电泳检验电泳检验T4T4衔接酶衔接过夜衔接酶衔接过夜E .coli DH5E .coli DH5菌株菌株 37 37过过夜培育夜培育实验实验流程流程流程流程: :第三天第三天第三
3、天第三天提取质粒提取质粒DNADNA浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳实验实验流程流程流程流程: :第四天第四天第四天第四天PCRPCR浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳双双双双酶酶切反响切反响切反响切反响20L20L体系体系体系体系vrhIL-18的PCR产物vPCR产物10LvBufferO2Lv无菌水7LvBgl0.5LvPst0.5Lv质粒pUC18v质粒10LvBamHBuffer2Lv无菌水6.7LvBamH0.3LvPst1L37酶切反响3小时。Hybridsite培育基配制培育基配制培育基配制培育基配制vLB液体培育基v每1L配量：v蛋白胨 10gv酵母提取
4、物 5gv氯化钠 5gv调理pH到7.0vLB固体培育基:v每100ml液体培育基添加1.5g琼脂v每组预备：v1个30ml 液体培育基灭菌灭菌v1个30ml LB 液体培育基v微量移液器枪头200uL琼琼脂糖脂糖脂糖脂糖电电泳泳泳泳v琼脂糖凝胶电泳是分别鉴定和纯化DNA片段的规范方法。vDNA的分子大小v琼脂糖浓度vDNA分子的构象v电源电压v嵌入染料的存在v离子强度影响琼琼脂糖凝胶回收脂糖凝胶回收脂糖凝胶回收脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：运用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒分别对：目的基因片段0.5Kb片段溶液回收载体片段2.7Kb片段进展凝胶回收1.经过琼脂糖凝胶电泳将目
5、的DNA片段与其他片段尽能够分开，然后用干净的手术刀切下含需回收DNA的琼脂块，放入Ep管。2.按300L/100mg3:1的比例参与BindingBuffer，置于50-60水浴中10min，使凝胶彻底融化。期间，每2min混匀一次。3.将融化的溶胶液转移到套在2-ml搜集管的UNIQ-10柱中，室温放置2min。12000rpm室温离心1min。4.取下UNIQ-10柱，倒掉搜集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个搜集管中，参与500LWashSolution，12000rpm室温离心1min。5.反复步骤4一次。琼琼脂糖凝胶回收脂糖凝胶回收脂糖凝胶回收脂糖凝胶回收6.取下UNIQ-1
6、0柱，倒掉搜集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个搜集管中，12000rpm室温离心2min。7.将UNIQ-10柱放入一根新的Ep管中，在柱子膜中央加30LElutionBuffer，60放置5min。8.12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。从溶液中回收DNA：根据溶液的体积，参与3倍体积的BindingBuffer混匀。以下操作参照琼脂糖凝胶中回收DNA步骤3-8.计算基因与载体片段比例计算基因与载体片段比例v紫外下察看基因与紫外下察看基因与载体片段的亮度体片段的亮度v基因的摩基因的摩尔数数基因片段亮度基因片段亮度/碱基数碱基数495bpv载体的摩体的
7、摩尔数数载体片段亮度体片段亮度/碱基数碱基数2700bpv基因摩基因摩尔数数/载体摩体摩尔数数 最正确比例是最正确比例是3：1衔衔接反响接反响接反响接反响在在灭菌的菌的0.2mL离心管离心管PCR管中管中进展展20L体体积反响体系中：反响体系中：10快速快速衔接接缓冲液冲液2LrhIL-18双双酶切切产物物XL质粒粒pUC18双双酶切切产物物YLT4-DNA衔接接酶1L201h，4过夜夜感受感受态菌的制菌的制备1E.coliDH5菌菌株株37过夜夜培培育育以以复复苏菌菌种种，取取过夜夜培培育育的的菌菌液液0.3mL参参与与到到30mLLB培培育育基基中中，37，230r/min振振荡培培育育3
8、h，至至OD600约为0.4左右。左右。2无无菌菌条条件件下下，将将50mL菌菌液液转移移至至离离心心管管中中，冰冰上上放放置置10min，使培育物冷却至使培育物冷却至0。3在在预冷冷4的的离离心心机机上上以以4000r/min离离心心10min，弃弃去去上上清清，参参与与30mL预冷的冷的0.1mol/LCaCl2溶液重溶液重悬沉淀，冰浴上放置沉淀，冰浴上放置10min。4以以4000r/min在在4离离心心10min，弃弃去去上上清清，每每30mL初初始始培培育育物物用用1.0mL预冷的冷的0.1mol/LCaCl2溶液重溶液重悬细胞沉淀，胞沉淀，200L/管分装。管分装。pUC18-hI
9、L-18pUC18-hIL-18重重组质组质粒的粒的转转化化1向分装有向分装有200LE.coliDH5菌株感受菌株感受态细胞的胞的EP管中管中参与参与10L的上步中得到的的上步中得到的衔接混合物，悄然旋接混合物，悄然旋转以混合内以混合内容物，冰浴上放置容物，冰浴上放置30min。2将将该EP管放入管放入预加温至加温至42的水浴中，放置的水浴中，放置90s，快速，快速转移到冰浴中，使移到冰浴中，使细胞冷却胞冷却12min。3向向EP管参与管参与800LLB培育基，培育基，转移至移至37摇床上，床上，150r/min，温育，温育45min以复以复苏菌株。菌株。4将将200L上述培育物加到含上述培
10、育物加到含100g/mL氨卞青霉氨卞青霉素的素的LB平板上，以玻璃涂布棒悄然地将平板上，以玻璃涂布棒悄然地将转化化细胞胞平平铺于于琼脂平板外表。脂平板外表。5将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，皿，37过夜培育，挑夜培育，挑选鉴定。定。UNIQ-10UNIQ-10柱式柱式质质粒小量抽提粒小量抽提1将过夜培育的12ml细菌12,000rpm离心1min，彻底去除上清。2参与250lSolutionI，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。3参与250lSolutionII，立刻温暖混匀倾斜45度角，顺一个方向，渐渐旋转离心管，使细菌裂解，室温放置2分钟。4参
11、与350lSolutionIII，立刻上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置5分钟。512,000rpm，离心10分钟。6将步骤5中上清转移到套放于2.0ml搜集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min后，8,000rpm室温离心1min。7弃搜集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支搜集管中，汲取500lWashSolution到UNIQ-10柱，10,000rpm室温离心1min。8反复步骤7。9弃搜集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支搜集管中，12,000rpm室温离心2min以彻底去除WashSolution。10将UNIQ-10柱放入新的干净1.5ml离心管中，加30lE
12、lutionBuffer，60放置10min后，10,000rpm室温离心1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。PCRPCR鉴鉴定阳性克隆原理定阳性克隆原理PCRPCR鉴鉴定定1、调调整模板整模板 待待鉴鉴定定质质粒粒 浓浓度至度至5ng/L2、按以下体系配制反响混合液，混匀，、按以下体系配制反响混合液，混匀，TemplateDNA1.0L10PCRbuffer2.0LMgCl2 25mmol/L 1.5LM13PrimerM4(10mol/L)0.5LM13PrimerRV(10mol/L)0.5LdNTPs 2mmol/L 2.0LTaq酶酶 5U/L 0.5L加加ddH2O至至20L外源基因的特异引物：外源基因的特异引物：引物引物M13PrimerM4:5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3引物引物M13PrimerRV:5-CAGGAAACAGCTAAC-33PCR反响循环条件设置94变性反响30s；45退火反响30s；72延伸反响30s。进展20个循环后，最后一个循环72延伸至10min。4、检测加0.6L6LoadingBuffer和3L反响产物，混匀，点样电泳。5、成像分析在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳0.51h，电泳终了凝胶成像分析结果。
